摘 要：细胞自噬与植物生长、发育和逆境响应等过程密切相关。本研究构建了小麦重要自噬相关基因TaATG4a和TaATG8h的原核表达载体并导入大肠杆菌。IPTG诱导表达后的蛋白质SDS-PAGE电泳结果表明，两个基因在大肠杆菌中均能够高效表达，表达重组蛋白的分子量与预测分子量基本一致。利用Ni柱亲和层析方法进一步获得了纯度较高的重组蛋白，为今后的体外酶活分析、抗体制备和Western杂交等研究奠定了基础。 关键词：细胞自噬；小麦；ATG4；ATG8；原核表达 中图分类号：S512.1 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.05.004 胞自噬（Cell autophagy）是广泛存在于真核细胞中的一种溶酶体（酵母、植物为液泡）依赖性降解途径，用于净化自身多余或受损细胞结构和大分子、促进生物大分子循环利用[1]。细胞自噬过程中，首先是批量细胞质成分或细胞器被双层膜结构包围，形成自噬小体（Autophagosome），随后自噬小体外膜与溶酶体膜融合，将内膜及包围物质（自噬小泡，Autophagic body）送入溶酶体腔进行消化[2]。ATG4和ATG8是两个重要自噬相关基因（Autophagy-related gene， ATG）。ATG8蛋白前体的C端经具有半胱氨酸蛋白酶活性的ATG4酶切后暴露出保守的甘氨酸残基。此后，ATG8经一个类泛素结合系统与脂类物质磷脂酰乙醇胺（PE）相连形成ATG8-PE。ATG8-PE定位于自噬膜上，对于自噬膜的装配、延伸、合拢及与液泡的融合过程都具有重要意义。ATG4对ATG8的酶切加工是ATG8进入类泛素连接系统的前提。ATG4又能从ATG8-PE和自噬膜上释放ATG8，ATG8从自噬膜上的释放是促进自噬小体成熟并成为可融合形式的重要环节。细胞自噬在进化过程中高度保守。植物上，拟南芥基因组分析发现了36个ATG基因[3]，烟草[4]、水稻[5]、玉米[6]、大豆[7]和小麦[8]等作物上ATG基因的鉴定和分析也相继被报道。拟南芥上的研究表明，ATG4和ATG8在植物细胞自噬中同样扮演了与酵母类似的重要角色[9-10]。 细胞自噬与植物生长、发育及响应多种生物、非生物胁迫，包括营养缺乏、氧胁迫、盐胁迫、干旱胁迫和病原侵染等的反应过程密切相关[11]。到目前为止，有关细胞自噬的分子机理和生理功能研究仍然仅限于拟南芥等模式物种上，在重要农作物尤其是小麦上的报道很少。本研究在前期成功克隆多个小麦重要ATG基因的基础上，构建了ATG4和ATG8基因的原核表达载体，经大肠杆菌诱导表达和重组蛋白纯化过程获得了小麦ATG4和ATG8的纯化重组蛋白，可为下一步体外酶活测定、抗体的制备和Western杂交等试验奠定基础。 1 材料和方法 1.1 基因和载体 小麦自噬相关基因TaATG4a和TaATG8h由本实验室（天津市动植物抗性重点实验室）克隆。两个基因全长cDNA分别克隆于pGEM-Teasy载体上。原核表达载体pET30a由本实验室保存。 1.2 原核表达载体的构建 设计合成两端添加NotⅠ识别位点的PCR引物对4aNOTI-F （ATAAGAATGCGGCCGCATGACGAGCTTGCCTGAGAG）/4aNOTI-R （ATAAGAATGCGGC CGCTCAGAGAATCTGCCACTCAT） 和8hNOTI-F（ATAAGAATGCGGCCGCATGAAGTCC TTCAAGAAGGA）/8hNOTI-R（ATAAGAATGCGGCCGCTCACCCAAATGTCTTCTCGC），使用pfu DNA聚合酶从pGEM-Teasy载体上分别扩增TaATG4a和TaATG8h基因的全长ORF。扩增产物NotⅠ-NotⅠ片段经酶切、连接过程克隆到原核表达载体pET30a的NotⅠ位点处，测序鉴定正确插入方向（起始密码子ATG紧邻T7启动子）的重组表达载体pET-ATG4a和pET-ATG8h。采用热激法将表达载体导入到大肠杆菌BL21（DE3）中。 1.3 原核表达 接种含重组载体质粒的大肠杆菌BL21（DE3）到LBK液体培养基中（含50 mg・L-1卡那霉素），37 ℃振荡培养过夜。按1%的比例扩大到5 mL LBK液体培养基中（卡那霉素 50 mg・L-1），37 ℃振荡培养至OD600达到0.6～0.8。加入终浓度为1 mmol・L-1的IPTG，于28 ℃条件下震荡培养诱导目标基因的表达。分别于诱导后0，2，4，6，8 h取1 mL菌液用于总蛋白的SDS-PAGE电泳分析。 1.4 SDS-PAGE电泳 将1 mL菌液10 000 r・min-1离心10 min，弃上清后加入80 μL的ddH2O重悬沉淀，再加入20 μL电泳上样缓冲液（5X）并混匀，沸水浴10 min。12 000 r・min-1离心5 min，取上清用SDS-PAGE凝胶电泳（13%分离胶，4%浓缩胶）分离蛋白。电泳后用考马斯亮蓝（R-250）染色液染色1 h，脱色液脱色至背景无色后观察并拍照。 1.5 重组蛋白的纯化 重组蛋白为N端含组氨酸标签His（6）的His（6）-TaATG4a或His（6）-TaATG8h，因此使用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒（康为世纪），在非变性条件下经 Ni 柱亲和层析过程纯化重组蛋白。层析柱的平衡、菌体的超声波破碎和可溶性蛋白的上样及杂蛋白的清洗等过程参照试剂盒手册进行。分别使用5 mL含50，100，200，300和500 mmol・L-1 咪唑的洗脱液分段洗脱目标蛋白。收集各阶段的洗脱液进行SDS-PAGE（13%分离胶，4%浓缩胶）电泳和考马斯亮蓝（R-250）染色、脱色分析。纯化的蛋白质溶液（洗脱液）-80 ℃冰箱保存。
摘 要：细胞自噬与植物生长、发育和逆境响应等过程密切相关。本研究构建了小麦重要自噬相关基因TaATG4a和TaATG8h的原核表达载体并导入大肠杆菌。IPTG诱导表达后的蛋白质SDS-PAGE电泳结果表明，两个基因在大肠杆菌中均能够高效表达，表达重组蛋白的分子量与预测分子量基本一致。利用Ni柱亲和层析方法进一步获得了纯度较高的重组蛋白，为今后的体外酶活分析、抗体制备和Western杂交等研究奠定了基础。 关键词：细胞自噬；小麦；ATG4；ATG8；原核表达 中图分类号：S512.1 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.05.004 胞自噬（Cell autophagy）是广泛存在于真核细胞中的一种溶酶体（酵母、植物为液泡）依赖性降解途径，用于净化自身多余或受损细胞结构和大分子、促进生物大分子循环利用[1]。细胞自噬过程中，首先是批量细胞质成分或细胞器被双层膜结构包围，形成自噬小体（Autophagosome），随后自噬小体外膜与溶酶体膜融合，将内膜及包围物质（自噬小泡，Autophagic body）送入溶酶体腔进行消化[2]。ATG4和ATG8是两个重要自噬相关基因（Autophagy-related gene， ATG）。ATG8蛋白前体的C端经具有半胱氨酸蛋白酶活性的ATG4酶切后暴露出保守的甘氨酸残基。此后，ATG8经一个类泛素结合系统与脂类物质磷脂酰乙醇胺（PE）相连形成ATG8-PE。ATG8-PE定位于自噬膜上，对于自噬膜的装配、延伸、合拢及与液泡的融合过程都具有重要意义。ATG4对ATG8的酶切加工是ATG8进入类泛素连接系统的前提。ATG4又能从ATG8-PE和自噬膜上释放ATG8，ATG8从自噬膜上的释放是促进自噬小体成熟并成为可融合形式的重要环节。细胞自噬在进化过程中高度保守。植物上，拟南芥基因组分析发现了36个ATG基因[3]，烟草[4]、水稻[5]、玉米[6]、大豆[7]和小麦[8]等作物上ATG基因的鉴定和分析也相继被报道。拟南芥上的研究表明，ATG4和ATG8在植物细胞自噬中同样扮演了与酵母类似的重要角色[9-10]。 细胞自噬与植物生长、发育及响应多种生物、非生物胁迫，包括营养缺乏、氧胁迫、盐胁迫、干旱胁迫和病原侵染等的反应过程密切相关[11]。到目前为止，有关细胞自噬的分子机理和生理功能研究仍然仅限于拟南芥等模式物种上，在重要农作物尤其是小麦上的报道很少。本研究在前期成功克隆多个小麦重要ATG基因的基础上，构建了ATG4和ATG8基因的原核表达载体，经大肠杆菌诱导表达和重组蛋白纯化过程获得了小麦ATG4和ATG8的纯化重组蛋白，可为下一步体外酶活测定、抗体的制备和Western杂交等试验奠定基础。 1 材料和方法 1.1 基因和载体 小麦自噬相关基因TaATG4a和TaATG8h由本实验室（天津市动植物抗性重点实验室）克隆。两个基因全长cDNA分别克隆于pGEM-Teasy载体上。原核表达载体pET30a由本实验室保存。 1.2 原核表达载体的构建 设计合成两端添加NotⅠ识别位点的PCR引物对4aNOTI-F （ATAAGAATGCGGCCGCATGACGAGCTTGCCTGAGAG）/4aNOTI-R （ATAAGAATGCGGC CGCTCAGAGAATCTGCCACTCAT） 和8hNOTI-F（ATAAGAATGCGGCCGCATGAAGTCC TTCAAGAAGGA）/8hNOTI-R（ATAAGAATGCGGCCGCTCACCCAAATGTCTTCTCGC），使用pfu DNA聚合酶从pGEM-Teasy载体上分别扩增TaATG4a和TaATG8h基因的全长ORF。扩增产物NotⅠ-NotⅠ片段经酶切、连接过程克隆到原核表达载体pET30a的NotⅠ位点处，测序鉴定正确插入方向（起始密码子ATG紧邻T7启动子）的重组表达载体pET-ATG4a和pET-ATG8h。采用热激法将表达载体导入到大肠杆菌BL21（DE3）中。 1.3 原核表达 接种含重组载体质粒的大肠杆菌BL21（DE3）到LBK液体培养基中（含50 mg・L-1卡那霉素），37 ℃振荡培养过夜。按1%的比例扩大到5 mL LBK液体培养基中（卡那霉素 50 mg・L-1），37 ℃振荡培养至OD600达到0.6～0.8。加入终浓度为1 mmol・L-1的IPTG，于28 ℃条件下震荡培养诱导目标基因的表达。分别于诱导后0，2，4，6，8 h取1 mL菌液用于总蛋白的SDS-PAGE电泳分析。 1.4 SDS-PAGE电泳 将1 mL菌液10 000 r・min-1离心10 min，弃上清后加入80 μL的ddH2O重悬沉淀，再加入20 μL电泳上样缓冲液（5X）并混匀，沸水浴10 min。12 000 r・min-1离心5 min，取上清用SDS-PAGE凝胶电泳（13%分离胶，4%浓缩胶）分离蛋白。电泳后用考马斯亮蓝（R-250）染色液染色1 h，脱色液脱色至背景无色后观察并拍照。 1.5 重组蛋白的纯化 重组蛋白为N端含组氨酸标签His（6）的His（6）-TaATG4a或His（6）-TaATG8h，因此使用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒（康为世纪），在非变性条件下经 Ni 柱亲和层析过程纯化重组蛋白。层析柱的平衡、菌体的超声波破碎和可溶性蛋白的上样及杂蛋白的清洗等过程参照试剂盒手册进行。分别使用5 mL含50，100，200，300和500 mmol・L-1 咪唑的洗脱液分段洗脱目标蛋白。收集各阶段的洗脱液进行SDS-PAGE（13%分离胶，4%浓缩胶）电泳和考马斯亮蓝（R-250）染色、脱色分析。纯化的蛋白质溶液（洗脱液）-80 ℃冰箱保存。