（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。
（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2～3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用2000r/min离心沉淀15 min 后，再除去上清液。
（4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。
（5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。
（二）透析法
荧光素如FITC 分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。
（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。
（2）浸入0.02mol/pH
7.1～7.4的PBS 中（悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS 内），在4℃中透析，每日更换3～4次PBS ，约5～7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法
除游离荧光素可用2×46cm 柱层析法，详细方法参阅第二章。加入荧光抗体15～18ml （按床体积的5%～10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS 少许，关闭下口，停留30～40min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。
若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现SO4++（用1%BaCl2检查发生白色沉淀）。最后是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用。
如仅用小量荧光抗体，可用1×20cm 的柱层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2～3.5ml 荧光抗体。
（四）DEAE 纤维素柱层析法
标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下： DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯IgG 方法相同。装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20～50mg 标记蛋白量为宜
。常用梯度洗脱法如下：
（1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB 平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB 洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液，
分别洗脱和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS （0.05mol/L NaCl ）……洗脱部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS （0.01mol/L NaCl ）……洗脱部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS （0.02mol/L NaCl ）……洗脱部分3。
将此三部分收集液（每管5ml ）分别测定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB 洗脱液280nm 光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。其他两部分可以废弃。
（2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加NaCl 的浓度至
2.0mol/L洗脱完。
经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。
（五）荧光抗体稀释法
先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。
（六）纯化抗原法
用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。近代免疫化学技术（免疫吸收法）和柱层析法等提供了很大的可能性，可参考有关专著。
（七）纯化抗体法---免疫吸收法
例如抗IgA 血清的纯化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA （ SIgA ）抗原纯度不高，所制的抗血清常与IgG 呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人IgG 戊二醛聚合物加以吸收纯化。方法如下：
1．人IgG 聚合物的制备 在5ml 含40mg/ml人IgG 的0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml ，边加边搅，5min 即出现混浊，逐现大块胶块，放置30min 后，用研钵将凝胶磨细，继用1.0mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液反复洗涤3次，末次加蒸馏水至20ml ，即为人IgG 聚合物悬液。
2．免疫吸收法 将待吸收的抗SIgG 血清加入待量IgG 聚合物悬液，置室温搅拌60min, 离心沉淀，上清液即稀释1倍的纯化抗SIgA 血清。如用IgG 聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
（八）伊文氏蓝（Evans blue ）衬染法
用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/L pH7.2PBS 稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文氏蓝一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以
和然释荧光抗体。
此外，还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。
参考文献
1．Coons AH, et al. Localization of antigen in tissue cell. II. Improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent a n －tibody. J Exp Med, 1950;91:1-3
2.Riggs JL, Seiwald RI, Burckhulter J, Powns CM and Metcalf TG . Iosthiocyanate compounds as fluorescent labeling agents for immune serum.
（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。
（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2～3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用2000r/min离心沉淀15 min 后，再除去上清液。
（4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。
（5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。
（二）透析法
荧光素如FITC 分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。
（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。
（2）浸入0.02mol/pH
7.1～7.4的PBS 中（悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS 内），在4℃中透析，每日更换3～4次PBS ，约5～7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法
除游离荧光素可用2×46cm 柱层析法，详细方法参阅第二章。加入荧光抗体15～18ml （按床体积的5%～10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS 少许，关闭下口，停留30～40min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。
若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现SO4++（用1%BaCl2检查发生白色沉淀）。最后是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用。
如仅用小量荧光抗体，可用1×20cm 的柱层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2～3.5ml 荧光抗体。
（四）DEAE 纤维素柱层析法
标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下： DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯IgG 方法相同。装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20～50mg 标记蛋白量为宜
。常用梯度洗脱法如下：
（1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB 平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB 洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液，
分别洗脱和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS （0.05mol/L NaCl ）……洗脱部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS （0.01mol/L NaCl ）……洗脱部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS （0.02mol/L NaCl ）……洗脱部分3。
将此三部分收集液（每管5ml ）分别测定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB 洗脱液280nm 光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。其他两部分可以废弃。
（2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加NaCl 的浓度至
2.0mol/L洗脱完。
经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。
（五）荧光抗体稀释法
先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。
（六）纯化抗原法
用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。近代免疫化学技术（免疫吸收法）和柱层析法等提供了很大的可能性，可参考有关专著。
（七）纯化抗体法---免疫吸收法
例如抗IgA 血清的纯化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA （ SIgA ）抗原纯度不高，所制的抗血清常与IgG 呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人IgG 戊二醛聚合物加以吸收纯化。方法如下：
1．人IgG 聚合物的制备 在5ml 含40mg/ml人IgG 的0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml ，边加边搅，5min 即出现混浊，逐现大块胶块，放置30min 后，用研钵将凝胶磨细，继用1.0mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液反复洗涤3次，末次加蒸馏水至20ml ，即为人IgG 聚合物悬液。
2．免疫吸收法 将待吸收的抗SIgG 血清加入待量IgG 聚合物悬液，置室温搅拌60min, 离心沉淀，上清液即稀释1倍的纯化抗SIgA 血清。如用IgG 聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
（八）伊文氏蓝（Evans blue ）衬染法
用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/L pH7.2PBS 稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文氏蓝一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以
和然释荧光抗体。
此外，还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。
参考文献
1．Coons AH, et al. Localization of antigen in tissue cell. II. Improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent a n －tibody. J Exp Med, 1950;91:1-3
2.Riggs JL, Seiwald RI, Burckhulter J, Powns CM and Metcalf TG . Iosthiocyanate compounds as fluorescent labeling agents for immune serum.