猪DIO3基因组织表达谱及印记分析
摘要：采用荧光定量PCR方法分析了猪DIO3基因在组织中的表达状况。结果表明，DIO3基因主要表达于背部脂肪组织，在肝脏、子宫、肾脏、心脏、小肠、肌肉和胃组织中呈中度表达，在脾脏和肺脏中表达量很低。采用外显子687 bp处的A/C突变（A/C 687）检测该基因在猪胚胎组织中的印记状态，DIO3基因在所有组织中均表现为印记。
关键词：猪；DIO3基因；组织表达谱；印记分析
Expression and Imprinting Analysis of Porcine DIO3 Gene
Abstract： Real-time RT-PCR was performed to analyze the porcine DIO3 gene tissue expression pattern. The porcine DIO3 gene was expressed predominantly in backfat， mildly in liver， uterus， kidney， heart， small intestine， muscle and stomach， and almost absent in spleen and lung by realtime fluorescence quantitative PCR. A single nucleotide polymorphism in exon （A/C687） was used to investigate imprinting status in porcine embryonic tissues. The results indicate that DIO3 was imprinted in all the tested tissues.
Key words： pig； DIO3 gene； tissue expression； imprinting analysis
甲状腺素脱碘酶Ⅲ（Deiodinase iodothyronine type Ⅲ，DIO3）能够使四碘甲状腺原氨酸（T4）和三碘甲状腺原氨酸（T3）内环脱碘导致甲状腺激素失活[1]，在甲状腺激素代谢过程中起着关键作用[2]。甲状腺激素是调节机体生长发育及调控碳水化合物、脂肪、蛋白质等三大营养物质代谢的重要因子，DIO3基因通过调节甲状腺激素的代谢而影响机体生长发育及营养物质的代谢，因此，DIO3是调控生长发育和营养代谢的重要调节因子。该基因在成人组织中活性很低，且仅表达于皮肤、子宫和脑等组织[3]，但是在蜕膜组织、胎盘组织和胎儿组织中表达量较高[4，5]。
基因组印记是一种基因表达依赖于其亲本来源的表观遗传现象。尽管双亲来源的两条染色体具有相同的遗传序列，但是印记基因只表达一个亲本来源的等位基因[6]。DIO3基因位于Dlk1-Dio3印记簇最远端，在DLK1基因下游-800 kb处[7]。在小鼠中DIO3基因表现为母本印记、父本表达[8，9]。本研究采用PCR-RFLP方法分析了猪DIO3基因的印记状态，并研究其表达模式，为进一步研究猪印记基因对猪生长发育的调控和功能基因的分子遗传机理具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 动物和组织样品
用于印记分析的样品：采集自大白猪和梅山猪正反交后代65日龄胚胎（华
中农业大学试验猪场）的10个部位组织（心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、肌肉、小肠、胎盘和脑），分别提取DNA和RNA。
用于组织表达谱分析的样品：采集自65日龄大白猪胚胎（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所原种猪场）的心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、肌肉、脂肪、小肠、子宫等组织，分别提取RNA。
DNA的提取采用传统的苯酚/氯仿提取法。RNA的提取使用Invitrogen公司的TRIzol试剂盒提取。反转录主要按照参考文献[10]中的方法。
1.2 引物设计与PCR扩增DIO3基因
根据猪DIO3基因（GenBank accession No. HQ316945）设计引物进行PCR扩增DIO3基因，引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成，引物序列见表1。
1.3 实时荧光定量PCR
利用DOF/DOR引物，运用实时荧光定量PCR，对猪DIO3基因在65日龄大白猪胚胎的10个部位不同组织（心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、肌肉、脂肪、小肠和子宫）中的表达情况进行分析。实时荧光定量PCR反应体系为25 μL，模板cDNA 50 ng，正、反向引物SYBR Green Mix 12.5 μL，ddH2O补至25 μL。每个样品设3个重复。反应在LightCycler480实时荧光定量PCR仪上进行，同时以β-actinF/β-actinR引物扩增β-actin内参基因，基因的相对表达水平以2-ΔΔCT值表示，数据用SPSS16.0软件进行分析，P
用除DNA酶试剂盒处理杂合子个体的总RNA，然后再反转录成cDNA。利用引物ACF/ACR在65日龄胚胎的组织DNA水平进行PCR扩增，PCR扩增产物经限制性内切酶AcyⅠ酶切，筛选基因型为AC的杂合子个体，再对杂合子个体cDNA水平进行PCR扩增，PCR扩增产物经限制性内切酶AcyⅠ酶切，如果cDNA水平只表达一个亲本的等位基因，另一个亲本的不表达，则说明此基因是印记的。
2 结果与分析
2.1 猪DIO3基因组织表达谱分析
运用实时荧光定量PCR对猪DIO3基因在10个不同组织中的表达情况进行了分析，结果见图1。由图1可知，猪DIO3基因在背部脂肪组织中表达量最高，其次是肝脏、子宫、肾脏、心脏和小肠组织，在脾脏、肺脏、胃和肌肉组织中表达量非常低。
2.2 猪DIO3基因多态性检测
为了检测外显子687 bp处的A/C突变（A/C 687），依照DIO3基因序列（HQ316945）设计一对引物ACF/ACR（序列见表1），扩增产物长度为372 bp，
经限制性内切酶AcyⅠ酶切后，AA基因型为一条372 bp的片段， CC基因型产物为184 bp +188 bp两条片段，AC基因型为372 bp+184 bp + 188 bp的片段（图
2）。
2.3 猪DIO3基因印记分析
为了检测猪DIO3基因印记状态，对大白猪和梅山猪正反交亲本和子代的基因组DNA和cDNA进行基因分型。在大白猪和梅山猪正交和反交后代65 日龄胚胎中发现了适合做印记分析的杂合子个体。用限制性内切酶AcyⅠ对ACF/ACR扩增的产物进行酶切，184 bp 和 188 bp来自于C等位基因，372 bp来自于A等位基因（图2）。印记分析结果表明DIO3基因在65日龄胚胎组织中呈现出父本表达、母本印记（图3）。
3 小结与讨论
研究表明鼠DIO3基因主要表达于脑、胎盘、妊娠期子宫和肝脏组织[4，5，11]。本研究中发现猪DIO3基因在背部脂肪、肝脏和子宫组织中表达量高，在心脏、肾脏、胃、小肠和肌肉组织中表达量低，这与前人研究结果相一致。印记基因对哺乳动物胚胎的生长、发育以及出生后的神经发育和代谢具有重要的影响
[12，13]。基因在不同组织中的表达水平反映了其相应的功能，猪DIO3基因在背部脂肪表达量高，说明该基因在控制脂肪分化和调控脂肪代谢过程中可能起着重要的作用[14]。猪DIO3基因在子宫中表达量高，揭示其可能与猪的繁殖性能相关，为了解调控猪脂肪沉积和繁殖性能的分子生物学机制提供了有价值的信息。
DIO3基因定位于人染色体的14q32，小鼠染色体的12F1，这些区域包含众多的印记基因，该基因在人的皮肤组织以及小鼠的胎儿组织中都表现为父本表达
[15，16]。本研究发现猪DIO3基因在胚胎发育的65日龄阶段所检测的组织中都表现为父本表达，与人和小鼠的研究结果一致。这表明在不同物种中DLK1-DIO3区域的基因组印记具有保守性。
本研究对猪DIO3基因的组织表达谱、印记状态进行了分析，为深入研究印记基因的功能及对猪生产性状的影响提供了分子生物学基础。
参考文献：
[1] BIANCO A C， SALVATORE D， GEREBEN B， et al. Biochemistry， cellular and molecular biology， and physiological roles of the iodothyronine selenodeiodinases[J]. Endocr Rev， 2002，23（1）：38-89.
[2] GERMAIN D， GALTON V. The deiodinase family of selenoproteins[J]. Thyroid，1997，7（4）：655-668.
[3] BATES J， GERMAIN D， GALTON V. Expression profiles of the three
iodothyronine deiodinases， D1， D2， and D3， in the developing rat[J]. Endocrinology，1999，140（2）：844-851.
[4] GALTON V， MARTINEZ E， HERNANDEZ A， et al. Pregnant rat uterus expresses high levels of the type 3 iodothyronine deiodinase[J]. Journal of Clinical Investigation，1999，103（7）：979-987.
[5] HUANG S， DORFMAN D， GENEST D， et al. Type 3 iodothyronine deiodinase is highly expressed in the human uteroplacental unit and in fetal epithelium[J]. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism，2003，88（3）：1384-1388.
[6] REIK W， WALTER J. Genomic imprinting： Parental influence on the genome[J]. Nat Rev Genet，2001，2（1）：21-32.
[7] HERNANDEZ A， PARK J， LYON G， et al. Localization of the type 3 iodothyronine deiodinase（DIO3） gene to human chromosome 14q32 and mouse chromosome 12F1[J]. Genomics， 1999，53（1）：119-121.[8] TSAI C，LIN S， ITO M， et al. Genomic imprinting contributes to thyroid hormone metabolism in the mouse embryo[J]. Current Biology，2002，12（14）：1221-1226.
[9] HERNANDEZ A， FIERING S， MARTINEZ E， et al. The gene locus encoding iodothyronine deiodinase type 3 （Dio3） is imprinted in the fetus and expresses antisense transcripts[J]. Endocrinology，2002，143（11）：4483-4486.
[10] QIAO M， WU H Y， HUANG J S， et al. Promoter characterization and expresion pattern analysis of porcine TCAP gene[J]. Journal of Animal and Veterinary Advance，2012，11（11）：1876-1880.
[11] RICHARD K， HUME R， KAPTEIN E， et al. Ontogeny of iodothyronine deiodinases in human liver[J]. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism，1998，83（8）：2868-2874.
[12] CHARALAMBOUS M， DA R S， FERGUSON S A， et al. Genomic imprinting， growth control and the allocation of nutritional resources： Consequences for postnatal life[J]. Diabetes and Obesity，2007，14（1）：3-12.
[13] WILKINSON L， DAVIES W， ISLES A， et al. Genomic imprinting effects on brain development and function[J]. Nature Reviews Neuroscience，2007，8
（11）：832-843.
[14] HERNANDEZ A， GARCIA B， OBREGON M， et al. Gene expression from the imprinted Dio3 locus is associated with cell proliferation of cultured brown adipocytes[J]. Endocrinology， 2007，148（8）：3968-3976.
[15] SCHMIDT J， MATTESON P， JONES B， et al. The Dlk1 and Gtl2 genes are linked and reciprocally imprinted[J]. Genes & Development， 2000，14（16）：1997-2002.
[16] ROCHA S， EDWARDS C， ITO M， et al. Genomic imprinting at the mammalian Dlk1-Dio3 domain[J]. Trends in Genetics，2008，24（6）：306-316.
猪DIO3基因组织表达谱及印记分析
摘要：采用荧光定量PCR方法分析了猪DIO3基因在组织中的表达状况。结果表明，DIO3基因主要表达于背部脂肪组织，在肝脏、子宫、肾脏、心脏、小肠、肌肉和胃组织中呈中度表达，在脾脏和肺脏中表达量很低。采用外显子687 bp处的A/C突变（A/C 687）检测该基因在猪胚胎组织中的印记状态，DIO3基因在所有组织中均表现为印记。
关键词：猪；DIO3基因；组织表达谱；印记分析
Expression and Imprinting Analysis of Porcine DIO3 Gene
Abstract： Real-time RT-PCR was performed to analyze the porcine DIO3 gene tissue expression pattern. The porcine DIO3 gene was expressed predominantly in backfat， mildly in liver， uterus， kidney， heart， small intestine， muscle and stomach， and almost absent in spleen and lung by realtime fluorescence quantitative PCR. A single nucleotide polymorphism in exon （A/C687） was used to investigate imprinting status in porcine embryonic tissues. The results indicate that DIO3 was imprinted in all the tested tissues.
Key words： pig； DIO3 gene； tissue expression； imprinting analysis
甲状腺素脱碘酶Ⅲ（Deiodinase iodothyronine type Ⅲ，DIO3）能够使四碘甲状腺原氨酸（T4）和三碘甲状腺原氨酸（T3）内环脱碘导致甲状腺激素失活[1]，在甲状腺激素代谢过程中起着关键作用[2]。甲状腺激素是调节机体生长发育及调控碳水化合物、脂肪、蛋白质等三大营养物质代谢的重要因子，DIO3基因通过调节甲状腺激素的代谢而影响机体生长发育及营养物质的代谢，因此，DIO3是调控生长发育和营养代谢的重要调节因子。该基因在成人组织中活性很低，且仅表达于皮肤、子宫和脑等组织[3]，但是在蜕膜组织、胎盘组织和胎儿组织中表达量较高[4，5]。
基因组印记是一种基因表达依赖于其亲本来源的表观遗传现象。尽管双亲来源的两条染色体具有相同的遗传序列，但是印记基因只表达一个亲本来源的等位基因[6]。DIO3基因位于Dlk1-Dio3印记簇最远端，在DLK1基因下游-800 kb处[7]。在小鼠中DIO3基因表现为母本印记、父本表达[8，9]。本研究采用PCR-RFLP方法分析了猪DIO3基因的印记状态，并研究其表达模式，为进一步研究猪印记基因对猪生长发育的调控和功能基因的分子遗传机理具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 动物和组织样品
用于印记分析的样品：采集自大白猪和梅山猪正反交后代65日龄胚胎（华
中农业大学试验猪场）的10个部位组织（心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、肌肉、小肠、胎盘和脑），分别提取DNA和RNA。
用于组织表达谱分析的样品：采集自65日龄大白猪胚胎（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所原种猪场）的心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、肌肉、脂肪、小肠、子宫等组织，分别提取RNA。
DNA的提取采用传统的苯酚/氯仿提取法。RNA的提取使用Invitrogen公司的TRIzol试剂盒提取。反转录主要按照参考文献[10]中的方法。
1.2 引物设计与PCR扩增DIO3基因
根据猪DIO3基因（GenBank accession No. HQ316945）设计引物进行PCR扩增DIO3基因，引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成，引物序列见表1。
1.3 实时荧光定量PCR
利用DOF/DOR引物，运用实时荧光定量PCR，对猪DIO3基因在65日龄大白猪胚胎的10个部位不同组织（心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、肌肉、脂肪、小肠和子宫）中的表达情况进行分析。实时荧光定量PCR反应体系为25 μL，模板cDNA 50 ng，正、反向引物SYBR Green Mix 12.5 μL，ddH2O补至25 μL。每个样品设3个重复。反应在LightCycler480实时荧光定量PCR仪上进行，同时以β-actinF/β-actinR引物扩增β-actin内参基因，基因的相对表达水平以2-ΔΔCT值表示，数据用SPSS16.0软件进行分析，P
用除DNA酶试剂盒处理杂合子个体的总RNA，然后再反转录成cDNA。利用引物ACF/ACR在65日龄胚胎的组织DNA水平进行PCR扩增，PCR扩增产物经限制性内切酶AcyⅠ酶切，筛选基因型为AC的杂合子个体，再对杂合子个体cDNA水平进行PCR扩增，PCR扩增产物经限制性内切酶AcyⅠ酶切，如果cDNA水平只表达一个亲本的等位基因，另一个亲本的不表达，则说明此基因是印记的。
2 结果与分析
2.1 猪DIO3基因组织表达谱分析
运用实时荧光定量PCR对猪DIO3基因在10个不同组织中的表达情况进行了分析，结果见图1。由图1可知，猪DIO3基因在背部脂肪组织中表达量最高，其次是肝脏、子宫、肾脏、心脏和小肠组织，在脾脏、肺脏、胃和肌肉组织中表达量非常低。
2.2 猪DIO3基因多态性检测
为了检测外显子687 bp处的A/C突变（A/C 687），依照DIO3基因序列（HQ316945）设计一对引物ACF/ACR（序列见表1），扩增产物长度为372 bp，
经限制性内切酶AcyⅠ酶切后，AA基因型为一条372 bp的片段， CC基因型产物为184 bp +188 bp两条片段，AC基因型为372 bp+184 bp + 188 bp的片段（图
2）。
2.3 猪DIO3基因印记分析
为了检测猪DIO3基因印记状态，对大白猪和梅山猪正反交亲本和子代的基因组DNA和cDNA进行基因分型。在大白猪和梅山猪正交和反交后代65 日龄胚胎中发现了适合做印记分析的杂合子个体。用限制性内切酶AcyⅠ对ACF/ACR扩增的产物进行酶切，184 bp 和 188 bp来自于C等位基因，372 bp来自于A等位基因（图2）。印记分析结果表明DIO3基因在65日龄胚胎组织中呈现出父本表达、母本印记（图3）。
3 小结与讨论
研究表明鼠DIO3基因主要表达于脑、胎盘、妊娠期子宫和肝脏组织[4，5，11]。本研究中发现猪DIO3基因在背部脂肪、肝脏和子宫组织中表达量高，在心脏、肾脏、胃、小肠和肌肉组织中表达量低，这与前人研究结果相一致。印记基因对哺乳动物胚胎的生长、发育以及出生后的神经发育和代谢具有重要的影响
[12，13]。基因在不同组织中的表达水平反映了其相应的功能，猪DIO3基因在背部脂肪表达量高，说明该基因在控制脂肪分化和调控脂肪代谢过程中可能起着重要的作用[14]。猪DIO3基因在子宫中表达量高，揭示其可能与猪的繁殖性能相关，为了解调控猪脂肪沉积和繁殖性能的分子生物学机制提供了有价值的信息。
DIO3基因定位于人染色体的14q32，小鼠染色体的12F1，这些区域包含众多的印记基因，该基因在人的皮肤组织以及小鼠的胎儿组织中都表现为父本表达
[15，16]。本研究发现猪DIO3基因在胚胎发育的65日龄阶段所检测的组织中都表现为父本表达，与人和小鼠的研究结果一致。这表明在不同物种中DLK1-DIO3区域的基因组印记具有保守性。
本研究对猪DIO3基因的组织表达谱、印记状态进行了分析，为深入研究印记基因的功能及对猪生产性状的影响提供了分子生物学基础。
参考文献：
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[12] CHARALAMBOUS M， DA R S， FERGUSON S A， et al. Genomic imprinting， growth control and the allocation of nutritional resources： Consequences for postnatal life[J]. Diabetes and Obesity，2007，14（1）：3-12.
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