・３２７・
・综述・
液体活检技术在肿瘤诊断领域的研究进展
孙宇乔 贾学渊 于旸
【摘要】 近年随着人们对循环肿瘤细胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ＣＴＣｓ）和循环肿瘤ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒＤＮＡ，ｃｔＤＮＡ）的认识逐渐加深，一种新兴的以血液为基础的肿瘤分子诊断应时而生。液体活检（Ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙ）提供了一种无创性获得肿瘤相关信息的方式，具有安全，高效，实时等特点。相对于传统组织活检而言，液体活检的出现带来了新的机遇与挑战，其在肿瘤的早期诊断、临床分期、疗效评估和个体化治疗等方面体现出巨大的临床应用前景。虽然液体活检目前尚未在临床上普及，但随着技术的发展，液体活检必将迅速成为精确医学的核心部分。
【关键词】 液体活检； 肿瘤； 循环肿瘤细胞； 循环肿瘤ＤＮＡ
基金项目：国家自然科学基金（８１２７２２８８）；教育厅科学技术研究项目（１２５４１３９６）；黑龙江省卫生厅一般项目（２０１３１６１）；黑龙江省博士后资助项目（ＬＢＨ－Ｚ１５１５５）ＲｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｔｕｍｏｒｄｉａｇｎｏｓｉｓＳｕｎＹｕｑｉａｏ，ＪｉａＸｕｅｙｕａｎ，ＹｕＹａｎｇ
（ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＨａｒｂｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００８１，Ｃｈｉｎａ）Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＹｕＹａｎｇ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｙａｎｇ＠ｅｍｓ．ｈｒｂｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｓｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ（ＣＴＣｓ）ａｎｄｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒＤＮＡ，ａｎｅｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｉａｇｎｏｓｉｓｂａｓｅｄｏｎｂｌｏｏｄａｎａｌｙｓｉｓｅｍｅｒｇｅｓ．Ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙｉｓａｍｅｔｈｏｄｔｏｏｂ－ｔａｉｎｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｃａｎｃｅｒｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈｈａｓｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｓａｆｅｔｙ，ｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｒｅａｌｔｉｍｅ．Ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙｐｒｏｖｉｄｅｓｎｅｗｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｔｉｓｓｕｅｂｉｏｐｓｙ．Ｉｔｈａｓｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙｈａｓｎｏｔｂｅｅｎｕｓｅｄｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙｙｅｔ；ｈｏｗｅｖｅｒ，ｗｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｔｗｉｌｌｃｅｒｔａｉｎｌｙｂｅｃｏｍｅｏｎｅｏｆｔｈｅｃｅｎｔｒａｌｐａｒｔｓｏｆｐｒｅｃｉｓｉｏｎｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｎｅａｒｆｕｔｕｒｅ．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】 Ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙ； Ｔｕｍｏｒ； ＣＴＣｓ； ｃｔＤＮＡ
Ｆｕｎｄｐｒｏｇｒａｍ：ＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（８１２７２２８８）；ＴｈｅＥｄｕｃａｔｉｏｎＡｇｅｎ－ｃｙＰｒｏｊｅｃｔｏｆＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ（１２５４１３９６）；ＴｈｅＨｅａｌｔｈＡｇｅｎｃｙＰｒｏｊｅｃｔｏｆＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ（２０１３１６１）；ＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＰｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌＧｒａｎｔ（ＬＢＨ－Ｚ１５１５５）
ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄａｒｅｍａｒｋａｂｌｙｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｅａｒｌｙｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｃｌｉｎｉｃａｌｓｔａｇｅ，ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅ－
肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，医生通常采用组织活检的方法对患者进行检测与
诊断。虽然组织活检是诊断肿瘤的金标准，但不可否认这种方式也存在一些弊端，如对患者造成的创伤较大，易导致肿瘤转移等。近年，随着肿瘤的液体活检这一分子诊断的概念被提出，并且备受关注，液体活检有望迅速进入临床指导肿瘤的诊断与治疗。液体活检是指对患
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４３８６．２０１６．０６．００７
作者单位：１５００８１，哈尔滨医科大学医学遗传学研究室
万方数据通信作者：于旸（Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｙａｎｇ＠ｅｍｓ．ｈｒｂｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）
・３２８・者血液样本中的细胞和核酸的检测，主要包括循环肿瘤细胞和循环肿瘤ＤＮＡ两类。本文从以下３个方面对液体活检在肿瘤诊断领域的研究进展进行总结：液体活检的检测对象、检测手段与临床应用前景。１ 液体活检的检测对象
１．１ 循环肿瘤细胞
ＣＴＣｓ数量可能更少，这使ＣＴＣｓ几乎不可直接探查
［１１］
。近年ＣＴＣｓ的研究取得了飞速的发
展，其中很重要的原因是ＣＴＣｓ的检测手段有了很大的进步。现在针对ＣＴＣｓ的检测流程主要包括两部分：ＣＴＣｓ的分离与富集，以及ＣＴＣｓ的分析检验。
２．１．１ 循环肿瘤细胞的分离与富集 ＣＴＣｓ的分离和富集主要基于其物理性质和免疫学特早在１８６９年，Ａｓｈｗｏｒｔｈ［１］
曾在肿瘤患者外周血中发现与原发病灶性质相似的细胞，这是循环肿瘤细胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ＣＴＣｓ）概念的雏形。随着研究的进一步深入，循环肿瘤细胞被明确定义为从原发肿瘤组织或转移肿瘤组织中脱落，逃离宿主免疫杀伤，并进入血液循环的肿瘤细胞。其最基本的特点是高度异质性，并可通过多种技术被检测到［２］
。在过去的１０年中，大范围的临床调查已证明ＣＴＣｓ计数可以提示乳腺癌
［３］
、前列腺癌
［４］
等多种癌症的
预后；ＣＴＣｓ计数也可被用作检测化疗疗效的生
物标志物，并能预测肿瘤患者的治疗效果［５］
。１．２ 循环肿瘤ＤＮＡ
１９４８年Ｍｅｎｄｅｌ和Ｍｅｔａｉｓ等
［６］
首次发现了
细胞游离核酸（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ，ｃｆＮＡｓ）的存ＤＮＡ在。ｃｆＮＡｓ包括细胞游离ＤＮＡ（ｃｅｌｌ－ｃｆＲＮＡ，ｃｆＤＮＡ）、细胞游离ｍＲＮＡ（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅｆｒｅｅ中都检）和循环测到了ｍｉＲＮＡｃｆＮＡｓ，。如随后在多种疾病的患者ｍＲＮＡ，炎症、自身免疫性疾病、心肌梗塞和癌症等
［７］
。源于原发肿瘤或转
移肿瘤组织派生的ｃｆＤＮＡ称为循环肿瘤ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒＤＮＡ，ｃｔＤＮＡ）［８］
。肿瘤患者体内的ｃｔＤＮＡ远高于健康个体［９］
，且肿瘤释放的当作肿瘤标志物
ｃｔＤＮＡ携带与肿瘤［１０］
细。
胞相同的突变，因此可被
２ 液体活检的检测方法２．１ 循环肿瘤细胞的检测
ＣＴＣｓ分析在血液中含量极低ＣＴＣｓ时最大的困，一位难是转缺移乏肿起瘤始患材者料的。
１ｍＬ血液中含有数百万的白细胞和十几亿的
红细胞，而在如此众多的细胞中，能被检测到
的ＣＴＣｓ万方数据
一般不超过１０个。早期肿瘤患者的
性。由于ＣＴＣｓ与正常血细胞密度和大小存在差异，可利用密度梯度离心法［１２］
和滤过膜分离
法
［１３］
将其分离并富集。此外，由于某些生物标
志物（如甲胎蛋白，上皮细胞黏附分子等肿瘤相关因子）在ＣＴＣｓ和血细胞间存在表达差异，可针对这些标志物的抗原利用流式细胞仪进行分选，也可利用有特异性抗体的磁珠与之结合Ｖｅｒｉｄｅｘ，并在外加磁场的作ａｄｈｅｓｉｏｎ针磁珠进行ｍｏｌｅｃｕｌｅ对上皮用下富集ＣＴＣｓ。其中ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ免系统疫分，细胞黏附分子（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ离ＥｐＣＡＭ，发明）使用相了用于应富抗体集ＣＴＣｓ包被的的监督局（ｆｏｏｄａｎｄ，并且ｄｒｕｇ已ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ经获得了美，国ＦＤＡ食品）批药准品可以应用于临床
［１４］
。
２．１．２ 循环肿瘤细胞的分析检验 通常经过分选后富集到的细胞中仍含有大量白细胞，需要进一步进行分析验证。将富集到的细胞应用荧光素标记的抗角蛋白（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ，ＣＫ）抗体和抗白细胞共同抗原ＣＤ４５抗体进行荧光标记，同时用ＤＡＰＩ对细胞核进行染色，利用荧光显微镜对成像进行分析，其中表现为ＣＫ＋
／ＣＤ４５－
／ＤＡＰＩ＋
的细胞可以被确定为循环肿瘤细胞
［１５］
。
再对确定的ｔｈｅｌｉａＣＴＣｓ进行上皮免疫留具有功能的循环肿瘤细胞用于临床分析ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ，ＥＰＩＳＰＯＴ）将凋亡细斑点胞检去测除（ｅｐｉ［１６］
，保－。
２．２ 循环肿瘤ＤＮＡ的检测方向与手段ｃｕｌａｔｉｎｇ从生物特ｔｕｍｏｒＤＮＡ性的，角ｃｔＤＮＡ度看），携循带环大肿量瘤肿ＤＮＡ瘤相（ｃｉｒ关
－
信息。ｃｔＤＮＡ通过微柱吸附，磁珠吸附等方法分离后，主要通过分析ｃｆＤＮＡ的含量和体细胞突变获取肿瘤相关信息。
２．２．１ 循环肿瘤ＤＮＡ含量 研究表明ｃｔＤＮＡ的含量与肿瘤大小
［１２］
，肿瘤分化程度
［１７］
，以及
［１８］
・３２９・
治疗效果等均相关，因此可通过对患者血浆（如乳房Ｘ线检查检测乳腺癌）等。液体活检为解决早期癌症筛选问题提供了一种无创的、安全的解决方案。但由于早期癌症患者体内ＣＴＣｓ和ｃｔＤＮＡ较少，目前通过液体活检早期诊
中ｃｔＤＮＡ含量的检测了解患者病情。ｃｔＤＮＡ水平可通过多种方法进行检测，如放射性免疫测定、ＤＮＡｄｉｐｓｔｉｃ、实时定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ）等，其中ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ被认为是较优的方法
［１９］
断肿瘤还无法达到临床所需的敏感度，因此不能很好地被应用于临床。但这为今后的研究提供了方向，当ＣＴＣｓ和ｃｔＤＮＡ的富集和检测技术更加完善，液体活检必将使癌症早期诊断率明显升高
［２４］
。
２．２．２ 体细胞突变 肿瘤的演变过程包含一系列体细胞突变事件，其中驱动突变被认为是肿瘤细胞所特有的，并且与肿瘤的形成密不可。
分
［２０］
。检测肿瘤特异性体细胞突变的传统方法是对肿瘤活检样本利用等位基因ＰＣＲ的方法进行分析。随着对ｃｔＤＮＡ研究的不断深入，大量研究结果证实了利用患者ｃｔＤＮＡ代替组织活检对肿瘤的体细胞突变分析［２１］
。例如，
Ｔｈｉｅｒｒｙ等
的可行性［２２］
将结肠癌转移患者通过组织活检
分析到的ＫＲＡＳ基因突变情况作为对照，与用微滴式数字ＰＣＲ分析ｃｔＤＮＡ突变得到的结果进行对比，发现ｃｔＤＮＡ分析突变具有较高的特异性与敏感度。
虽然数字ＰＣＲ的敏感度能满足临床所需，但其只能检测到已知的癌基因热点突变，如ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２等基因突变。随着第二代测序的广泛应用，研究人员将其与数字ＰＣＲ相结合，能更全面的检测ｃｔＤＮＡ的体细胞突变，使肿瘤检测更准确
［２３］
。
３ 液体活检的临床应用前景
近年来液体活检的研究取得了快速的进展，最近已被ＭＩＴＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗ评选为２０１５年１０大技术突破之一。虽然目前临床尚未将液体活检纳入肿瘤的检测标准，但其巨大的临床应用前景不容小觑，主要在早期诊断、临床分期、疗效评估、个体化治疗等方面。未来液体活检必将成为肿瘤领域精准医学的重要组成部分。３．１ 早期诊断
早期肿瘤可通过手术切除达到良好的预后，但由于患者症状不明显而难以察觉，常导致病情延误。早期肿瘤筛查方法包括侵入性检
查（如结万方数据
直肠癌通过内镜检查）和放射线检查
３．２ 临床分期
肿瘤的准确分期是肿瘤治疗的关键，目前临床上常用的检测手段是组织活检。然而组织活检对患者的损伤大，其探测范围也具有局限性，且往往不能反复对患者进行检测。利用液体活检对患者ＣＴＣｓ和ｃｔＤＮＡ进行检测可弥补组织活检的不足，并且能更准确更高效地评估肿瘤的进展情况多研究中ＣＴＣｓ的数量与肿瘤临床分期的相关性在诸
。
已经得到了证实，例如，Ｗｅｎｄｅｌ等
［２５］
对１５０例非小细胞肺癌患者进行ＣＴＣｓ检测，发现ＣＴＣｓ数目与临床分期呈正相关并且具有统计学意义。此外，Ｎｙｇａａｒｄ等
［２６］
的研究表明如果
外周血ｃｔＤＮＡ中出现大量的肿瘤相关基因高频突变，往往提示临床分期较高，其预后也较差。但目前针对ＣＴＣｓ和ｃｔＤＮＡ尚无统一标准指导临床应用，液体活检能否作为临床分期的指标仍需要依赖大样本的临床实验加以验证。３．３ 疗效评估
由于ＣＴＣｓ和ｃｔＤＮＡ存在于外周血中，采用无创的方式即可对患者进行检测，并能更及时地掌握患者病情变化，因此液体活检很适合用于检测治疗效果Ｓｅｒｒａｎｏ等
。
［２７］
对乳腺癌患者施行新辅助治疗
前后的ＣＴＣｓ进行计数分析，发现ＣＴＣｓ数目明显减少的患者往往获益于当前治疗方案，且生存期明显延长。可见良好的肿瘤临床治疗效果与ＣＴＣｓ数目的减少密切相关，这体现出临床运用ＣＴＣｓ评估疗效的巨大潜力。同样的，ｃｔＤＮＡ也可用于评估疗效和预后，Ｇｒａｙ等
［２８］
利用突变
特异性微滴式数字ＰＣＲ对晚期转移性黑色素瘤患者治疗前后ｃｔＤＮＡ中致癌基因ＢＲＡＦ和
・３３０・ＮＲＡＳ突变含量进行对比，发现疗效良好且无病生存期明显延长的患者其ｃｔＤＮＡ突变含量显著降低。此外，液体活检对使用靶向药物治疗的患者更为适用，检验用药后患者ｃｔＤＮＡ中相应靶基因的情况可直观的反应治疗效果。３．４ 个体化治疗
肿瘤具有明显的异质性，即使对于同种肿瘤，相同的化疗方案对不同患者的疗效也存在着较大的差异。随着化疗药物的基因组学机制面也具有巨大的应用前景。精确医学与个体化治疗一直是未来医学致力的方向，液体活检必将随着技术的进步，逐渐进入临床，在未来的肿瘤诊断与治疗中发挥举足轻重的作用。
参 考 文 献
［１］ ＡｓｈｗｏｒｔｈＴ．Ａｃａｓｅｏｆｃａｎｃｅｒｉｎｗｈｉｃｈｃｅｌｌｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈｏｓｅｉｎ
ｔｈｅｔｕｍｏｕｒｓｗｅｒｅｓｅｅｎｉｎｔｈｅｂｌｏｏｄａｆｔｅｒｄｅａｔｈ［Ｊ］．ＡｕｓｔｒａｌＭｅｄＪ，１８６９，１４：１４６－１４７．
研究的不断深入，发现化疗药物对肿瘤细胞的
杀伤效果与特定基因的异常密切相关［２９］
。因此预先获得组织或血液样本，通过检测相关基因，选择合适的靶向药物进行个体化治疗能明显提高疗效。相比于传统的组织活检，液体活检不仅取样简单而且可以实时监测Ｐｕｎｎｏｏｓｅ等
。
［３０］
对应用埃罗替尼的非小细胞
癌患者针对表皮生长因子受ｆａｃｔｏｒ体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ
面的ＥＧＦＲｒｅｃｅｐｔｏｒ进，行ＥＧＦＲ免疫）进行检荧光定测量，分通析过，对寻ＣＴＣｓ找出表对埃罗替尼敏感的患者，并对患者ｃｔＤＮＡ中ＥＧＦＲ基因的Ｔ７９０Ｍ突变进行检测，确定出对埃罗替尼抵抗的患者。根据ＥＧＦＲ的表达与突变情况对是否继续应用埃罗替尼进行调整，可改善治疗效果。此外随着第二代测序技术的飞速发展，通过患者ｃｔＤＮＡ进行测序分析寻找肿瘤相关基因突变成为可能。因此针对所检测到的突变选择更为全面的靶向药物必将成为个体化治疗未来的方向。４ 展望
液体活检的提出为肿瘤进行无创性诊断与检测提供了可能，相比传统的组织活检，液体活检的优势极为明显。但由于ＣＴＣｓ和ｃｔＤＮＡ在血液中含量较低，现有的分离富集手段价格较为昂贵，效果也并不十分理想，而且检测方法敏感度和特异性也偏低。因此液体活检在临床上广泛应用还需要更为完善的富集和检测技术。
目前的研究已充分说明了ＣＴＣｓ和ｃｔＤＮＡ与肿瘤存在密切的关系，液体活检在期诊断、万方数据
肿瘤的早
临床分期、疗效评估、个体化治疗等方
［２］ ＨｅｉｔｚｅｒＥ，ＡｕｅｒＭ，ＵｌｚＰ，ｅｔａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓａｎｄ
ＤＮＡＤＯＩ：１０ａｓ．ｌｉｑｕｉｄ１１８６ｂｉｏｐｓｉｅｓ／ｇｍ４７７［．Ｊ］．ＧｅｎｏｍｅＭｅｄ，２０１３，５（８）：７３．［３］ ＲａｃｋＢ，ＳｃｈｉｎｄｌｂｅｃｋＣ，ＪｕｃｋｓｔｏｃｋＪ，ｅｔａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒ
ｃｅｌｌｓｐａｔｉｅｎｔｓｐｒｅｄｉｃｔｓｕｒｖｉｖａｌｉｎｅａｒｌｙａｖｅｒａｇｅ－ｔｏ－ｈｉｇｈｒｉｓｋｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒＤＯＩ：１０［．Ｊ１０９３］．Ｊ／ｊｎｃｉＮａｔｌ／ｄｊｕＣａｎｃｅｒ０６６．
Ｉｎｓｔ，２０１４，１０６（５）ｐｉｉ：ｄｊｕ０６６．［４］ Ｍａｒｉｎ－ＡｇｕｉｌｅｒａＭ，ＲｅｉｇＯ，ＬｏｚａｎｏＪＪ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｆｉ－
ｌｉｎｇｃｏｎｔｅｎｔｏｆｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｔａｔｅａｎｄｐｏｏｒｂｌｏｏｄｓｕｒｖｉｖａｌｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｉｎｍｅｔａｓｔａｔｉｃｗｉｔｈｃａｓｔｒａｔｉｏｎｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ－ｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ［５］ ＤＯＩＳｃｈｅｒ：１０ｃａｎｃｅｒＨＩ．，１８６３２［Ｊ］．Ｈｅｌｌｅｒ／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔＯｎｃｏｔａｒｇｅｔＧ，Ｍｏｌｉｎａ．３５５０，２０１５Ａ，ｅｔ．，６（１２）：１０６０４ｒｅｓｉｓｔａｎｔ－１０６１６ｐｒｏｓ．－ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｂｉ－
ｏｍａｒｋｅｒｔａｓｔａｔｉｃｃａｓｔｒａｔｉｏｎｐａｎｅｌａｓ－ａｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｐｒｏｓｔａｔｅ－ｌｅｖｅｌｃａｎｃｅｒｓｕｒｒｏｇａｔｅ［Ｊ］ｆｏｒ．ｓｕｒｖｉｖａｌＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌｉｎｍｅ，
－２０１５，３３（１２）：１３４８－１３５５．ＤＯＩ：１０．１２００／ＪＣＯ．２０１４．５５．３４８７．
［６］ ＭａｎｄｅｌＰ，ＭｅｔａｉｓＰ．Ｌｅｓａｃｉｄｅｓｎｕｃｌｅｉｑｕｅｓｄｕｐｌａｓｍａｓａｎｇｕｉｎ
ｃｈｅｚ４）：２４１１’ｈｏｍｍｅ－２４３．
［Ｊ］．ＣＲＳｅａｎｃｅｓＳｏｃＢｉｏｌＦｉｌ，１９４８，１４２（３－［７］ ＷｉｓｌｅｒＪＷ，ＢｅｃｋｅｒＲＣ．Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｔｈｅｒａｐｙ：Ｎｅｗａｒｅａｓｔｏ
ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ２０１４，１８（ｅｆｆｉｃａｃｙ１２）：ａｎｄ１４２７ｂｌｅｅｄｉｎｇ－１４３４．［ＪＤＯＩ］．Ｅｘｐｅｒｔ：１０．Ｏｐｉｎ１５１７Ｔｈｅｒ／１４７２８２２２Ｔａｒｇｅｔｓ，
．２０１４．９５３９２９．
［８］ ＨｅｉｔｚｅｒＥ，ＡｕｅｒＭ，ＨｏｆｆｍａｎｎＥＭ，ｅｔａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆ
ｔｕｍｏｒｔｉｅｎｔｓ－ｗｉｔｈｓｐｅｃｉｆｉｃｃａｎｃｅｒｃｏｐｙ［Ｊｎｕｍｂｅｒ］ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｐｌａｓｍａＤＮＡｏｆｐａ－３５６．ＤＯＩ：１０．１００２／ｉｊｃ．．Ｉｎｔ２８０３０ＪＣａｎｃｅｒ．
，２０１３，１３３（２）：３４６－
［９］ ＭｏｕｌｉｅｒｅＦ，ＴｈｉｅｒｒｙＡＲ．Ｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｏｆｅｘａｍｉｎｉｎｇｔｈｅｐｒｏ－
ｐｏｒｔｉｏｎｍｅｎｔＯｐｉｎａｎｄｏｆＢｉｏｌｎｏｒｍａｌｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＴｈｅｒ，ｃｅｌｌｓＤＮＡｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇｃａｎｃｅｒｆｒｏｍｔｕｍｏｒｐａｔｉｅｎｔｓ，ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎ［Ｊ］．Ｅｘｐｅｒｔ－１５１７／１４７１２５９８．２０１２２０１２，１２．６８８０２３（Ｓｕｐｐｌ．
１）：Ｓ２０９－Ｓ２１５．ＤＯＩ：１０．
［１０］ ＤｉｅｈｌＦ，ＳｃｈｍｉｄｔＫ，ＣｈｏｔｉＭＡ，ｅｔａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｍｕｔａｎｔ
ＤＮＡ９８５－９９０ｔｏａｓｓｅｓｓ．ＤＯＩｔｕｍｏｒ：１０．１０３８ｄｙｎａｍｉｃｓ／ｎｍ［．１７８９Ｊ］．Ｎａｔ．
Ｍｅｄ，２００８，１４（９）：
［１１］ ＨａｂｅｒＤＡ，ＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕＶＥ．Ｂｌｏｏｄ－ｂａｓｅｄａｎａｌｙｓｅｓｏｆｃａｎｃｅｒ：
ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓａｎｄｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒＤＮＡ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ
Ｄｉｓｃｏｖ，２０１４，４（６）：６５０－６６１．ＤＯＩ：１０．１１５８／２１５９－８２９０．
［１２］ ＷｉｌｌｉａｍｓＥＳ，Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ－ＢｒａｖｏＶ，Ｃｈｉｐｐａｄａ－ＶｅｎｋａｔａＵ，ｅｔ
ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｄｅｒｉｖｅｄｘｅｎｏｇｒａｆｔｍｏｄ－５３１８２．ＤＯＩ：１０．３７９１／５３１８２．
ｅｌｓｆｒｏｍｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＪＶｉｓＥｘｐ，２０１５，１０５，ＣＤ－１３－１０１４．
・３３１・
１０．１０３８／ｎｍ．３５１９．
［２２］ ＴｈｉｅｒｒｙＡＲ，ＭｏｕｌｉｅｒｅＦ，ＥｌＭｅｓｓａｏｕｄｉＳ，ｅｔａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌｖａｌｉ－
ｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｋｒａｓａｎｄｂｒａｆｍｕｔａｔｉｏｎｓｆｒｏｍｃｉｒｃｕｌａｔ－ｉｎｇｔｕｍｏｒＤＮＡ［Ｊ］．ＮａｔＭｅｄ，２０１４，２０（４）：４３０－４３５．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｍ．３５１１．
［２３］ ＩｇｎａｔｉａｄｉｓＭ，ＤａｗｓｏｎＳＪ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓａｎｄｃｉｒｃｕｌａｔ－
ｉｎｇｔｕｍｏｒＤＮＡｆｏｒｐｒｅｃｉｓｉｏｎｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｄｒｅａｍｏｒｒｅａｌｉｔｙ？［Ｊ］．ＡｎｎＯｎｃｏｌ，２０１４，２５（１２）：２３０４－２３１３．ＤＯＩ：１０．［１３］ ＺｈｅｎｇＳ，ＬｉｎＨＫ，ＬｕＢ，ｅｔａｌ．３ｄｍｉｃｒｏｆｉｌｔｅｒｄｅｖｉｃｅｆｏｒｖｉａ－
ｂｌｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌ（ｃｔｃ）ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｆｒｏｍｂｌｏｏｄ［Ｊ］．１００７Ｂｉｏｍｅｄ／ｓ１０５４４Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ－０１０－９４８５，２０１１－３．
，１３（１）：２０３－２１３．ＤＯＩ：１０．
［１４］ ＨｏｆｍａｎＶ，ＩｌｉｅＭＩ，ＬｏｎｇＥ，ｅｔａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ
ｔｕｍｏｒｓｕｒｇｅｒｙｃｅｌｌｓｅｆｆｉｃａｃｙｆｏｒａｓｎｏｎａ－ｓｍａｌｌｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｆａｃｔｏｒｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇｒａｄｉｃａｌｔｈｅｌｉａｌｔｕｍｏｒｏｆｔｈｅｃｅｌｌｃｅｌｌｓｅａｒｃｈ－ｃｅｌｌｍｅｔｈｏｄ［ａｓｓａｙｌｕｎｇＪ］．ａｎｄｃａｒｃｉｎｏｍａＩｎｔｔｈｅｉｓｏｌａｔｉｏｎ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｙｓｉｚｅｏｆｏｆｅｐｉｔｈｅ
－１６５１－１６６０．ＤＯＩ：１０．１００２／ｉｊｃ．２５８１９ＪＣａｎｃｅｒ．
，２０１１，１２９（７）：
［１５］ ＰｅｃｏｔＣＶ，ＢｉｓｃｈｏｆｆＦＺ，ＭａｙｅｒＪＡ，ｅｔａｌ．Ａｎｏｖｅｌｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒ
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ｉｎｇｌｕｎｇｔｕｍｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｔｒｉａｌ：ｏｆＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎａｎｄｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｐｅｒｔｕｚｕｍａｂｗｉｔｈｔｕｍｏｒＤＮＡｉｎｎｏｎ－ｓｍａｌｌｃｅｌｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｅｒｌｏｔｉｎｉｂｅｎｄｐｏｉｎｔｓ［Ｊ］．ＣｌｉｎｉｎＣａｎｃｅｒａｐｈａｓｅＲｅｓｉｉ，２０１２，１８（８）：２３９１－２４０１．ＤＯＩ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１１－３１４８．
（收稿日期：２０１６－０１－０９）
・３２７・
・综述・
液体活检技术在肿瘤诊断领域的研究进展
孙宇乔 贾学渊 于旸
【摘要】 近年随着人们对循环肿瘤细胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ＣＴＣｓ）和循环肿瘤ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒＤＮＡ，ｃｔＤＮＡ）的认识逐渐加深，一种新兴的以血液为基础的肿瘤分子诊断应时而生。液体活检（Ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙ）提供了一种无创性获得肿瘤相关信息的方式，具有安全，高效，实时等特点。相对于传统组织活检而言，液体活检的出现带来了新的机遇与挑战，其在肿瘤的早期诊断、临床分期、疗效评估和个体化治疗等方面体现出巨大的临床应用前景。虽然液体活检目前尚未在临床上普及，但随着技术的发展，液体活检必将迅速成为精确医学的核心部分。
【关键词】 液体活检； 肿瘤； 循环肿瘤细胞； 循环肿瘤ＤＮＡ
基金项目：国家自然科学基金（８１２７２２８８）；教育厅科学技术研究项目（１２５４１３９６）；黑龙江省卫生厅一般项目（２０１３１６１）；黑龙江省博士后资助项目（ＬＢＨ－Ｚ１５１５５）ＲｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｔｕｍｏｒｄｉａｇｎｏｓｉｓＳｕｎＹｕｑｉａｏ，ＪｉａＸｕｅｙｕａｎ，ＹｕＹａｎｇ
（ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ，ＨａｒｂｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００８１，Ｃｈｉｎａ）Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＹｕＹａｎｇ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｙａｎｇ＠ｅｍｓ．ｈｒｂｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｓｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ（ＣＴＣｓ）ａｎｄｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒＤＮＡ，ａｎｅｗｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｉａｇｎｏｓｉｓｂａｓｅｄｏｎｂｌｏｏｄａｎａｌｙｓｉｓｅｍｅｒｇｅｓ．Ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙｉｓａｍｅｔｈｏｄｔｏｏｂ－ｔａｉｎｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｃａｎｃｅｒｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈｈａｓｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｓａｆｅｔｙ，ｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｒｅａｌｔｉｍｅ．Ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙｐｒｏｖｉｄｅｓｎｅｗｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓａｎｄｃｈａｌｌｅｎｇｅｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｔｉｓｓｕｅｂｉｏｐｓｙ．Ｉｔｈａｓｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙｈａｓｎｏｔｂｅｅｎｕｓｅｄｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙｙｅｔ；ｈｏｗｅｖｅｒ，ｗｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｔｗｉｌｌｃｅｒｔａｉｎｌｙｂｅｃｏｍｅｏｎｅｏｆｔｈｅｃｅｎｔｒａｌｐａｒｔｓｏｆｐｒｅｃｉｓｉｏｎｍｅｄｉｃｉｎｅｉｎｎｅａｒｆｕｔｕｒｅ．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】 Ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙ； Ｔｕｍｏｒ； ＣＴＣｓ； ｃｔＤＮＡ
Ｆｕｎｄｐｒｏｇｒａｍ：ＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（８１２７２２８８）；ＴｈｅＥｄｕｃａｔｉｏｎＡｇｅｎ－ｃｙＰｒｏｊｅｃｔｏｆＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ（１２５４１３９６）；ＴｈｅＨｅａｌｔｈＡｇｅｎｃｙＰｒｏｊｅｃｔｏｆＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ（２０１３１６１）；ＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＰｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌＧｒａｎｔ（ＬＢＨ－Ｚ１５１５５）
ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄａｒｅｍａｒｋａｂｌｙｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｅａｒｌｙｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｃｌｉｎｉｃａｌｓｔａｇｅ，ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｅ－
肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，医生通常采用组织活检的方法对患者进行检测与
诊断。虽然组织活检是诊断肿瘤的金标准，但不可否认这种方式也存在一些弊端，如对患者造成的创伤较大，易导致肿瘤转移等。近年，随着肿瘤的液体活检这一分子诊断的概念被提出，并且备受关注，液体活检有望迅速进入临床指导肿瘤的诊断与治疗。液体活检是指对患
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４３８６．２０１６．０６．００７
作者单位：１５００８１，哈尔滨医科大学医学遗传学研究室
万方数据通信作者：于旸（Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｙａｎｇ＠ｅｍｓ．ｈｒｂｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）
・３２８・者血液样本中的细胞和核酸的检测，主要包括循环肿瘤细胞和循环肿瘤ＤＮＡ两类。本文从以下３个方面对液体活检在肿瘤诊断领域的研究进展进行总结：液体活检的检测对象、检测手段与临床应用前景。１ 液体活检的检测对象
１．１ 循环肿瘤细胞
ＣＴＣｓ数量可能更少，这使ＣＴＣｓ几乎不可直接探查
［１１］
。近年ＣＴＣｓ的研究取得了飞速的发
展，其中很重要的原因是ＣＴＣｓ的检测手段有了很大的进步。现在针对ＣＴＣｓ的检测流程主要包括两部分：ＣＴＣｓ的分离与富集，以及ＣＴＣｓ的分析检验。
２．１．１ 循环肿瘤细胞的分离与富集 ＣＴＣｓ的分离和富集主要基于其物理性质和免疫学特早在１８６９年，Ａｓｈｗｏｒｔｈ［１］
曾在肿瘤患者外周血中发现与原发病灶性质相似的细胞，这是循环肿瘤细胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ＣＴＣｓ）概念的雏形。随着研究的进一步深入，循环肿瘤细胞被明确定义为从原发肿瘤组织或转移肿瘤组织中脱落，逃离宿主免疫杀伤，并进入血液循环的肿瘤细胞。其最基本的特点是高度异质性，并可通过多种技术被检测到［２］
。在过去的１０年中，大范围的临床调查已证明ＣＴＣｓ计数可以提示乳腺癌
［３］
、前列腺癌
［４］
等多种癌症的
预后；ＣＴＣｓ计数也可被用作检测化疗疗效的生
物标志物，并能预测肿瘤患者的治疗效果［５］
。１．２ 循环肿瘤ＤＮＡ
１９４８年Ｍｅｎｄｅｌ和Ｍｅｔａｉｓ等
［６］
首次发现了
细胞游离核酸（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ，ｃｆＮＡｓ）的存ＤＮＡ在。ｃｆＮＡｓ包括细胞游离ＤＮＡ（ｃｅｌｌ－ｃｆＲＮＡ，ｃｆＤＮＡ）、细胞游离ｍＲＮＡ（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅｆｒｅｅ中都检）和循环测到了ｍｉＲＮＡｃｆＮＡｓ，。如随后在多种疾病的患者ｍＲＮＡ，炎症、自身免疫性疾病、心肌梗塞和癌症等
［７］
。源于原发肿瘤或转
移肿瘤组织派生的ｃｆＤＮＡ称为循环肿瘤ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒＤＮＡ，ｃｔＤＮＡ）［８］
。肿瘤患者体内的ｃｔＤＮＡ远高于健康个体［９］
，且肿瘤释放的当作肿瘤标志物
ｃｔＤＮＡ携带与肿瘤［１０］
细。
胞相同的突变，因此可被
２ 液体活检的检测方法２．１ 循环肿瘤细胞的检测
ＣＴＣｓ分析在血液中含量极低ＣＴＣｓ时最大的困，一位难是转缺移乏肿起瘤始患材者料的。
１ｍＬ血液中含有数百万的白细胞和十几亿的
红细胞，而在如此众多的细胞中，能被检测到
的ＣＴＣｓ万方数据
一般不超过１０个。早期肿瘤患者的
性。由于ＣＴＣｓ与正常血细胞密度和大小存在差异，可利用密度梯度离心法［１２］
和滤过膜分离
法
［１３］
将其分离并富集。此外，由于某些生物标
志物（如甲胎蛋白，上皮细胞黏附分子等肿瘤相关因子）在ＣＴＣｓ和血细胞间存在表达差异，可针对这些标志物的抗原利用流式细胞仪进行分选，也可利用有特异性抗体的磁珠与之结合Ｖｅｒｉｄｅｘ，并在外加磁场的作ａｄｈｅｓｉｏｎ针磁珠进行ｍｏｌｅｃｕｌｅ对上皮用下富集ＣＴＣｓ。其中ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ免系统疫分，细胞黏附分子（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ离ＥｐＣＡＭ，发明）使用相了用于应富抗体集ＣＴＣｓ包被的的监督局（ｆｏｏｄａｎｄ，并且ｄｒｕｇ已ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ经获得了美，国ＦＤＡ食品）批药准品可以应用于临床
［１４］
。
２．１．２ 循环肿瘤细胞的分析检验 通常经过分选后富集到的细胞中仍含有大量白细胞，需要进一步进行分析验证。将富集到的细胞应用荧光素标记的抗角蛋白（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ，ＣＫ）抗体和抗白细胞共同抗原ＣＤ４５抗体进行荧光标记，同时用ＤＡＰＩ对细胞核进行染色，利用荧光显微镜对成像进行分析，其中表现为ＣＫ＋
／ＣＤ４５－
／ＤＡＰＩ＋
的细胞可以被确定为循环肿瘤细胞
［１５］
。
再对确定的ｔｈｅｌｉａＣＴＣｓ进行上皮免疫留具有功能的循环肿瘤细胞用于临床分析ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ，ＥＰＩＳＰＯＴ）将凋亡细斑点胞检去测除（ｅｐｉ［１６］
，保－。
２．２ 循环肿瘤ＤＮＡ的检测方向与手段ｃｕｌａｔｉｎｇ从生物特ｔｕｍｏｒＤＮＡ性的，角ｃｔＤＮＡ度看），携循带环大肿量瘤肿ＤＮＡ瘤相（ｃｉｒ关
－
信息。ｃｔＤＮＡ通过微柱吸附，磁珠吸附等方法分离后，主要通过分析ｃｆＤＮＡ的含量和体细胞突变获取肿瘤相关信息。
２．２．１ 循环肿瘤ＤＮＡ含量 研究表明ｃｔＤＮＡ的含量与肿瘤大小
［１２］
，肿瘤分化程度
［１７］
，以及
［１８］
・３２９・
治疗效果等均相关，因此可通过对患者血浆（如乳房Ｘ线检查检测乳腺癌）等。液体活检为解决早期癌症筛选问题提供了一种无创的、安全的解决方案。但由于早期癌症患者体内ＣＴＣｓ和ｃｔＤＮＡ较少，目前通过液体活检早期诊
中ｃｔＤＮＡ含量的检测了解患者病情。ｃｔＤＮＡ水平可通过多种方法进行检测，如放射性免疫测定、ＤＮＡｄｉｐｓｔｉｃ、实时定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ）等，其中ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ被认为是较优的方法
［１９］
断肿瘤还无法达到临床所需的敏感度，因此不能很好地被应用于临床。但这为今后的研究提供了方向，当ＣＴＣｓ和ｃｔＤＮＡ的富集和检测技术更加完善，液体活检必将使癌症早期诊断率明显升高
［２４］
。
２．２．２ 体细胞突变 肿瘤的演变过程包含一系列体细胞突变事件，其中驱动突变被认为是肿瘤细胞所特有的，并且与肿瘤的形成密不可。
分
［２０］
。检测肿瘤特异性体细胞突变的传统方法是对肿瘤活检样本利用等位基因ＰＣＲ的方法进行分析。随着对ｃｔＤＮＡ研究的不断深入，大量研究结果证实了利用患者ｃｔＤＮＡ代替组织活检对肿瘤的体细胞突变分析［２１］
。例如，
Ｔｈｉｅｒｒｙ等
的可行性［２２］
将结肠癌转移患者通过组织活检
分析到的ＫＲＡＳ基因突变情况作为对照，与用微滴式数字ＰＣＲ分析ｃｔＤＮＡ突变得到的结果进行对比，发现ｃｔＤＮＡ分析突变具有较高的特异性与敏感度。
虽然数字ＰＣＲ的敏感度能满足临床所需，但其只能检测到已知的癌基因热点突变，如ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２等基因突变。随着第二代测序的广泛应用，研究人员将其与数字ＰＣＲ相结合，能更全面的检测ｃｔＤＮＡ的体细胞突变，使肿瘤检测更准确
［２３］
。
３ 液体活检的临床应用前景
近年来液体活检的研究取得了快速的进展，最近已被ＭＩＴＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗ评选为２０１５年１０大技术突破之一。虽然目前临床尚未将液体活检纳入肿瘤的检测标准，但其巨大的临床应用前景不容小觑，主要在早期诊断、临床分期、疗效评估、个体化治疗等方面。未来液体活检必将成为肿瘤领域精准医学的重要组成部分。３．１ 早期诊断
早期肿瘤可通过手术切除达到良好的预后，但由于患者症状不明显而难以察觉，常导致病情延误。早期肿瘤筛查方法包括侵入性检
查（如结万方数据
直肠癌通过内镜检查）和放射线检查
３．２ 临床分期
肿瘤的准确分期是肿瘤治疗的关键，目前临床上常用的检测手段是组织活检。然而组织活检对患者的损伤大，其探测范围也具有局限性，且往往不能反复对患者进行检测。利用液体活检对患者ＣＴＣｓ和ｃｔＤＮＡ进行检测可弥补组织活检的不足，并且能更准确更高效地评估肿瘤的进展情况多研究中ＣＴＣｓ的数量与肿瘤临床分期的相关性在诸
。
已经得到了证实，例如，Ｗｅｎｄｅｌ等
［２５］
对１５０例非小细胞肺癌患者进行ＣＴＣｓ检测，发现ＣＴＣｓ数目与临床分期呈正相关并且具有统计学意义。此外，Ｎｙｇａａｒｄ等
［２６］
的研究表明如果
外周血ｃｔＤＮＡ中出现大量的肿瘤相关基因高频突变，往往提示临床分期较高，其预后也较差。但目前针对ＣＴＣｓ和ｃｔＤＮＡ尚无统一标准指导临床应用，液体活检能否作为临床分期的指标仍需要依赖大样本的临床实验加以验证。３．３ 疗效评估
由于ＣＴＣｓ和ｃｔＤＮＡ存在于外周血中，采用无创的方式即可对患者进行检测，并能更及时地掌握患者病情变化，因此液体活检很适合用于检测治疗效果Ｓｅｒｒａｎｏ等
。
［２７］
对乳腺癌患者施行新辅助治疗
前后的ＣＴＣｓ进行计数分析，发现ＣＴＣｓ数目明显减少的患者往往获益于当前治疗方案，且生存期明显延长。可见良好的肿瘤临床治疗效果与ＣＴＣｓ数目的减少密切相关，这体现出临床运用ＣＴＣｓ评估疗效的巨大潜力。同样的，ｃｔＤＮＡ也可用于评估疗效和预后，Ｇｒａｙ等
［２８］
利用突变
特异性微滴式数字ＰＣＲ对晚期转移性黑色素瘤患者治疗前后ｃｔＤＮＡ中致癌基因ＢＲＡＦ和
・３３０・ＮＲＡＳ突变含量进行对比，发现疗效良好且无病生存期明显延长的患者其ｃｔＤＮＡ突变含量显著降低。此外，液体活检对使用靶向药物治疗的患者更为适用，检验用药后患者ｃｔＤＮＡ中相应靶基因的情况可直观的反应治疗效果。３．４ 个体化治疗
肿瘤具有明显的异质性，即使对于同种肿瘤，相同的化疗方案对不同患者的疗效也存在着较大的差异。随着化疗药物的基因组学机制面也具有巨大的应用前景。精确医学与个体化治疗一直是未来医学致力的方向，液体活检必将随着技术的进步，逐渐进入临床，在未来的肿瘤诊断与治疗中发挥举足轻重的作用。
参 考 文 献
［１］ ＡｓｈｗｏｒｔｈＴ．Ａｃａｓｅｏｆｃａｎｃｅｒｉｎｗｈｉｃｈｃｅｌｌｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈｏｓｅｉｎ
ｔｈｅｔｕｍｏｕｒｓｗｅｒｅｓｅｅｎｉｎｔｈｅｂｌｏｏｄａｆｔｅｒｄｅａｔｈ［Ｊ］．ＡｕｓｔｒａｌＭｅｄＪ，１８６９，１４：１４６－１４７．
研究的不断深入，发现化疗药物对肿瘤细胞的
杀伤效果与特定基因的异常密切相关［２９］
。因此预先获得组织或血液样本，通过检测相关基因，选择合适的靶向药物进行个体化治疗能明显提高疗效。相比于传统的组织活检，液体活检不仅取样简单而且可以实时监测Ｐｕｎｎｏｏｓｅ等
。
［３０］
对应用埃罗替尼的非小细胞
癌患者针对表皮生长因子受ｆａｃｔｏｒ体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ
面的ＥＧＦＲｒｅｃｅｐｔｏｒ进，行ＥＧＦＲ免疫）进行检荧光定测量，分通析过，对寻ＣＴＣｓ找出表对埃罗替尼敏感的患者，并对患者ｃｔＤＮＡ中ＥＧＦＲ基因的Ｔ７９０Ｍ突变进行检测，确定出对埃罗替尼抵抗的患者。根据ＥＧＦＲ的表达与突变情况对是否继续应用埃罗替尼进行调整，可改善治疗效果。此外随着第二代测序技术的飞速发展，通过患者ｃｔＤＮＡ进行测序分析寻找肿瘤相关基因突变成为可能。因此针对所检测到的突变选择更为全面的靶向药物必将成为个体化治疗未来的方向。４ 展望
液体活检的提出为肿瘤进行无创性诊断与检测提供了可能，相比传统的组织活检，液体活检的优势极为明显。但由于ＣＴＣｓ和ｃｔＤＮＡ在血液中含量较低，现有的分离富集手段价格较为昂贵，效果也并不十分理想，而且检测方法敏感度和特异性也偏低。因此液体活检在临床上广泛应用还需要更为完善的富集和检测技术。
目前的研究已充分说明了ＣＴＣｓ和ｃｔＤＮＡ与肿瘤存在密切的关系，液体活检在期诊断、万方数据
肿瘤的早
临床分期、疗效评估、个体化治疗等方
［２］ ＨｅｉｔｚｅｒＥ，ＡｕｅｒＭ，ＵｌｚＰ，ｅｔａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓａｎｄ
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ｃｅｌｌｓｐａｔｉｅｎｔｓｐｒｅｄｉｃｔｓｕｒｖｉｖａｌｉｎｅａｒｌｙａｖｅｒａｇｅ－ｔｏ－ｈｉｇｈｒｉｓｋｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒＤＯＩ：１０［．Ｊ１０９３］．Ｊ／ｊｎｃｉＮａｔｌ／ｄｊｕＣａｎｃｅｒ０６６．
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ｌｉｎｇｃｏｎｔｅｎｔｏｆｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｔａｔｅａｎｄｐｏｏｒｂｌｏｏｄｓｕｒｖｉｖａｌｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｉｎｍｅｔａｓｔａｔｉｃｗｉｔｈｃａｓｔｒａｔｉｏｎｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ－ｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ［５］ ＤＯＩＳｃｈｅｒ：１０ｃａｎｃｅｒＨＩ．，１８６３２［Ｊ］．Ｈｅｌｌｅｒ／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔＯｎｃｏｔａｒｇｅｔＧ，Ｍｏｌｉｎａ．３５５０，２０１５Ａ，ｅｔ．，６（１２）：１０６０４ｒｅｓｉｓｔａｎｔ－１０６１６ｐｒｏｓ．－ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｂｉ－
ｏｍａｒｋｅｒｔａｓｔａｔｉｃｃａｓｔｒａｔｉｏｎｐａｎｅｌａｓ－ａｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｐｒｏｓｔａｔｅ－ｌｅｖｅｌｃａｎｃｅｒｓｕｒｒｏｇａｔｅ［Ｊ］ｆｏｒ．ｓｕｒｖｉｖａｌＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌｉｎｍｅ，
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１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００７０９４．
［１８］ ＧａｕｔｓｃｈｉＯ，ＢｉｇｏｓｃｈＣ，ＨｕｅｇｌｉＢ，ｅｔａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｄｅｏｘｙｒｉ－
ｂｏｎｕｃｌｅｉｃｃａｎｃｅｒ２００４，２２ｐａｔｉｅｎｔｓａｃｉｄ（２０）：４１５７ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇａｓｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ－４１６４ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｍａｒｋｅｒｉｎ．ＤＯＩ：１０．１２００［ｎｏｎＪ］．－ｓｍａｌｌ／ＪＣＯＪＣｌｉｎ－ｃｅｌｌ．２００４Ｏｎｃｏｌｌｕｎｇ．１１，
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［１９］ ＰｅｒｅｉｒａＥ，Ｃａｍａｃｈｏ－ＶａｎｅｇａｓＯ，ＡｎａｎｄＳ，ｅｔａｌ．Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ
ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｒｅｓｐｏｎｓｅｔｕｍｏｒＤＮＡｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙｐｒｅｄｉｃｔ２０１５，１０ａｎｄ（１２ｓｕｒｖｉｖａｌ）：ｅ０１４５７５４ｉｎｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ．ＤＯＩ：ｃａｎｃｅｒｓ１０．１３７１［Ｊ／］ｊｏｕｒｎａｌ．ＰＬｏＳｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ｐｏｎｅＯｎｅ，
．０１４５７５４．
［２０］ ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎＢ，ＰａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓＮ，ＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕＶＥ，ｅｔａｌ．Ｃａｎｃｅｒ
ｇｅｎｏｍｅ１５５８．ＤＯＩｌａｎｄｓｃａｐｅｓ：１０．１１２６［Ｊ］／．ｓｃｉｅｎｃｅＳｃｉｅｎｃｅ．１２３５１２２，２０１３，３３９．
（６１２７）：１５４６－
［２１］ ＮｅｗｍａｎＡＭ，ＢｒａｔｍａｎＳＶ，ＴｏＪ，ｅｔａｌ．Ａｎｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
ｍｅｔｈｏｄｔｉｅｎｔｃｏｖｅｒａｇｅｆｏｒｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ［Ｊ］．ＮａｔｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＭｅｄ，２０１４ｔｕｍｏｒ，２０（ＤＮＡ５）：５４８ｗｉｔｈ－５５４ｂｒｏａｄ．ＤＯＩｐａ：
－万方数据
１０９３／ａｎｎｏｎｃ／ｍｄｕ４８０．
［２４］ ＣａｉＸ，ＪａｎｋｕＦ，ＺｈａｎＱ，ｅｔａｌ．Ａｃｃｅｓｓｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｗｉｔｈｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｉｅｓ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ，２０１５，３１（１０）：５６４－５７５．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｇ．２０１５．０６．００１．
［２５］ ＷｅｎｄｅｌＭ，ＢａｚｈｅｎｏｖａＬ，ＢｏｓｈｕｉｚｅｎＲ，ｅｔａｌ．Ｆｌｕｉｄｂｉｏｐｓｙｆｏｒ
ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｌａｔｅｃａｎｃｅｒ－ｓｔａｇｅｂｉｏｌｏｇｙｎｏｎｔｕｍｏｒ［－ｓｍａｌｌｃｅｌｌＪ］．ＰｈｙｓｃｅｌｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＢｉｏｌｌｕｎｇ，２０１２ｃａｎｃｅｒｉｎ，９：ｐａｔｉｅｎｔｓ（Ａ１）ｇｌｉｍｐｓｅｗｉｔｈｅａｒｌｙ：０１６００５ｉｎｔｏ－．ＤＯＩｌｕｎｇａｎｄ：
１０．１０８８／１４７８－３９６７／９／１／０１６００５．
［２６］ ＮｙｇａａｒｄＡＤ，ＧａｒｍＳｐｉｎｄｌｅｒＫＬ，ＰａｌｌｉｓｇａａｒｄＮ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅ
ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｖａｌｕｅｃａｎｃｅｒｏｆｋｒａｓ［Ｊｍｕｔａｔｅｄ］．ＬｕｎｇｐｌａｓｍａＣａｎｃｅｒＤＮＡ，２０１３ｉｎ，７９ａｄｖａｎｃｅｄ（３）：３１２ｎｏｎ－－３１７．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｌｕｎｇｃａｎ．２０１２．１１．０１６．
［２７］ ＳｅｒｒａｎｏＭＪ，ＲｏｖｉｒａＰＳ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ－ＺｕｂｉａｕｒｒｅＩ，ｅｔａｌ．Ｄｙｎａｍｉｃｓ
ｏｆｖａｎｔｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｒａｐｙ［ｔｕｍｏｒＪ］．ＥｘｐｃｅｌｌｓＴｈｅｒｉｎｅａｒｌｙＭｅｄ，ｂｒｅａｓｔ２０１２，４ｃａｎｃｅｒ（１）：４３ｕｎｄｅｒ－４８ｎｅｏａｄｊｕ．ＤＯＩ：－１０．３８９２／ｅｔｍ．２０１２．５４０．
［２８］ ＧｒａｙＥＳ，ＲｉｚｏｓＨ，ＲｅｉｄＡＬ，ｅｔａｌ．ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒＤＮＡｔｏ
ｍｏｎｉｔｏｒｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｔｒｅａｔｍｅｎｔｍｅｔａｓｔａｔｉｃｒｅｓｐｏｎｓｅｍｅｌａｎｏｍａａｎｄｄｅｔｅｃｔ［Ｊ］ａｃｑｕｉｒｅｄ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，２０１５ｉｎｐａ，６－（３９）：４２００８－４２０１８．ＤＯＩ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．５７８８．
［２９］ ＲｕｄｉｎＭ，ＲａｕｓｃｈＭ，ＳｔｏｅｃｋｌｉＭ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｍａｇｉｎｇｉｎｄｒｕｇ
ｄｉｓｃｏｖｅｒｙｃｌｅａｒａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌａｎｄｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓｏｆｎｏｎｎｕ－ＤＯＩ：１０ｍｅｔｈｏｄｓ．１００７［／Ｊｓ］１１３０７．Ｍｏｌ－００４Ｉｍａｇｉｎｇ－０９５４Ｂｉｏｌ－ｚ．
，２００５，７（１）：５－１３．［３０］ ＰｕｎｎｏｏｓｅＥＡ，ＡｔｗａｌＳ，ＬｉｕＷ，ｅｔａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｃｉｒｃｕｌａｔ－
ｉｎｇｌｕｎｇｔｕｍｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｔｒｉａｌ：ｏｆＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎａｎｄｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｐｅｒｔｕｚｕｍａｂｗｉｔｈｔｕｍｏｒＤＮＡｉｎｎｏｎ－ｓｍａｌｌｃｅｌｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｅｒｌｏｔｉｎｉｂｅｎｄｐｏｉｎｔｓ［Ｊ］．ＣｌｉｎｉｎＣａｎｃｅｒａｐｈａｓｅＲｅｓｉｉ，２０１２，１８（８）：２３９１－２４０１．ＤＯＩ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１１－３１４８．
（收稿日期：２０１６－０１－０９）