实验 二 食品添加剂苯甲酸、山梨酸同时测定
一、目的要求
1. 理解反相色谱的原理和应用。
2. 掌握标准曲线定量法。
3. 学习HPLC 法测定多种食品添加剂方法。
4. 学习ageilent1100HPLC 分析仪器的操作使用。
二、原理
糖精钠是易溶于水的盐类,样品中的苯甲酸、山梨酸经氢氧化钠溶液(O.50 mol ·L ) 浸泡后,转化为易溶于水的苯甲酸钠、山梨酸钠,经沉淀蛋白质、过滤等处理后,四种被测组分滞留于水相中与杂质分离。若样品含有二氧化碳和乙醇,则应加温除去。调pH 至近中性,过滤后进高效液相色谱仪,经反相色谱分离后,以紫外检测器进行检测,以标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做工作曲线,再根据样品中的对应物峰面积,由工作曲线算出其浓度。
三、试剂与样品
方法中所用试剂,除另有规定外,均为分析纯试剂,水为蒸馏水或同等纯度水,溶液为水溶液。 1 甲醇:经滤膜(0.5μm)过滤。
2 稀氨水(1+1) :氨水加水等体积混合。
3 乙酸铵溶液(0.02mol/L):称取1.54g 乙酸铵,加水至1000mL ,溶解,经滤膜(0.45μm)过滤。 4 碳酸氢钠溶液(20g/L):称取2g 碳酸氢钠(优级纯) ,加水至100mL ,振摇溶解。
5 苯甲酸标准储备溶液:准确称取0.1000g 苯甲酸,加碳酸氢钠溶液(20g/L)5mL,加热溶解,移入100mL 容量瓶中,加水定容至100mL ,苯甲酸含量为1mg/mL,作为储备溶液。
6 山梨酸标准储备溶液:准确称取0.1000g 山梨酸,加碳酸氢钠溶液(20g/L)5mL,加热溶解,移入100mL 容量瓶中,加水定容至100mL ,山梨酸含量为1mg/mL,作为储备溶液。
7 苯甲酸、山梨酸标准混合使用溶液:取苯甲酸、山梨酸标准储备溶液各1.0mL ,放入10mL 容量瓶中,加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸、糖精钠各0.1mg/mL。经滤膜(0.45μm)过滤。
9 乙酸铵溶液(0.02mol/L):称取1.54g 乙酸铵,加水至1000mL ,溶解,经滤膜(0.45μm) 过滤。 10 样品:雪碧。
四、仪器
高效液相色谱仪:Agilent 1100型美国安捷伦公司(四元泵、在线脱气机、手动进样器、柱温箱、DAD 检测器)
五、分析步骤
1 样品处理:(在C209完成):用移液管移取10.0mL 已经除去二氧化碳雪碧样品,用氨水(1+1) 调pH 约7(约加1.5滴,用pH 试纸确定)。加水定容至50mL ,
然后到C203,用滤膜(0.45μm)过滤,用HPLC 测定样品及工作曲线。
2 高效液相色谱参考条件
2.1 色谱柱:色谱柱(Hypersil ODS C18)4. 0×250 mm 5μm美国安捷伦公司不锈钢柱。
2.2 流动相:甲醇:乙酸铵溶液(0.02m0l/L)(26 :74) 。
2.3 流速:1.2mL/min。
2.4 进样量:20μL。
2.5
2.6
2.7 检测器(DAD )波长:苯甲酸220 nm、山梨酸254 nm。 根据保留时间定性,外标峰面积法定量(当场记录)。 计算:X 2 (g/kg) = (m 3× V 3)÷(m 4× V 4)
M 3——进样体积中苯甲酸或山梨酸的质量,mg ; 式中:X 2——样品中苯甲酸或山梨酸的含量,g/kg;
V 4——进样体积,mL ;
V 3——样品稀释液总体积,mL ;
m 4——样品质量,g 。
结果的表述:报告算术平均值的二位有效数。
七、思考题
1. 用标准曲线法定量的优缺点是什么?
2. 用HPLC 同时测定多种组分,各组分相互之间有无干扰? 为什么?
3.. 在样品过滤时,为什么要弃去前过滤液?这样做会不会影响实验结果?为什么?
八、附件:ageilent 1100 HPLC分析仪器操作程序
(一) 、开机:
1、打开计算机, 进入Windows NT (或Windows 2000)画面, 并运行Bootp Server程序。
2、打开 1100 LC 各模块电源。
3、待各模块自检完成后,双击Instrument 1 Online图标,化学工作站自动与1100LC 通讯,进入的工作站画面如下所示。
4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”,“Show status(状况) toolbar”,“System diagram(图表) ”,”Sampling diagram”,使其命令前有“√”标志,来调用所需的界面。
5、把流动相放入溶剂瓶中。
6、打开Purge 阀。
7、单击Pump 图标,出现参数设定菜单,单击Setup pump选项,进入泵编辑画面。
8 、设Flow :5ml/min,单击OK 。
9、单击Pump 图标,出现参数设定菜单,单击Pump control选项,选中On ,单击OK ,则系统开始Purge ,直到管线内(由溶剂瓶到泵入口)无气泡为止, 切换通道继续Purge ,直到所有要用通道无气泡为止。
10、单击Pump 图标,出现参数设定菜单,单击Pump Control选项,选中Off ,单击Ok 关泵, 关闭 Purge valve 。
11、单击Pump 图标,出现参数设定菜单,单击Setup pump选项,进入Pump 编辑画面,设Flow :1.0ml/min。
12、单击泵下面的瓶图标,如图所示(以二元泵为例),输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击Ok 。
(二) 数据采集方法编辑:
7、DAD 检测器参数设定: 检测波长: 254nm,BW=30nm, 参比波长=350nm,BW=100nm;
检测波长:一般选择最大吸收处的波长。样品带宽BW : 一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长:一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽BW :至少要与样品信号的带宽相等,许多情况下用100nm 作为缺省值。Peak width(Response time):其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit —狭缝窄,光谱分辨率高;宽时,噪音低。同时可以输入采集光谱方式,步长,范围,阈值。选中所用的灯。 点击Ok 进入下一画面。
10、 在“ Run time checklist(清单) ”中选中“Data acquisition(获得) ”,单击Ok
11、 单击“Method”菜单,选中“Save method as”,输入一方法名,如“test”,单击Ok 。
12、 从菜单 “View”中选中”Online signal” ,选中Windows 1,然后单击Change 钮, 将所要绘图的信号移到右边的框中, 点击Ok.(如同时检测二个信号, 则重复12, 选中 Windows 2)。
13、 从“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项,如上图所示,输入操作者名称,在“Data file ”中选择“Manual”或“Prefix(前缀) ”。
区别: Manual--每次做样之前必须给出新名字, 否则仪器会将上次的数据覆盖掉。 Prefix —在Prefix 框中输入前缀,在Counter 框中输入计数器的起始位,仪器会自动命名,如vwd0001,vwd0002……。
14、 从Instrument 菜单选择System on。
15、 等仪器Ready ,基线平稳,从Method 菜单中选择“Run method”,进样。
(三)、数据分析方法编辑: 1、 从“View”菜单中,单击“Data analysis”进入数据分析画面。
2、 从“File”菜单选择“Load signal”,选中您的数据文件名,如下图所示。单击Ok 。
3、做谱图优化, 从“Graphics(图形) ”菜单中选择“Signal options”选项,。从Ranges 中选择Auto scale及合适的显示时间,单击ok, 或选择”Use Ranges” 调整。反复进行,直到图的比例合适为止。
4、积分: (1)、从“Integration(积分) ”中选择 “Auto integrate”,如积分结果不理想, 再从菜单中选择“Integration Events”选项,选择合适的Slope sensitivity,Peak width,Area reject,Height reject。
(2)、从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项, 则数据被积分。
(3)、如积分结果不理想,则修改相应的积分参数,直到满意为止。
(4)、单击左边“√”图标,将积分参数存入方法。
5、打印报告: (1)、从“Report”菜单中选择“Specify(指定) report”选项,进入如上画面。
(2)、单击“Quantitative(定量的) Results”框中Calculate(计算) 右侧的黑三角,选中Percent (面积百分比),其它选项不变。
(3)、单击Ok.
(4)、从“Report”菜单中选择“Print report”,则报告结果将打印到屏幕上,如想输出到打印机上,则单击Report 底部的“Print”钮。
(四) 、关机:关机前,用 100%的水冲洗系统20分钟,然后用有机溶剂冲洗系统10分钟(如ACN ),然后关泵,(适于反相色谱柱)。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗] ,退出化学工作站,及其它窗口,关闭计算机(用shut down关)。 关掉Agilent 1100电源开关。
(五) 、Agilent 1100 LC维护保养:
1、色谱柱长时间不用,存放时,柱内应充满溶剂,两端封死(如ACN 适于反相色谱柱,正相色谱柱用相应的有机相)
2、对于手动进样器,当使用缓冲溶液时,要用水冲洗进样口,同时搬动进样阀数次,每次数毫升。
3、流动相使用前必须过滤,不要使用多日存放的蒸馏水(易长菌)。
4、带seal-wash 的 1100,要配制90%水+10%异丙醇,以每分2—3滴的速度虹吸排出,溶剂不能干涸。
实验 二 食品添加剂苯甲酸、山梨酸同时测定
一、目的要求
1. 理解反相色谱的原理和应用。
2. 掌握标准曲线定量法。
3. 学习HPLC 法测定多种食品添加剂方法。
4. 学习ageilent1100HPLC 分析仪器的操作使用。
二、原理
糖精钠是易溶于水的盐类,样品中的苯甲酸、山梨酸经氢氧化钠溶液(O.50 mol ·L ) 浸泡后,转化为易溶于水的苯甲酸钠、山梨酸钠,经沉淀蛋白质、过滤等处理后,四种被测组分滞留于水相中与杂质分离。若样品含有二氧化碳和乙醇,则应加温除去。调pH 至近中性,过滤后进高效液相色谱仪,经反相色谱分离后,以紫外检测器进行检测,以标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做工作曲线,再根据样品中的对应物峰面积,由工作曲线算出其浓度。
三、试剂与样品
方法中所用试剂,除另有规定外,均为分析纯试剂,水为蒸馏水或同等纯度水,溶液为水溶液。 1 甲醇:经滤膜(0.5μm)过滤。
2 稀氨水(1+1) :氨水加水等体积混合。
3 乙酸铵溶液(0.02mol/L):称取1.54g 乙酸铵,加水至1000mL ,溶解,经滤膜(0.45μm)过滤。 4 碳酸氢钠溶液(20g/L):称取2g 碳酸氢钠(优级纯) ,加水至100mL ,振摇溶解。
5 苯甲酸标准储备溶液:准确称取0.1000g 苯甲酸,加碳酸氢钠溶液(20g/L)5mL,加热溶解,移入100mL 容量瓶中,加水定容至100mL ,苯甲酸含量为1mg/mL,作为储备溶液。
6 山梨酸标准储备溶液:准确称取0.1000g 山梨酸,加碳酸氢钠溶液(20g/L)5mL,加热溶解,移入100mL 容量瓶中,加水定容至100mL ,山梨酸含量为1mg/mL,作为储备溶液。
7 苯甲酸、山梨酸标准混合使用溶液:取苯甲酸、山梨酸标准储备溶液各1.0mL ,放入10mL 容量瓶中,加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸、糖精钠各0.1mg/mL。经滤膜(0.45μm)过滤。
9 乙酸铵溶液(0.02mol/L):称取1.54g 乙酸铵,加水至1000mL ,溶解,经滤膜(0.45μm) 过滤。 10 样品:雪碧。
四、仪器
高效液相色谱仪:Agilent 1100型美国安捷伦公司(四元泵、在线脱气机、手动进样器、柱温箱、DAD 检测器)
五、分析步骤
1 样品处理:(在C209完成):用移液管移取10.0mL 已经除去二氧化碳雪碧样品,用氨水(1+1) 调pH 约7(约加1.5滴,用pH 试纸确定)。加水定容至50mL ,
然后到C203,用滤膜(0.45μm)过滤,用HPLC 测定样品及工作曲线。
2 高效液相色谱参考条件
2.1 色谱柱:色谱柱(Hypersil ODS C18)4. 0×250 mm 5μm美国安捷伦公司不锈钢柱。
2.2 流动相:甲醇:乙酸铵溶液(0.02m0l/L)(26 :74) 。
2.3 流速:1.2mL/min。
2.4 进样量:20μL。
2.5
2.6
2.7 检测器(DAD )波长:苯甲酸220 nm、山梨酸254 nm。 根据保留时间定性,外标峰面积法定量(当场记录)。 计算:X 2 (g/kg) = (m 3× V 3)÷(m 4× V 4)
M 3——进样体积中苯甲酸或山梨酸的质量,mg ; 式中:X 2——样品中苯甲酸或山梨酸的含量,g/kg;
V 4——进样体积,mL ;
V 3——样品稀释液总体积,mL ;
m 4——样品质量,g 。
结果的表述:报告算术平均值的二位有效数。
七、思考题
1. 用标准曲线法定量的优缺点是什么?
2. 用HPLC 同时测定多种组分,各组分相互之间有无干扰? 为什么?
3.. 在样品过滤时,为什么要弃去前过滤液?这样做会不会影响实验结果?为什么?
八、附件:ageilent 1100 HPLC分析仪器操作程序
(一) 、开机:
1、打开计算机, 进入Windows NT (或Windows 2000)画面, 并运行Bootp Server程序。
2、打开 1100 LC 各模块电源。
3、待各模块自检完成后,双击Instrument 1 Online图标,化学工作站自动与1100LC 通讯,进入的工作站画面如下所示。
4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”,“Show status(状况) toolbar”,“System diagram(图表) ”,”Sampling diagram”,使其命令前有“√”标志,来调用所需的界面。
5、把流动相放入溶剂瓶中。
6、打开Purge 阀。
7、单击Pump 图标,出现参数设定菜单,单击Setup pump选项,进入泵编辑画面。
8 、设Flow :5ml/min,单击OK 。
9、单击Pump 图标,出现参数设定菜单,单击Pump control选项,选中On ,单击OK ,则系统开始Purge ,直到管线内(由溶剂瓶到泵入口)无气泡为止, 切换通道继续Purge ,直到所有要用通道无气泡为止。
10、单击Pump 图标,出现参数设定菜单,单击Pump Control选项,选中Off ,单击Ok 关泵, 关闭 Purge valve 。
11、单击Pump 图标,出现参数设定菜单,单击Setup pump选项,进入Pump 编辑画面,设Flow :1.0ml/min。
12、单击泵下面的瓶图标,如图所示(以二元泵为例),输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击Ok 。
(二) 数据采集方法编辑:
7、DAD 检测器参数设定: 检测波长: 254nm,BW=30nm, 参比波长=350nm,BW=100nm;
检测波长:一般选择最大吸收处的波长。样品带宽BW : 一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长:一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽BW :至少要与样品信号的带宽相等,许多情况下用100nm 作为缺省值。Peak width(Response time):其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit —狭缝窄,光谱分辨率高;宽时,噪音低。同时可以输入采集光谱方式,步长,范围,阈值。选中所用的灯。 点击Ok 进入下一画面。
10、 在“ Run time checklist(清单) ”中选中“Data acquisition(获得) ”,单击Ok
11、 单击“Method”菜单,选中“Save method as”,输入一方法名,如“test”,单击Ok 。
12、 从菜单 “View”中选中”Online signal” ,选中Windows 1,然后单击Change 钮, 将所要绘图的信号移到右边的框中, 点击Ok.(如同时检测二个信号, 则重复12, 选中 Windows 2)。
13、 从“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项,如上图所示,输入操作者名称,在“Data file ”中选择“Manual”或“Prefix(前缀) ”。
区别: Manual--每次做样之前必须给出新名字, 否则仪器会将上次的数据覆盖掉。 Prefix —在Prefix 框中输入前缀,在Counter 框中输入计数器的起始位,仪器会自动命名,如vwd0001,vwd0002……。
14、 从Instrument 菜单选择System on。
15、 等仪器Ready ,基线平稳,从Method 菜单中选择“Run method”,进样。
(三)、数据分析方法编辑: 1、 从“View”菜单中,单击“Data analysis”进入数据分析画面。
2、 从“File”菜单选择“Load signal”,选中您的数据文件名,如下图所示。单击Ok 。
3、做谱图优化, 从“Graphics(图形) ”菜单中选择“Signal options”选项,。从Ranges 中选择Auto scale及合适的显示时间,单击ok, 或选择”Use Ranges” 调整。反复进行,直到图的比例合适为止。
4、积分: (1)、从“Integration(积分) ”中选择 “Auto integrate”,如积分结果不理想, 再从菜单中选择“Integration Events”选项,选择合适的Slope sensitivity,Peak width,Area reject,Height reject。
(2)、从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项, 则数据被积分。
(3)、如积分结果不理想,则修改相应的积分参数,直到满意为止。
(4)、单击左边“√”图标,将积分参数存入方法。
5、打印报告: (1)、从“Report”菜单中选择“Specify(指定) report”选项,进入如上画面。
(2)、单击“Quantitative(定量的) Results”框中Calculate(计算) 右侧的黑三角,选中Percent (面积百分比),其它选项不变。
(3)、单击Ok.
(4)、从“Report”菜单中选择“Print report”,则报告结果将打印到屏幕上,如想输出到打印机上,则单击Report 底部的“Print”钮。
(四) 、关机:关机前,用 100%的水冲洗系统20分钟,然后用有机溶剂冲洗系统10分钟(如ACN ),然后关泵,(适于反相色谱柱)。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗] ,退出化学工作站,及其它窗口,关闭计算机(用shut down关)。 关掉Agilent 1100电源开关。
(五) 、Agilent 1100 LC维护保养:
1、色谱柱长时间不用,存放时,柱内应充满溶剂,两端封死(如ACN 适于反相色谱柱,正相色谱柱用相应的有机相)
2、对于手动进样器,当使用缓冲溶液时,要用水冲洗进样口,同时搬动进样阀数次,每次数毫升。
3、流动相使用前必须过滤,不要使用多日存放的蒸馏水(易长菌)。
4、带seal-wash 的 1100,要配制90%水+10%异丙醇,以每分2—3滴的速度虹吸排出,溶剂不能干涸。