第五章 花药与花粉培养
一、花药与花粉培养的概念
1、花药培养
通过无菌操作技术，把发育到一定阶段的花药，接种在人工培养基上，进行诱导、分化，最终形成完整植株的技术。
2、花粉培养
将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养，也叫小孢子培养。
二、单倍体
1、单倍体：指具有配子体染色体数的孢子体。（植物个体）
2、单倍体植物的特点
与其二倍体相比较，有三个明显的特点：
A、体细胞染色体数减半
B、生长发育弱，体形小，器官明显减小
C、雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代
3、单倍体应用潜力
A、迅速获得纯合型材料，缩短育种年限
B、获得育种中间材料
C、与诱变育种相结合可以提高诱变频率
D、与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义
E、作为遗传工程受体更为有效
三、花粉和花药培养的基本程序
外植体剥取花药接种诱导培养分化培养 四、培养材料的选取与制备
（一）材料的选取
基因型、小孢子发育时期及生理状态等对花药和花粉培养效果具有极大的影响，因而是材料选择所要考虑的主要因素。
1、基因型
供体植株遗传背景对花药和花粉培养成败至关重要。在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易培养成功的材料来做。
多年生植物中，幼年植株比老龄植株的花药诱导率高。
草本植物生长健壮、且处于生殖生长高峰期的花药诱导率高，徒长或营养不足的植株花药培养的诱导率低。
2、花粉发育时期的选择
一般情况下，对大多数植物来说，在单核时期（包括单核早期、中期、晚期）的花粉比较容易培养成功。确定花粉发育时期的方法可用涂片法来进行。
A、花粉发育时期
四分体单核花粉双核花粉
最适期
B、花药和花粉培养的取材时期
单核早期单核晚期双核早期双核晚期三核期
小孢子 花粉粒
花粉培养 花药培养
3、生理状态的选择
花药和花粉供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的诱导率也有直接的影响。不同季节接种的花药愈伤组织诱导率也有显著变化。如小麦早期接种的材料比晚期接种的材料愈伤组织诱导率可提高2—3倍。
（二）预处理
为了取得好的培养效果，在花药接种前，宜先对其进行预处理。花药和花粉的预处理措施主要是低温处理。在很多情况下，低温处理可明显提高花药和花粉培养的效果。
一般耐寒植物比喜温植物可耐受较低的温度，处理的温度可低些。低温处理时间视使用的温度而定，较低的温度处理时间要短，较高的温度处理时间宜长。
低温处理的作用机理就目前来看有两种观点：一种认为低温可以改变花粉粒第一次有丝分裂的纺锤体的轴向，形成两个均等细胞，结果使得花粉朝着胚胎方向发育；另一种观点认为低温的作用是使花粉保持了较长时间的活力，使营养细胞得以完成细胞质的改组而转向胚胎发生。
（三）外植体制备及接种
一般情况下，花药和花粉培养所取材料是未开放的花蕾，其内部的花药和花粉实际上处于无菌状态，表面灭菌在能杀灭花蕾表面微生物的前提下，处理的强度以尽可能轻为好。
1、花药和花粉培养表面灭菌
通常先用70%—75%酒精浸润花蕾30s左右，然后在饱和漂白粉溶液中浸泡10—20min，或在0.1%升汞溶液中处理10min左右，之后用无菌水漂洗4—5次。
2、获得花粉的方法
A、机械挤压梯度离心法
◆花药消毒
◆用镊子或小玻璃杵子将花粉从花药中挤压出
◆用30%蔗糖离心收集悬浮上层的完整花粉粒
◆用培养基洗涤几次
◆培养
B、自然散粉法
◆消毒后的花药接种在液体培养基中
◆一定温度下振荡培养
◆花粉自行散落到培养基中
◆除去花药壁
◆花粉重新培养在新鲜培养基上
机械方法分离处理后的花药和花粉粒，需经过分离、过筛和清洗三个步骤。之后用液体培养基培养，并保证培养基成分的稳定性。
（四）培养方法及培养基的选择
花药和花粉培养的方法主要有液体培养、双层培养、分步培养、看护培养、微室培养等。所选用的培养基中，最常用的是MS培养基。
五、影响因素
光照、温度、湿度、pH、培养基成分、蔗糖浓度、激素
六、单倍体植株的鉴定和染色体加倍
花药和花粉培养的主要目的是制备单倍体植株，但其再生植株并不都是单倍体。因此，必须多获得的花药和花粉植株进行倍性鉴定。
鉴定花药和花粉植株染色体倍性的方法有：形态鉴定、结实性鉴定、染色体数目鉴定和遗传标记鉴定。
由于单倍体植株只有配子染色体组成，生活力很弱，难以长期存活，因此，对鉴定的单倍体植株应尽早进行染色体加倍处理。
花药和花粉有自然加倍的可能，但是发生的频率很低，因此，一般需对鉴定出的花药和花粉单倍体植株进行人工加倍。常用的方法是利用0.02%—0.4%的秋水仙素处理花药和花粉单倍体植株，处理方式和部位随植物种类而异。
第五章 花药与花粉培养
一、花药与花粉培养的概念
1、花药培养
通过无菌操作技术，把发育到一定阶段的花药，接种在人工培养基上，进行诱导、分化，最终形成完整植株的技术。
2、花粉培养
将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养，也叫小孢子培养。
二、单倍体
1、单倍体：指具有配子体染色体数的孢子体。（植物个体）
2、单倍体植物的特点
与其二倍体相比较，有三个明显的特点：
A、体细胞染色体数减半
B、生长发育弱，体形小，器官明显减小
C、雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代
3、单倍体应用潜力
A、迅速获得纯合型材料，缩短育种年限
B、获得育种中间材料
C、与诱变育种相结合可以提高诱变频率
D、与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义
E、作为遗传工程受体更为有效
三、花粉和花药培养的基本程序
外植体剥取花药接种诱导培养分化培养 四、培养材料的选取与制备
（一）材料的选取
基因型、小孢子发育时期及生理状态等对花药和花粉培养效果具有极大的影响，因而是材料选择所要考虑的主要因素。
1、基因型
供体植株遗传背景对花药和花粉培养成败至关重要。在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易培养成功的材料来做。
多年生植物中，幼年植株比老龄植株的花药诱导率高。
草本植物生长健壮、且处于生殖生长高峰期的花药诱导率高，徒长或营养不足的植株花药培养的诱导率低。
2、花粉发育时期的选择
一般情况下，对大多数植物来说，在单核时期（包括单核早期、中期、晚期）的花粉比较容易培养成功。确定花粉发育时期的方法可用涂片法来进行。
A、花粉发育时期
四分体单核花粉双核花粉
最适期
B、花药和花粉培养的取材时期
单核早期单核晚期双核早期双核晚期三核期
小孢子 花粉粒
花粉培养 花药培养
3、生理状态的选择
花药和花粉供体植株的生理状态，对花粉愈伤组织的诱导率也有直接的影响。不同季节接种的花药愈伤组织诱导率也有显著变化。如小麦早期接种的材料比晚期接种的材料愈伤组织诱导率可提高2—3倍。
（二）预处理
为了取得好的培养效果，在花药接种前，宜先对其进行预处理。花药和花粉的预处理措施主要是低温处理。在很多情况下，低温处理可明显提高花药和花粉培养的效果。
一般耐寒植物比喜温植物可耐受较低的温度，处理的温度可低些。低温处理时间视使用的温度而定，较低的温度处理时间要短，较高的温度处理时间宜长。
低温处理的作用机理就目前来看有两种观点：一种认为低温可以改变花粉粒第一次有丝分裂的纺锤体的轴向，形成两个均等细胞，结果使得花粉朝着胚胎方向发育；另一种观点认为低温的作用是使花粉保持了较长时间的活力，使营养细胞得以完成细胞质的改组而转向胚胎发生。
（三）外植体制备及接种
一般情况下，花药和花粉培养所取材料是未开放的花蕾，其内部的花药和花粉实际上处于无菌状态，表面灭菌在能杀灭花蕾表面微生物的前提下，处理的强度以尽可能轻为好。
1、花药和花粉培养表面灭菌
通常先用70%—75%酒精浸润花蕾30s左右，然后在饱和漂白粉溶液中浸泡10—20min，或在0.1%升汞溶液中处理10min左右，之后用无菌水漂洗4—5次。
2、获得花粉的方法
A、机械挤压梯度离心法
◆花药消毒
◆用镊子或小玻璃杵子将花粉从花药中挤压出
◆用30%蔗糖离心收集悬浮上层的完整花粉粒
◆用培养基洗涤几次
◆培养
B、自然散粉法
◆消毒后的花药接种在液体培养基中
◆一定温度下振荡培养
◆花粉自行散落到培养基中
◆除去花药壁
◆花粉重新培养在新鲜培养基上
机械方法分离处理后的花药和花粉粒，需经过分离、过筛和清洗三个步骤。之后用液体培养基培养，并保证培养基成分的稳定性。
（四）培养方法及培养基的选择
花药和花粉培养的方法主要有液体培养、双层培养、分步培养、看护培养、微室培养等。所选用的培养基中，最常用的是MS培养基。
五、影响因素
光照、温度、湿度、pH、培养基成分、蔗糖浓度、激素
六、单倍体植株的鉴定和染色体加倍
花药和花粉培养的主要目的是制备单倍体植株，但其再生植株并不都是单倍体。因此，必须多获得的花药和花粉植株进行倍性鉴定。
鉴定花药和花粉植株染色体倍性的方法有：形态鉴定、结实性鉴定、染色体数目鉴定和遗传标记鉴定。
由于单倍体植株只有配子染色体组成，生活力很弱，难以长期存活，因此，对鉴定的单倍体植株应尽早进行染色体加倍处理。
花药和花粉有自然加倍的可能，但是发生的频率很低，因此，一般需对鉴定出的花药和花粉单倍体植株进行人工加倍。常用的方法是利用0.02%—0.4%的秋水仙素处理花药和花粉单倍体植株，处理方式和部位随植物种类而异。