微球载药率和包埋率的测定
紫杉醇的定量分析采用高效液相色谱法。色谱柱采用 InersilODS-3 C18 柱,流动相为乙腈/水(60/40),流速为1mL/min,进样量为100μL ,紫外检测波长为227 nm。 采用紫杉醇标准品绘制标准曲线:精密称取紫杉醇标准品10mg ,溶于100mL 的乙腈/水混合溶液(60/40)中,配制成100μg/mL紫杉醇储备液,精密量取5、4、3、2、1、0.5 和 0.25 mL 储备液于5mL 容量瓶中定容,分别得到浓度为 100、80、60、40、20、10 和5μg/mL 的标准液,采用上述液相色谱条件进行测定得标准曲线。微球中的紫杉醇含量的测定:精确称取10mg 载药微球溶于5mL 乙腈中,每个样品做3个平行样,长时间超声后,置室温下过夜降解,漩涡3min ,8000rpm 下离心5min 后取上清液600μL ,加400μL 超纯水完全混匀,使乙腈与水的体积比为60/40,采用上述色谱条件进行HPLC 测定,将测定的峰面积代入标准曲线即可求得样品中紫杉醇浓度,进而计算得到微球的载药率(Loading Efficency ,LE )和包埋率(Encapsalution Efficency,EE )。
载药微球体外释放行为测定
精密称取5mg 载药微球置于8mL 玻璃小瓶中,加入5mL 磷酸盐缓冲溶液(PBS ,pH=7.4,其中含0.1%吐温80和0.1%吐温20)。释放实验每个样品做三个平行样。将其置于37℃恒温空气浴振荡器中振摇释放药物,振摇频率为40rpm 。特定时间段,将样品取出在8000 rpm 下离心5min 。将微球用新的磷酸盐缓冲液重新悬浮进行进一步的药物
释放,上清液中加入2mL 二氯甲烷溶液对PTX 进行过夜萃取,当二氯甲烷溶液挥发干燥后加入1mL 乙腈/水溶液(60/40)溶解紫杉醇,用上述HPLC 方法测定释放的药物量。
2.2.1检测波长的选择
紫杉醇适量, 加甲醇溶解, 制成每1ml 中约含10陀的溶液。以甲醇为空白
对照, 按紫外分光光度法在200nln 一400nln 波长范围内进行紫外波长扫描。
2.2.2色谱条件
色谱条件:Diamonsile18柱;
流动相为甲醇:乙睛:水(40:35:25,v/v加); 流速1.0ml/min;柱温30℃;
检测波长为227nm; 进样量20μl 。
2.2.3标准曲线的制备
以紫杉醇原料药为对照品, 精密称取适量, 以甲醇溶解制备对照品储备液,
用流动相稀释配制成浓度分别为0.101、0.202、0.404、0.808、1.01、2.02、5.06、 10.12、20.24μg/ml系列标准溶液。准确吸取不同浓度的标准溶液20μl 进样, 以 紫杉醇质量浓度(C)为横坐标, 峰面积(A)为纵坐标, 绘制标准曲线。
2.9 TAX 一NPs 体外释药特征考察
选取不同pH(5.5、7.4) 的IM 水杨酸钠的磷酸缓冲溶液(PBS)作为释放
介质, 考察载药纳米粒在不同pH 环境下的释放特征。将载药纳米粒置于不同的 释放介质中, 制成1mg/ml的聚合物胶体溶液, 精密移取1.0ml 上述载药纳米粒 于透析袋(MYVCO=7000Da)中, 然后将密封的透析袋置于10ml 的释放介质
中, 每组平行3个样品, 在37℃,100次/min振荡的条件下进行体外释放实验。
于一定时间内取出全部释放介质, 并补充等量体积的新鲜介质。释放介质中的紫 杉醇用二氯甲烷萃取2次, 每次lml, 合并有机相, 氮气吹干, 加入流动相溶解, 用HPLC 法测定样品中紫杉醇的含量, 计算药物的累积释放量和累积释药百分 率。同法对紫杉醇原料药的释放行为进行研究以作对比。所用色谱条件同2.22 项”。
2.7.5差示扫描量热法(DSC)分析
以空铝钳锅为参比物, 另一铝锅中分别放入样品TAX 、PLGA~NP、
TAX~PLGA~NP、PLGA 一NP+TAX进行测试, 升温速度为10℃/min,扫描范围在 40~250℃, 氮气流为50ml/mln,分别绘制样品的DSC 曲线图[s]。
3.4.4差示扫描量热法(DSC)分析
热量曲线如图2.8所示, 从图中可以看出,1显示TAX 在223℃处出现熔融 吸热峰, 此峰在TAX 与PLGA~NP的物理混合物2中也明显可见, 但相对较弱, 而载药纳米粒中这些峰基本消失, 因此可说明被纳米粒包裹的药物为无定形或半 晶形结构。这与XRD 分析结果一致。
2.8IAX 一NPs 体外稳定性考察
将冻干的TAX.NPs 密封于小瓶中, 与4℃冰箱放置一定时间, 测定纳米粒的 粒径、Zeta 电位与包封率。
微球载药率和包埋率的测定
紫杉醇的定量分析采用高效液相色谱法。色谱柱采用 InersilODS-3 C18 柱,流动相为乙腈/水(60/40),流速为1mL/min,进样量为100μL ,紫外检测波长为227 nm。 采用紫杉醇标准品绘制标准曲线:精密称取紫杉醇标准品10mg ,溶于100mL 的乙腈/水混合溶液(60/40)中,配制成100μg/mL紫杉醇储备液,精密量取5、4、3、2、1、0.5 和 0.25 mL 储备液于5mL 容量瓶中定容,分别得到浓度为 100、80、60、40、20、10 和5μg/mL 的标准液,采用上述液相色谱条件进行测定得标准曲线。微球中的紫杉醇含量的测定:精确称取10mg 载药微球溶于5mL 乙腈中,每个样品做3个平行样,长时间超声后,置室温下过夜降解,漩涡3min ,8000rpm 下离心5min 后取上清液600μL ,加400μL 超纯水完全混匀,使乙腈与水的体积比为60/40,采用上述色谱条件进行HPLC 测定,将测定的峰面积代入标准曲线即可求得样品中紫杉醇浓度,进而计算得到微球的载药率(Loading Efficency ,LE )和包埋率(Encapsalution Efficency,EE )。
载药微球体外释放行为测定
精密称取5mg 载药微球置于8mL 玻璃小瓶中,加入5mL 磷酸盐缓冲溶液(PBS ,pH=7.4,其中含0.1%吐温80和0.1%吐温20)。释放实验每个样品做三个平行样。将其置于37℃恒温空气浴振荡器中振摇释放药物,振摇频率为40rpm 。特定时间段,将样品取出在8000 rpm 下离心5min 。将微球用新的磷酸盐缓冲液重新悬浮进行进一步的药物
释放,上清液中加入2mL 二氯甲烷溶液对PTX 进行过夜萃取,当二氯甲烷溶液挥发干燥后加入1mL 乙腈/水溶液(60/40)溶解紫杉醇,用上述HPLC 方法测定释放的药物量。
2.2.1检测波长的选择
紫杉醇适量, 加甲醇溶解, 制成每1ml 中约含10陀的溶液。以甲醇为空白
对照, 按紫外分光光度法在200nln 一400nln 波长范围内进行紫外波长扫描。
2.2.2色谱条件
色谱条件:Diamonsile18柱;
流动相为甲醇:乙睛:水(40:35:25,v/v加); 流速1.0ml/min;柱温30℃;
检测波长为227nm; 进样量20μl 。
2.2.3标准曲线的制备
以紫杉醇原料药为对照品, 精密称取适量, 以甲醇溶解制备对照品储备液,
用流动相稀释配制成浓度分别为0.101、0.202、0.404、0.808、1.01、2.02、5.06、 10.12、20.24μg/ml系列标准溶液。准确吸取不同浓度的标准溶液20μl 进样, 以 紫杉醇质量浓度(C)为横坐标, 峰面积(A)为纵坐标, 绘制标准曲线。
2.9 TAX 一NPs 体外释药特征考察
选取不同pH(5.5、7.4) 的IM 水杨酸钠的磷酸缓冲溶液(PBS)作为释放
介质, 考察载药纳米粒在不同pH 环境下的释放特征。将载药纳米粒置于不同的 释放介质中, 制成1mg/ml的聚合物胶体溶液, 精密移取1.0ml 上述载药纳米粒 于透析袋(MYVCO=7000Da)中, 然后将密封的透析袋置于10ml 的释放介质
中, 每组平行3个样品, 在37℃,100次/min振荡的条件下进行体外释放实验。
于一定时间内取出全部释放介质, 并补充等量体积的新鲜介质。释放介质中的紫 杉醇用二氯甲烷萃取2次, 每次lml, 合并有机相, 氮气吹干, 加入流动相溶解, 用HPLC 法测定样品中紫杉醇的含量, 计算药物的累积释放量和累积释药百分 率。同法对紫杉醇原料药的释放行为进行研究以作对比。所用色谱条件同2.22 项”。
2.7.5差示扫描量热法(DSC)分析
以空铝钳锅为参比物, 另一铝锅中分别放入样品TAX 、PLGA~NP、
TAX~PLGA~NP、PLGA 一NP+TAX进行测试, 升温速度为10℃/min,扫描范围在 40~250℃, 氮气流为50ml/mln,分别绘制样品的DSC 曲线图[s]。
3.4.4差示扫描量热法(DSC)分析
热量曲线如图2.8所示, 从图中可以看出,1显示TAX 在223℃处出现熔融 吸热峰, 此峰在TAX 与PLGA~NP的物理混合物2中也明显可见, 但相对较弱, 而载药纳米粒中这些峰基本消失, 因此可说明被纳米粒包裹的药物为无定形或半 晶形结构。这与XRD 分析结果一致。
2.8IAX 一NPs 体外稳定性考察
将冻干的TAX.NPs 密封于小瓶中, 与4℃冰箱放置一定时间, 测定纳米粒的 粒径、Zeta 电位与包封率。