2005年8月第20卷第4期
中国粮油学报
JournaloftheChineseCerealsandOilsAssociationVo.l20,No.4Aug.2005
紫外分光光度法测定面粉中的巯基含量
田益玲 贾英民 李慧静 齐小菊
(河北农业大学食品科技学院,河北保定 071001)
摘 要 本文利用巯基还原重铬酸钾生成铬酸钾,最大吸收波长发生改变,建立了利用紫外分光光度法测定面粉中巯基的新方法;同时针对该法对样品的处理进行了研究,结果表明:采用醇提法不仅可以有效的提取样品中巯基组分而且测定过程不受其他杂质的干扰。利用该法测定不同用途面粉中巯基的含量,与Ellman的
比色法测定结果无显著性差异。
关键词 巯基 紫外分光光度法 面粉
0 前言
面粉中的巯基含量对面粉的加工性能有很大的影响。由于面粉中的-SH与-S-S-迅速交换位置,使蛋白质分子之间容易相对移动,促进面筋形成;但是当-SH较多时,这一作用将使面筋蛋白结构中的-S-S-结合点无法固定,面筋缺乏弹性,面团发粘不易操作,因此,许多面粉改良采用氧化剂将面粉中-SH氧化为-S-S-来增加面团的弹性。这样,了解面粉中-SH的含量对于面粉的改良有很重要的作用。但是关于面粉中-SH的测定方法报道很少,到目前为止,仅有电化学
[1-2]
sk—1快速混匀器:江苏省金坛市正基仪器有限公司生产;
水浴缸:北京市医疗设备厂;LD5-10离心机:北京医用离心机厂;重铬酸钾、冰乙酸均为AR级;
盐酸半胱氨酸、盐酸胱氨酸(Sino-Ameerican):生物技术有限公司试剂;
葡萄糖氧化酶:河北省微生物所提供;5,5'-二硫代硝基苯(甲)酸:Sigma公司;水为去离子水,电阻率为150kΨ/m;雪花面包粉:河北廊坊面粉有限责任公司;瑞都标准粉和瑞都精制粉:河北省保定市面粉厂;
统一饺子粉:天津统一企业食品有限公司。1.2 试剂的配制及样品处理1.2.1 试剂的配制
重铬酸钾醋酸溶液:0.169mol/L重铬酸钾溶液与冰醋酸按1∶3体积混合,室温保存;盐酸半胱氨酸、盐酸胱氨酸用去离子水分别配制成0.05mol/L和0.02mol/L原液,置于冰箱保存。1.2.2 样品制备
方法1:水提法
[4]
和比色法
[3]
。最常用
Ellman比色法,在该法中所用Ellman试剂复杂,针对该问题,开发研究出一种简便易行的-SH检测方法,
利用该法测定了葡萄糖氧化酶作用前后面粉中-SH的含量以及不同用途的面粉中-SH的含量,其结果与Ellman比色法无显著性差异。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
DU650紫外可见分光光度计:BeckmanInc.U.S.A.;
DL—360超声波发生器:浙江象山县海天电子仪器厂;
基金项目:河北省农产品加工专项课题:酶工程关键技术及其在
农产品加工中应用研究(编号03220173D)
收稿日期:2004-09-20
作者简介:田益玲,女,1974年生,讲师,食品营养与分析
—称取2g面粉加入10mL水,
连瓶称重置冰箱浸泡过夜,次日95℃加热30min,补足失去的水分,摇匀,3000r/min离心20min后取上清液进行测定。
方法2:50%醇提法—称取2g面粉加入10mL的50%乙醇超声波振荡10min,混匀,3000r/min离心20min,移取4mL上清液,进行测定。
10mL,混匀,超声波振荡10min,然后3000r/min离心20min,移取4mL上清液微孔膜过滤后进行测定。1.3 工作曲线的配制和样品的测定
工作曲线的配制:分别移取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL的半胱氨酸于10mL容量瓶中,分别加入2mL重铬酸钾醋酸溶液后用去离子水定容,配制成浓度为:1×10、2×10、4×10、6×10
-2
-3
-3
-3
-3
571nm。在反应结束后,在吸收波长571nm处进行
了30min的吸光度与时间的动态变化,如图2所示,从图2中可以看出吸光度随时间的变化的斜率为0.00001,说明巯基还原重铬酸钾的生成物是稳定的产物,不会因时间的变化而发生变化,有利于方法的建立。
2.2 加热时间对反应的影响
在常温下,巯基与重铬酸钾的反应进行很慢,为加快反应速度,采用沸水浴加热。将0.01mol/L的半胱氨酸重铬酸钾醋酸反应液,放入95℃缸中水浴加热,分别在1、3、5、7、10、13、16min测定该体系的吸光度,结果见图3。
、8×10、
-3
1.0×10mol/L的工作曲线。然后置于90oC水浴
缸中水浴10min后于571nm处比色测定。
样品的测定:在盛有4mL样品的10mL容量瓶中加入2mL重铬酸钾醋酸溶液,而后用去离子水定容,置于90℃水浴缸中水浴10min后,于571nm测定吸光度。
2 结果与讨论
2.1
最佳波长的确定
图3 95℃吸光度(A)随反应时间的变化
图1
吸收光谱
从图3中看到,在10min以前吸光度随加热时间
的延长吸光度增加,10min后吸光度不再增加,如果进一步延长加热时间,吸光度略有下降。因此,加热处理10min最佳。
2.3 反应温度对反应速度的影响
将,0.01mol/L的半胱氨酸重铬酸钾醋酸反应液,置于不同温度的水浴缸中加热10min后测定吸光
图2 吸光度(A)随时间的变化
度,结果见图4。从图4中可知吸光度值随水浴温度的升高而增加,当温度为90℃时吸光度值达到最大。也就是说当温度低于90℃时反应无法在10min进行完全,需进一步延长时间。而当温度大于90℃时,吸光度值无明显的变化。因此测定样品时选择90℃,加热10min为宜。2.4 样品处理方法的选择
由于生物样品复杂,存在许多干扰物质对测定结果造成影响,对样品进行了不同方式的处理,结果见表1。从表1中可知利用方法1即文献方法对样品
巯基具有还原性,它在加热的条件下可以还原重铬酸钾为铬酸钾,使溶液的紫外吸收光谱发生改变。如1.3中所述,配制分别含有0.01mol/L半胱氨酸和胱氨酸重铬酸钾溶液,水浴后在400～800nm扫描其光谱,如图1所示。从图中可看到加入半胱氨酸的重铬酸钾溶液在500～600nm处吸光度显著增加,而胱氨酸的重铬酸钾溶液在改波长范围内的增加量很小,
进行处理虽然精密度很好,但是回收率比较低,方法
2处理所测的结果精密度于与回收率都比较低,而采用方法3处理的结果在回收率与精密度都比较高。从回收率可知,采用方法3对样品进行处理有效地避免了样品中具有氧化或还原性物质的干扰,其中原理需进一步探讨。因此选择方法3(醇提法)对样品进行处理
。
面粉及酶处理面粉统计量t在0.0094～0.073之间,
查表当自由度f为8,显著性
表3 不同用途面粉中巯基含量的测定结果雪花面包粉
类别
本文方法
文献方法
统一饺子粉本文方法1.307
文献方法1.269
瑞都标准粉本文方法1.642
文献
方法
瑞都精制粉本文文献方法方法
含量
0.8280.941
(mg/g)标准偏差(%)注:n=5
3.61
1.32
1.5931.4411.451
2.312.010.891.212.981.32
水平χ为0.05条件下,t0.05,8=2.31。计算得到的t值远远小于t0.05,1的值,说明几种方法的测定结果与文献检测方法的结果是一致的,而该测定方法比文献报道的方法简便快速。
3 结论
图4 吸光度随温度的变化
利用巯基还原重铬酸钾为铬酸钾这一原理,在温度为90℃加热10min后,于571nm波长处测定吸光度的变化可以准确的测定了葡萄糖氧化酶作用前后
1.2323.51.45
表1 对样品三种方法的处理比较
方法方法1方法2方法3
注:n=5
回收率(%)
83.1
75.996.7
标准偏差(%)
面粉中-SH的含量以及不同用途的面中-SH的含量,经t检验与传统的Ellman的比色法测定结果无显著性差异。是一种简单易行的巯基检测方法。
参 考 文 献
2.5 样品的测定
表2 雪花面包粉及经酶处理面粉中巯基的含量类别含量(mg/g)标准偏差(%) 注:n=5
雪花面包粉本文方法0.8283.61
文献方法0.9411.32
酶处理后雪花面包粉本文方法0.0601.58
文献方法0.0512.37
[1] CCTsen,JAAnderson.DeterminationofSulfhydryland
DisulfideGroupsinFlourandtheirRelationtoWheatQuality[J].CerealChemistry,1963,40(6):315-323[2] HASokol,DKMechamandJWPence.FurtherStudies
ontheDeterminationofSulfhydrylGroupsinWheatFlours[J].CerealChemistry,1959,36(3):127-133
[3] DGergel'andAI.Cederbaum.InteractionofNitricOxide
with2-Thio-5-nitrobenzoicAcid:ImplicationsfortheDeterminationofFreeSulfhydrylGroupsbyEllman'sRea-gent[J].Arch.Biochem,Biophys.1997,347(15):282-288
[4] 王连方,李菁,张玲.生物样品活性巯基的测定法[J].
地方病通报,1999,14(4):22-24
在上述确定的条件下,测得工作曲线为Y=0.036+0.39X,回归系数为0.999。测定了葡萄糖氧化酶作用前后面粉中-SH的含量以及不同用途的面
粉中-SH的含量,结果以半胱氨酸计。同时利用文献[3]方法对这两种粉的巯基进行了测定,结果见表2和表3。将两种方法结果进行t检验,对于不同
DeterminationMethodofSulfhydrylinFlour
TinaYiling JiaYingming LiHuijing QiXiaoju
(CollegeofFoodScienceandtechnology,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071001)
Abstract PotassiumdichromatemaybereducedtoformPotassiumacetatechromateanditsmaximumabsorb
wavelengthwillchange.Basedonthisprinciple,anewmethodusingultra-violetspectrophotometrywasdevelopedtodeterminesulfhydrylgroupsinflour.Thismethodcontainsaprocedureofalcoholdistill,whichcanefficaciouslyextractsulfhydrylgroups,andcanavoidinterferencefromimpurity.SulfhydrylgroupcontentobtainedbyusingthismethodisnotsignificantlydifferentcomparingwiththatbyusingEllmancolorimetrymethod.
Keywords Sulfhydryl,ultra-violet,spectrophotometiy,flour
(上接第124页)
Abstract BasedonthecomplexionofgeographyandclimatesituationsinChina,citingallthepublishedweath-erdataofthecapitalcitiesof31provincesfrom1960to1990,andgettingthelatitudesandlongitudesofthecitiesintheGIS,theannualaverage,maximal,andlowestvaluesofairtemperature,annualaveragerelativehumidity,andannualaverageprecipitation,thedivisionforgrainstoragearecarriedoutbythemeansofcombinativeanalysiswithGISspace,mathclustering,andmaparithmetic.Threeareasforgrainstoragearecreated.Ⅰareacalledlowtemper-aturesectionliesinthenorthoflatitude40degreesnorthwheretheaveragetemperatureinwinterisnotmorethan0℃.Ⅱareacalledmiddletemperaturesectionliesinthescopeoflatitude26-35degreesnorthandlongitude110degreeseasttothecoastofChina.ThisareaincludemainlythedrainageareaofChangjiangandHuaihe,wheretheairtemperatureinJanuaryisbetween0℃-8℃.Ⅲareacalledhightemperaturesectionliesinthesouthoflatitude26degreesnorth,wheretheaveragetemperatureofJanuaryisnotlowerthan8℃.Thetechniqueperformanceofstoredgrainaerationinthesethreesectionsarediscussed.TheresultsofdivisionwillbehelpfultotheapplicationofrightgrainstoragetechnologyindifferentsectionsofChina,andtodevelopantechnicalmacro-programforgrainstorageinChina.
Keywords grainstorage,division,maparithmetic,clustering,airtemperature
致谢:感谢中华人民共和国科学技术部和国家粮食局对课题的资助和帮助
2005年8月第20卷第4期
中国粮油学报
JournaloftheChineseCerealsandOilsAssociationVo.l20,No.4Aug.2005
紫外分光光度法测定面粉中的巯基含量
田益玲 贾英民 李慧静 齐小菊
(河北农业大学食品科技学院,河北保定 071001)
摘 要 本文利用巯基还原重铬酸钾生成铬酸钾,最大吸收波长发生改变,建立了利用紫外分光光度法测定面粉中巯基的新方法;同时针对该法对样品的处理进行了研究,结果表明:采用醇提法不仅可以有效的提取样品中巯基组分而且测定过程不受其他杂质的干扰。利用该法测定不同用途面粉中巯基的含量,与Ellman的
比色法测定结果无显著性差异。
关键词 巯基 紫外分光光度法 面粉
0 前言
面粉中的巯基含量对面粉的加工性能有很大的影响。由于面粉中的-SH与-S-S-迅速交换位置,使蛋白质分子之间容易相对移动,促进面筋形成;但是当-SH较多时,这一作用将使面筋蛋白结构中的-S-S-结合点无法固定,面筋缺乏弹性,面团发粘不易操作,因此,许多面粉改良采用氧化剂将面粉中-SH氧化为-S-S-来增加面团的弹性。这样,了解面粉中-SH的含量对于面粉的改良有很重要的作用。但是关于面粉中-SH的测定方法报道很少,到目前为止,仅有电化学
[1-2]
sk—1快速混匀器:江苏省金坛市正基仪器有限公司生产;
水浴缸:北京市医疗设备厂;LD5-10离心机:北京医用离心机厂;重铬酸钾、冰乙酸均为AR级;
盐酸半胱氨酸、盐酸胱氨酸(Sino-Ameerican):生物技术有限公司试剂;
葡萄糖氧化酶:河北省微生物所提供;5,5'-二硫代硝基苯(甲)酸:Sigma公司;水为去离子水,电阻率为150kΨ/m;雪花面包粉:河北廊坊面粉有限责任公司;瑞都标准粉和瑞都精制粉:河北省保定市面粉厂;
统一饺子粉:天津统一企业食品有限公司。1.2 试剂的配制及样品处理1.2.1 试剂的配制
重铬酸钾醋酸溶液:0.169mol/L重铬酸钾溶液与冰醋酸按1∶3体积混合,室温保存;盐酸半胱氨酸、盐酸胱氨酸用去离子水分别配制成0.05mol/L和0.02mol/L原液,置于冰箱保存。1.2.2 样品制备
方法1:水提法
[4]
和比色法
[3]
。最常用
Ellman比色法,在该法中所用Ellman试剂复杂,针对该问题,开发研究出一种简便易行的-SH检测方法,
利用该法测定了葡萄糖氧化酶作用前后面粉中-SH的含量以及不同用途的面粉中-SH的含量,其结果与Ellman比色法无显著性差异。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
DU650紫外可见分光光度计:BeckmanInc.U.S.A.;
DL—360超声波发生器:浙江象山县海天电子仪器厂;
基金项目:河北省农产品加工专项课题:酶工程关键技术及其在
农产品加工中应用研究(编号03220173D)
收稿日期:2004-09-20
作者简介:田益玲,女,1974年生,讲师,食品营养与分析
—称取2g面粉加入10mL水,
连瓶称重置冰箱浸泡过夜,次日95℃加热30min,补足失去的水分,摇匀,3000r/min离心20min后取上清液进行测定。
方法2:50%醇提法—称取2g面粉加入10mL的50%乙醇超声波振荡10min,混匀,3000r/min离心20min,移取4mL上清液,进行测定。
10mL,混匀,超声波振荡10min,然后3000r/min离心20min,移取4mL上清液微孔膜过滤后进行测定。1.3 工作曲线的配制和样品的测定
工作曲线的配制:分别移取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL的半胱氨酸于10mL容量瓶中,分别加入2mL重铬酸钾醋酸溶液后用去离子水定容,配制成浓度为:1×10、2×10、4×10、6×10
-2
-3
-3
-3
-3
571nm。在反应结束后,在吸收波长571nm处进行
了30min的吸光度与时间的动态变化,如图2所示,从图2中可以看出吸光度随时间的变化的斜率为0.00001,说明巯基还原重铬酸钾的生成物是稳定的产物,不会因时间的变化而发生变化,有利于方法的建立。
2.2 加热时间对反应的影响
在常温下,巯基与重铬酸钾的反应进行很慢,为加快反应速度,采用沸水浴加热。将0.01mol/L的半胱氨酸重铬酸钾醋酸反应液,放入95℃缸中水浴加热,分别在1、3、5、7、10、13、16min测定该体系的吸光度,结果见图3。
、8×10、
-3
1.0×10mol/L的工作曲线。然后置于90oC水浴
缸中水浴10min后于571nm处比色测定。
样品的测定:在盛有4mL样品的10mL容量瓶中加入2mL重铬酸钾醋酸溶液,而后用去离子水定容,置于90℃水浴缸中水浴10min后,于571nm测定吸光度。
2 结果与讨论
2.1
最佳波长的确定
图3 95℃吸光度(A)随反应时间的变化
图1
吸收光谱
从图3中看到,在10min以前吸光度随加热时间
的延长吸光度增加,10min后吸光度不再增加,如果进一步延长加热时间,吸光度略有下降。因此,加热处理10min最佳。
2.3 反应温度对反应速度的影响
将,0.01mol/L的半胱氨酸重铬酸钾醋酸反应液,置于不同温度的水浴缸中加热10min后测定吸光
图2 吸光度(A)随时间的变化
度,结果见图4。从图4中可知吸光度值随水浴温度的升高而增加,当温度为90℃时吸光度值达到最大。也就是说当温度低于90℃时反应无法在10min进行完全,需进一步延长时间。而当温度大于90℃时,吸光度值无明显的变化。因此测定样品时选择90℃,加热10min为宜。2.4 样品处理方法的选择
由于生物样品复杂,存在许多干扰物质对测定结果造成影响,对样品进行了不同方式的处理,结果见表1。从表1中可知利用方法1即文献方法对样品
巯基具有还原性,它在加热的条件下可以还原重铬酸钾为铬酸钾,使溶液的紫外吸收光谱发生改变。如1.3中所述,配制分别含有0.01mol/L半胱氨酸和胱氨酸重铬酸钾溶液,水浴后在400～800nm扫描其光谱,如图1所示。从图中可看到加入半胱氨酸的重铬酸钾溶液在500～600nm处吸光度显著增加,而胱氨酸的重铬酸钾溶液在改波长范围内的增加量很小,
进行处理虽然精密度很好,但是回收率比较低,方法
2处理所测的结果精密度于与回收率都比较低,而采用方法3处理的结果在回收率与精密度都比较高。从回收率可知,采用方法3对样品进行处理有效地避免了样品中具有氧化或还原性物质的干扰,其中原理需进一步探讨。因此选择方法3(醇提法)对样品进行处理
。
面粉及酶处理面粉统计量t在0.0094～0.073之间,
查表当自由度f为8,显著性
表3 不同用途面粉中巯基含量的测定结果雪花面包粉
类别
本文方法
文献方法
统一饺子粉本文方法1.307
文献方法1.269
瑞都标准粉本文方法1.642
文献
方法
瑞都精制粉本文文献方法方法
含量
0.8280.941
(mg/g)标准偏差(%)注:n=5
3.61
1.32
1.5931.4411.451
2.312.010.891.212.981.32
水平χ为0.05条件下,t0.05,8=2.31。计算得到的t值远远小于t0.05,1的值,说明几种方法的测定结果与文献检测方法的结果是一致的,而该测定方法比文献报道的方法简便快速。
3 结论
图4 吸光度随温度的变化
利用巯基还原重铬酸钾为铬酸钾这一原理,在温度为90℃加热10min后,于571nm波长处测定吸光度的变化可以准确的测定了葡萄糖氧化酶作用前后
1.2323.51.45
表1 对样品三种方法的处理比较
方法方法1方法2方法3
注:n=5
回收率(%)
83.1
75.996.7
标准偏差(%)
面粉中-SH的含量以及不同用途的面中-SH的含量,经t检验与传统的Ellman的比色法测定结果无显著性差异。是一种简单易行的巯基检测方法。
参 考 文 献
2.5 样品的测定
表2 雪花面包粉及经酶处理面粉中巯基的含量类别含量(mg/g)标准偏差(%) 注:n=5
雪花面包粉本文方法0.8283.61
文献方法0.9411.32
酶处理后雪花面包粉本文方法0.0601.58
文献方法0.0512.37
[1] CCTsen,JAAnderson.DeterminationofSulfhydryland
DisulfideGroupsinFlourandtheirRelationtoWheatQuality[J].CerealChemistry,1963,40(6):315-323[2] HASokol,DKMechamandJWPence.FurtherStudies
ontheDeterminationofSulfhydrylGroupsinWheatFlours[J].CerealChemistry,1959,36(3):127-133
[3] DGergel'andAI.Cederbaum.InteractionofNitricOxide
with2-Thio-5-nitrobenzoicAcid:ImplicationsfortheDeterminationofFreeSulfhydrylGroupsbyEllman'sRea-gent[J].Arch.Biochem,Biophys.1997,347(15):282-288
[4] 王连方,李菁,张玲.生物样品活性巯基的测定法[J].
地方病通报,1999,14(4):22-24
在上述确定的条件下,测得工作曲线为Y=0.036+0.39X,回归系数为0.999。测定了葡萄糖氧化酶作用前后面粉中-SH的含量以及不同用途的面
粉中-SH的含量,结果以半胱氨酸计。同时利用文献[3]方法对这两种粉的巯基进行了测定,结果见表2和表3。将两种方法结果进行t检验,对于不同
DeterminationMethodofSulfhydrylinFlour
TinaYiling JiaYingming LiHuijing QiXiaoju
(CollegeofFoodScienceandtechnology,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071001)
Abstract PotassiumdichromatemaybereducedtoformPotassiumacetatechromateanditsmaximumabsorb
wavelengthwillchange.Basedonthisprinciple,anewmethodusingultra-violetspectrophotometrywasdevelopedtodeterminesulfhydrylgroupsinflour.Thismethodcontainsaprocedureofalcoholdistill,whichcanefficaciouslyextractsulfhydrylgroups,andcanavoidinterferencefromimpurity.SulfhydrylgroupcontentobtainedbyusingthismethodisnotsignificantlydifferentcomparingwiththatbyusingEllmancolorimetrymethod.
Keywords Sulfhydryl,ultra-violet,spectrophotometiy,flour
(上接第124页)
Abstract BasedonthecomplexionofgeographyandclimatesituationsinChina,citingallthepublishedweath-erdataofthecapitalcitiesof31provincesfrom1960to1990,andgettingthelatitudesandlongitudesofthecitiesintheGIS,theannualaverage,maximal,andlowestvaluesofairtemperature,annualaveragerelativehumidity,andannualaverageprecipitation,thedivisionforgrainstoragearecarriedoutbythemeansofcombinativeanalysiswithGISspace,mathclustering,andmaparithmetic.Threeareasforgrainstoragearecreated.Ⅰareacalledlowtemper-aturesectionliesinthenorthoflatitude40degreesnorthwheretheaveragetemperatureinwinterisnotmorethan0℃.Ⅱareacalledmiddletemperaturesectionliesinthescopeoflatitude26-35degreesnorthandlongitude110degreeseasttothecoastofChina.ThisareaincludemainlythedrainageareaofChangjiangandHuaihe,wheretheairtemperatureinJanuaryisbetween0℃-8℃.Ⅲareacalledhightemperaturesectionliesinthesouthoflatitude26degreesnorth,wheretheaveragetemperatureofJanuaryisnotlowerthan8℃.Thetechniqueperformanceofstoredgrainaerationinthesethreesectionsarediscussed.TheresultsofdivisionwillbehelpfultotheapplicationofrightgrainstoragetechnologyindifferentsectionsofChina,andtodevelopantechnicalmacro-programforgrainstorageinChina.
Keywords grainstorage,division,maparithmetic,clustering,airtemperature
致谢:感谢中华人民共和国科学技术部和国家粮食局对课题的资助和帮助