中国科学院究生院
《基因工程原理》复习题（2）
1. 原核基因（Prokaryotic gene ）：由原核生物（如大肠杆菌）基因组编码的基因，以及高等生物细胞器线粒体基因组和叶绿体基因组等编码的基因，统称原核基因。
2. 真核基因（Eukaryotic gene）：真核生物基因组染色体DNA 编码的基因, 以及感染了真核细胞的DNA 病毒和反转录病毒基因组编码的基因，统称真核基因。
3. . 前导序列（Leader sequence ）：又叫前导序列区或5' -非翻译区（5' -UTR ），，系指位于mRNA5' -起始密码子之前的一段长数百个核苷酸的不翻译的RNA 区段。
4. 尾随序列（Tai1er sequence ）：又称尾随序列区或3' -非翻译区（3' -UTR ），系指位于mRNA3' -终止密码子之后一段100多核苷酸的不翻译的RNA 区段。
5 复制子（Replicon ）和复制因子（Replicator ）：
复制子（Replicon ）：系指有一个复制起始位点的DNA 或RNA 复制单元。例如细菌染色体、病毒基因组、质粒基因组等，凡其DNA 能够进行复制的遗传单元，均称复制子。真核细胞基因组的复制子特称复制单元。
复制因子（Replicator ）：又叫复制区，系复制子的一个组成部分。在质粒分子中，指一个特定的DNA 区段。它含有质粒复制起点（ori ）和编码质粒复制所需蛋白质的DNA 序列结构。
6. . 增强子 （Enhancer ）：又叫增强子序列或增强子元件，是真核基因中发现的一种特异序列，能够在距离目标基因50kb 以上的位置，从上游或下游的不同位置及方向增强该基因的转录活性。
7. 沉默子（Silencer ）：在真核基因启动子中除了增强子之外，沉默子同样也是一种可远距离调控相关基因转录活性的顺式元件。与增强子一样，沉默子也能够从启动子的上游、下游甚至是基因内部三种不同的位置以及正向或反向，影响相关基因启动子的转录起始效率。同时沉默子往往是以组织特异性或时间特异的作用方式，控制基因的表达作用。但与增强子的功能效应相反，沉默子只能抑制而不能激活相关基因的转录起始活性。
8. 绝缘子（Insulator ）：亦即是增强子活性的物理边界元件（physical boundary element ），它是一段能够抑制或隔离增强子功能效应的顺式转录调节序列。绝缘子的这种功能作用的发挥，取决于它所在的位置。如果它是位于增强子和启动子之间，便能够阻断增强子的功能效应；但当它是位于增强子-启动子区段的外侧，便不能够阻断增强子的功能作用。因此也有的作者将绝缘子称为隔离邻近增强子对启动子激活作用的中间隔栅（neutral barrier）。绝缘子的作用是与特异结合蛋白IBP 的结合发挥作用。它的意义：能阻断增强子超远距离的激活作用影响生物的发育顺序；真核绝缘子能保护顺序表达以防无义基因的表达。
9. 调节子（Regulon ）：指在大肠杆菌基因组中，其表达活性受同一种基因编码的蛋白质协同调节的，一组不连续相邻排列的结构基因。调节子与操纵子不同之处在于，后者的结构基因是彼此相邻排列的，而调节子的结构基因则是分散于染色体的不同部位，甚至是位于不同染色体上
10. 基因差异表达（Differential expression of gene ）： 真核生物在每一特定的发育阶段，或是某一特定类型的细胞中，一般只有15%的基因进行表达。这种在生物个体发育的不同阶段，或是在不同组织和细胞中，发生不同基因按时间、空间进行有序表达的方式，叫基因的差异表达。
11. 基因内互补（Intragenic complementaion）：
系指编码同样的多肽序列，但又各具一个不同 突变的两个基因联合产生出一种有功能活
性的蛋白质多肽的生化过程。
12. 基因图（Gene map ）：描述染色体或DNA 分子上不同基因的排列顺序及其间隔距离的
线性图。它包括遗传图和物理图两种。
遗传图（genetic map ）：是根据遗传重组实验绘制的，用来表示同一染色体上不同基因
（或特定DNA 序列区）之间的排列顺序及其相对距离的线性图。其图距用厘摩(cM)
表示。
物理图（Physical map）：以精确的物理长度为单位，一般以核苷酸数表示不同基因在染
色体或DNA 分子上的排列顺序及其间隔距离的实际长度的线性图。
13. 基因簇（Gene cluster）与基因家族（Gene family）：系指原核生物基因组中，由不同或
相关的一组相合基因组成的一种特殊的排列组合方式。同一基因簇的各个基因在遗传
上往往是紧密连锁，它们可以是属于同一操纵子的不同结构基因，也可以是不同操纵
子的不同结构基因；它们可以是同一基因家族的不同成员，也可以是不同基因家族的
不同成员。
基因家族（Gene family：由同一生物中同一始祖基因经过重复突变进化而来，具相似的
结构、相似的产物和相似的功能。它们的特征：（1）多重姓；（2）紧密连锁（3）表型
及功能方面的相关性；（4）核苷酸序列的一致性。
14. 基因克隆（Gene cloning）：
基因克隆又叫DNA 克隆，它是指将外源基因插入到克隆载体上形成重组DNA 分子群
体，并转化到大肠杆菌寄主细胞中进行复制繁殖，以便从大分子DNA 或DNA 片段中
分离纯化目的基因或特定的DNA 片段的实验操作，叫做基因克隆或DNA 克隆。
15. 融合基因（Fusion gene）：
亦称重组基因、杂种基因或嵌合基因。通常是指通过自发突变形成或利用DNA 重组技
术构建的。是一类具有来自两个或两个以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。融合基
因可以形成融合蛋白，但融合基因不一定都形成融合蛋白。
16. 基因剂量 （Gene dosage）：
指的是一个细胞所拥有的同一种基因的拷贝数。基因剂量实验是建立在局部二倍体菌株
的基础上，专门来检测基因拷数的增加，对其编码产物合成速率之影响的分子遗传学的
研究技术。
17. 缺口（Gap ）：双链DNA 分子上的某一条链丢失一个或连续数个核苷酸造成的单链断
裂。
裂口（Nick ）：双链DNA 分子的某一条链的相邻核苷酸之间丢失一个磷酸二酯键造成的
单链断裂。
18. 切丁酶（Dicer ）：
亦有人译为RNAi 核酸酶。是一种RNase Ⅲ样（RNase Ⅲ like ）的核酸内切酶。能把双链RNA
（dsRNA ）分子切割成21~23bp的小分子干扰RNA 。这是一种需要A TP 的过程。
19. 异裂酶（Neoschizomer ）：
指一组来源不同，但具有相同的识别序列和不同的切割位点的一组核酸内切限制酶称异裂
酶
20. 同尾酶（Isocaudarner ）：
一组来源不同，识别序列各异，但能够切割形成相同黏性末端的核酸内切酶。
21. 同裂酶 (Isoschizomer)：
是一类来源不同，而识别序列相同，切割能产生相同的黏性末端的核酸内切酶。
22. 拓朴异构酶（T0poisomerase ）：
在原核和真核细胞中发现的，具有催化单链DNA 或双链DNA 产生瞬时断裂的功能。
具有切割与连接的双重功能，导致双链构型的改变。在抗癌研究中，发展抑制拓扑异构
酶的活性的抗癌药物好的开发研制具有重要意义。
23. 质粒DNA 迁移作用（Plasmid mobilization）：
指由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程。由于结合型质粒的mob 基因产生的迁移蛋白可作用于与其共存的非迁移型质粒的nic 位点所产生的迁移作用，称质
粒DNA 迁移作用。
24. 柯斯载体（Cosmid ）：
是一类人工构建的，含有λ噬菌体DNA 的cos 序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。它既具有λ噬菌体的特性，也具有质粒载体的特性。并且具有高容量的克隆能力，其DNA
可以体外被包装到噬菌体的外壳内。
25. 噬菌体展示载体（Phage display vector）：
根据单链噬菌体表面表达的蛋白质或多肽的噬菌体表面展示技术，当把外源基因插入在该载体的基因Ⅲ或基因Ⅷ的编码序列中，正确表达出融合蛋白的这类特殊用途的噬菌体
载体。
26. 穿梭质粒载体（S huttle plasmid vector）：
简称穿梭载体，或叫双功能载体。是一类人工构建具有两种不同的复制起点和选择记号，因而可在两种不同寄主细胞（如大肠杆菌和酿酒酵母）中进行复制与存留的质粒载体。
27. M13克隆体系的优点：
（1）可方便地产生外源单链DNA ；（2）重组子可用组织化学方法检测；（3）lacZ 基因上具多克隆位点，便于外源DNA 插入；（4）可定向克隆外源基因。
28. 质粒载体的结构特点：
（1）具复制起点（ori ）；（）具抗生素抗性基因（选择用）；（3）具若干核酸内切酶的单切点；（4）较小的分子量和较高的拷贝数。
29 启动子封堵（Promoter occlusion）：
由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制的现象，叫做启动子封堵。
30. Ⅱ型核酸内切酶的特点：
（a ）不具有多亚基结构（单一切割功能）；（b ）能识别双链DNA 分子中靶子序列；（c ）切割形成
不同长度的限制片段; （d ）由于不对称切割，能形成粘性末端；（e ）酶切反应不需能量A TP 。
31. 表观遗传信息层（Epigenetic layer of information）：
它是贮藏在围绕DNA 分子周围并与DNA 分子结合的蛋白质及化学物质中。表观遗传信息如同RNA 基因一样令人困惑，甚至比RNA 基因更为重要。
32. 分子伴侣（Molecular chaperone）：
专指一类多功能蛋白质，它能促使某些蛋白质按正确方式组装或折叠，而它本身却不是最终形成功能蛋白质的组成部分，此类蛋白质特称为分子伴侣。
33. RNA干扰（RNAi ）：
近年来研究发现，当一些小分子量的外源双链RNA 进入寄主细胞后，便可促进与其同源的内源mRNA 发生特异性的降解作用，从而高效而特异地阻断体内相应基因的活性，
在细胞内发挥基因的剔除作用。这种现象叫RNA 干扰。
34. 生命有机体遗传信息的三个层次是：
第一层次是由编码蛋白质的基因组成，如人类基因组的基因编码序列占总DNA 序列的
不到2%；
第二层次：仅由编码RNA 而不编码蛋白质的基因组DNA 组成。这一部分DNA 叫做非编码
的DNA ，它的转录产物称为非编码的RNA （不包括tRNA 、rRNA 和snoRNA ），
其相应的基因称为RNA 基因。这类基因隐藏在巨大的非编码的染色体DNA
序列当中。因此过去亦被称为隐藏基因（cryptic gene）；
第三层次：表观遗传信息层（epigenetic layer of information）。
它贮藏于围绕在DNA 分子周围并与DNA 结合的蛋白质及其他化学物质中。表
观遗传信息如同RNA 基因一样令人兴奋，甚至比RNA 基因更为重要。
35. 全局调节（Global regulation system）
原核生物如细菌细胞为了适应环境条件的大范围的重要变化，单靠一个操纵子作局
部的调节显然是不够的，它还需一种能够同时调节许多相关操纵子的，特殊调节体系。这种调节体系称全局调节体系。它是由许多单一的调控途经，交织组成的一种复杂的调控网络，来应付外界环境的压力的同时，能适时快速作出反应。
36 共线性 （Collinearity ）：
所谓共线性包括如下4种不同的情况：
其一是指位于同一条染色体DNA 分子或是同一条DNA 分子上，不同基因的位置排列
关系。这种情况有时特称为同线性（Synteny ）。
其二是指不同物种的相关染色体DNA 分子之间，基因排列顺序的一致性。
其三是指位于DNA 分子与其转录本RNA 分子之间，核苷酸碱基排列顺序的一致性。 其四是指位于DNA 分子或mRNA 分子上遗传密码子的排列顺序，与相应的蛋白质多肽链上氨基酸排列顺序之间的一致性。
37. 基因工程诞生的理论基础和技术基础是什么？
（1） 理论基础：
（a ）上世纪40年代明确了遗传物质携带者是DNA ，而不是蛋白质; 明确了基因的
载体。
（b ）上世纪50年代相继揭示了DNA 双螺旋结构模型和半保留复制机理，从而解
决了基因的复制。
（c ）上世纪50 世纪末和60年代初相继提出了中心法则和操纵子学说并成地破译
了遗传密码子，从而解决了遗传信息的流向和基因表达问题。
（2） 技术基础：
（a ）DNA 分子的体外切割与连接技术;
（b ）DNA 测序技术;
（c ）基因克隆的载体的发展与应用;
（d ）大肠杆菌的转化技术;
（e ）琼酯糖凝胶电泳技术;
（f ）核酸杂交技术。
38. RNA编辑（RNA editing）：
在有些基因的转录后加工过程中，会有大量的尿嘧啶核苷酸（Us ）加入到前体mRNA （pre-mRNA ）的核苷酸序列中去，或是从pre-mRNA 的核苷酸序列中缺失下来，甚至还会发生核苷酸碱基的取代反应。结果使得RNA 转录本的核苷酸序列与其对应的DNA 链的核苷酸序列无法完全匹配。由此饰变的mRNA 翻译出来的核苷酸序列与其对应的DNA 链的核苷酸编码序列并不完全匹配。由此饰变的mRNA 所翻译的蛋白质多肽链的氨基酸序列结构，便与按照其基因的核苷酸序列推导出来的有所差别。。这种在RNA 转录本加工成熟及修饰过程中发生的核苷酸的插入、缺失或取代的现象，叫做RNA 编辑（RNA editing）。
RNA 编辑的生物学意义：（a ）引起基因可读框结构发生移动，从而翻译出新型的蛋白
质。（b ）RNA 编辑所具有校正基因移码突变的功能，为生命应对不利突变提供了一种有用的调节机理。（c ）扩充了基因的遗传信息量。（d ）RNA 编辑对中心法则是一个重要的补充。 39（1）微小RNA(microRNA，miRNA) ：
是在真核细胞中发现的一类调节型的、非编码蛋白质的、小分子量的单链RNA 。miRNA 是由内源基因组编码转录成的Pri-miRNA 被果蝇酶切割生成70-80nt 的pre-miRNA ，经自我折叠成双链的发夹结构，进入细胞质后被切丁酶进一步切割并除去单链环，形成21～25bp 双链体(miRNA：miRNA*)分子，双链体解离出单链的存留链miRNA 同目标mRNA 结合阻止翻译，另一条消失链miRNA*被降解。
39（2）miRNA 与siRNA 的比较
相似点？：
，（1） 分子结构十分相似。长度均为21～25的小分子量RNA 、 5-端都具有P 基团、
，3-端都具有0H-基团；
（2）都通过与RISC 结合的方式发挥功能作用；
（3）终极作用都是抑制mRNA 的翻译活性，而导致基因沉默。
不同点：
（1）生物合成途径不同；
siRNA主要是由外源导入的双链(dsRNA)经切割产生的、少数的是由内源dsRNA
切割产生。
miRNA则不然，它是由内源基因组编码转录成Pri-miRNA ，被果蝇酶切割生成
70-80nt 的pre-miRNA ，由于pre-miRNA 存在回文结构自我折叠成双链的发夹结构→
由输出蛋白的作用进入细胞质后被切丁酶进一步切割加工成21～25bp 小片段并除
去单链环形成双链miRNA ，双链体(miRNA：miRNA*)分子，解离出单链的存留链miRNA
同目标mRNA 结合阻止翻译，另一条消失链miRNA*被降解。
（2）抑制翻译的方式不同；
siRNA是通过与目标mRNA 编码区中的靶序列的结合引导RISC 复合物中的切段
酶，从靶序列的中间部位切割断裂mRNA 分子，从而抑制翻译。
，miRNA 与此不同，它是通过与目标基因mRNA 的 3-UTR 序列中的结合位点的序
列互补作用，促使mRNA 失去翻译活性。因此在miRNA 作用过程中，虽然目标蛋白质
的数量减少了，但其mRNA 的丰度却没有明显的变化。
（3）碱基互补水平不同；
siRNA 与靶序列之间核苷酸碱基的互补水平达百分之百的完全匹配。
但miRNA 则依材料来源的差异而有两种不同的情况。植物mRNA 与靶序列核苷酸碱基
也是百分之百完全匹配的、而动物的miRNA 与其结合位点的核苷酸碱基则不是完全
互补的，两者之间存在着若干非配对的碱基。
40. 微量碱法分离纯化质粒DNA 的原理有如下几点：
（1）根据质粒DNA 与染色体线性 DNA 在拓扑学上的差异。质粒DNA （cccDNA ）是共价闭
合双链超盘旋构型的小分子DNA ，而细胞染色体DNA 在细胞裂解分离过程中断裂成线性DNA （LDNA ），虽然在化学本质上没有本质区别，但在高级结构拓扑学上存在差异。
（2）差异碱变性，在pH 12.0-12.5高pH 条件下，线性的DNA 容易变性解链，而质粒DNA 不易变性或很少变性。
（3）酸复性，在pH4.8条件下，cccDNA 很快复性，而线性的染色体DNA 不可逆的变性并与蛋白质、RNA 形成沉淀物，通过离心可以把LDNA 与cccDNA 分开。cccDNA 在上清液中。
（4）酒精沉淀cccDNA, 以2.5倍的95% 酒精沉淀质粒DNA ，(浓度为66%沉淀最好) 。保存在TE （pH8.o ）缓冲液中，放置在－20C o 下保存备用。
41. 图示λZAP 载体的组成结构及优点：
T3-MCS- T7
___________________________＼／____________________
cos_｜ ｜ ｜ pBluescriptSK噬菌粒 ｜ ｜ ___｜
｜______｜____｜________________________｜______｜__｜cos
I LacZ T
组成结构： （1）含有具内删除特性的pBluescriptSK 噬菌粒；
（2）在pBluescriptSK 噬菌粒两端具有f1的起始子（I ）和终止子（T ）；
（3）在pBluescriptSK 噬菌粒内部具有多克隆位点MCS ；
（4）在多克隆位点的两端带有T3和T7启动子；
（5）在该载体的两端具有cos 末端。
（6）在pBluescript 的内部带有缺陷的LacZ 基因，。
λZAP 的特点：
（1）可克隆10kb 大小的外源DNA ；
（2）当外源DNA 插入取向和读码结构正确，就能表达出融合蛋白质，并可用抗体筛选；
（3）当外源DNA 插入在多克隆位点，使β半乳糖苷酶失活故可用Xgal 显色的组织化
学筛选重组子（白色为重组子）；
（4） 克隆的外源DNA 可在体内随pBluescript 噬菌粒删除下来，省去了常规的亚克隆；
（5） 利用T3或T7噬菌体的RNA 聚合酶，可方便地制备外源插入的DNA 的任何一
条链的mRNA ；
（6）可定向克隆。
＋内删除源理：当含有外源DNA 插入的重组λZAP 载体，感染大肠杆菌F 菌株，再用辅助噬菌体
M13（或f1） 超感染。于是，在细胞内由此辅助噬菌体基因Ⅱ提供的反式作用蛋白质，便会识别位于λZAp 载体上的f1起始子和终止子，并最终导致含有外源DNA 插入的pBluescript 噬菌粒在体内从λZAP 载体上删除下来。最终被辅助噬菌体M13的蛋白质包装成单链DNA 噬菌体颗粒，并被挤出寄主细胞。
42. M13克隆体系中β-半乳糖苷酶Xgal 的显色原理
M13克隆体系包括M13克隆载体和M13特殊的寄主菌株两部分组成。β-半乳糖苷(LacZ)当它为四聚体时具有活性，可把无色的X-gal 切割成半乳糖和深蓝色靛蓝，因此Xgal 可作为β-半乳糖苷酶活性的一种指示剂。由于LacZ 基因分子量太大。依据基因内互补作用的原理。利用基因工程的方法，即将编码同样的蛋白质多肽链序列，但各自具突变的序列，当这种载体转入到特殊的寄主菌株中便组成具有功能活性的多肽的生化过程。根据这一原理，在M13克隆载体上LacZ －Hind Ⅱ片段具有β-半乳糖苷酶第2-92位氨基酸，大肠杆
，菌F 因子上带有缺失了第11-42位氨基酸的缺陷性LacZ(简称M15基因) 。当M13载体感染了这种M13特殊的寄主菌株如JM101后，便会产生具有功能活性的β-半乳糖苷酶，于是在含有指示剂Xgal 和诱导物IPTG 的培养基中，就会出现蓝色的噬菌斑。但当外源基因插入到M13克隆载体时，无法形成四聚体的具活性的LacZ ，就不能切割Xgal ，故白色噬菌斑为重组子。
43. DNA标签法分离产物未知基因的原理及主要步骤
根据DNA 插入突变作用原理，用已知的插入序列为探针，分离产物未知基因的方法。由于插入的DNA 序列是己知的，人为地给目的基因加上标签 ，故称DNA 标签法。
主要步骤：（1）当一段特定的DNA 标签序列插入到野生型的基因的内部或其附近位点时，便会诱发该基因发生突变，形成突变体；（2）用已知的标签序列作DNA 分子探针，从突变体
的基因组DNA 文库中筛选出突变的基因；（3）再利用筛选到的突变基因除标签序列以外的序列作探针，再从野生型的基因组DNA 文库中筛选出目的基因。
44. 用于克隆真核基因的大肠杆菌表达体系的优点和条件
大肠杆菌表达体系的优点：
（1）背景知识清楚，分子生物学、遗传学的基础研究，特别是表达调控知识丰富；
（2）具有完善安全的基因工程体系。包括安全的寄主菌株和载体系统；
（3）早期转基因表达调控研究扎实，许多基因如胰岛素基因、生长素基因等，都能 在大肠杆菌中高效的有效表达；
（4）易工业化批量生产，培养方便、操作简单、成本低廉，特别对药用蛋白发酵生产。 实现真核基因在大肠杆菌中有效表达的条件：
（1）真核基因的编码序列必须是连续的cDNA ，因为原核细胞中不具备剪辑加工的酶；
（2）原核的启动子，最好是诱导型的强启动子；
（3）以融合蛋白质的形式表达，稳定性好。
45. 酵母 双杂交体系的原理及其用途是什么？
酵母双杂交体系简称Y2H 。这是在上一世纪90年代初，在转录因子结构的基础上
发展出来的一种敏感的体内鉴定基因的方法。可用来有效地分离与己知靶蛋白相互作 的另一种蛋白质编码基因，也是分离与某种特定启动子调控元件结合的特异性转录因子 的有效手段。
如同许多真核生物的转录因子一样，酵母β-半乳糖苷酶的转录因子GAL4也含有两个结构上可分开的、功能上相互独立的结构域，即DNA 结合域(DNA_BD)和转录激活域(AD)。应用DNA 重组技术，可以把GAL4转录因子的这两个结构域分开。如果把它们放置在同一个酵母细胞中，所产生的GAL4 DNA-BD和AD 多肽，彼此之间不会直接发生相互作用，所以不具有转录因子的功能活性，无法激活相关基因转录，。但是应用DNA 重组技术，将两个分开的GAL4的 DNA-BD和AD ，甚至分别来自两个不同的转录因子的DNA-BD 和AD 重组成一个转录因子(使之在空间上彼此靠近) 则又可重新获得转录因子的功能活性，即可激活相关基因的转录。酵母双杂交体系就是根据这种原理建立的。 酵母双杂交体系包括两种大肠杆菌-酵母菌的穿梭载体；和一种特殊的己经缺失了内源GAL4转录因子的酵母寄主菌株。
第一种穿梭载体叫DNA-BD 质粒载体：
它具有色氨酸合成酶基因、把己知的靶基因按正确的读码结构和取向插入在该载
体的多克隆位点上，便可与GAL4 DNA-BD多肽形成第一种杂种蛋白(X)。
第二种穿梭载体叫AD 质粒载体：
它具有亮氨酸合成酶基因（leu ）、是用于构建cDNA 表达文库的专用载体。克隆的
cDNA 片段按正确的读码结构和取向插入在该载体的多克隆位上（构成cDNA 文库），cDNA 编码的蛋白质便与GAL4的AD 多肽融合成第二种杂种蛋白（Y ）。
酵母寄主菌株：
将上述两种杂种质粒共转化到酵母双杂交体系专用的寄主菌株特点：（1）这种菌株
己经丧失了内源GAL4转录因子的能力；（2）具有Lac Z 和his 3的报告基因；（3）具有trp 和leu 的转化标记，即在缺少Trp 和Leu 的缺陷性培养基上无法生长的。
将共转化的酵母细胞涂布在缺少亮氨酸(Leu）和色氨酸（Trp ）的SD 培养基上，
如果由笫一种质粒表达的靶蛋白与第二种质粒表达的cDNA 文库编码的某种蛋白质
发生了相互作用，这样DNA-BD 与AD 就会在空间上彼此靠近，而且它具有色氨酸和
亮氨酸的编码基因，因此在缺陷性的选择培养上就能生长，于是便构成了有功能活
性的GAL4转录因子，从而启动下游报告基因LacZ 的表达。据此选择出蓝色阳性克
隆，有可能含有与靶蛋白相互作用的另一种蛋白编码基因。 酵母双杂交体系可以
用于产物未知基因的分离、也可用于新基因功能的鉴定。
46. 表达载体的组成：
（1）原核启动子，最好是诱导型的强启动子，使外源基因蛋白表达量占总蛋白的10-30%， 如果表达的是毒蛋白，启动子应呈现低限的基础转录水平；
（2）多克隆位点(MCS)，用于插入外源基因；
（3）抗生素抗性基因，用作选择标记；
（4）复制起点(ori)，决定外源基因的拷贝数;
（5）转录终止子，防止启动子通读作用，提高蛋白质的稳定性；
（6）翻译起始序列和翻译增强子；
（7）翻译终止子，防止核糖体的跳跃(Skipping)。采用四联核苷酸UAAU 效果更好。
47. 简述构建cDNA 克隆的定义、主要步骤及其优越性？
定义：cDNA 克隆：从mRNA 出发，经反转录、与载体分子重组、转化寄主细胞增
殖，将目的基因克隆化的过程称为cDNA 克隆。从理论上讲该生物的每一种
mRNA 都应有一个克隆。故亦称cDNA 文库
步骤：
第一步：提取处于特定发育阶段的真核生物体的特定器官或组织中的总RNA ， 根据
mRNA poly(A)尾特点过Oligo(dT)柱，分离纯化出mRNA ；
第二步：利用适当引物(一般用Oligo(dT)和反转录酶，获得 cDNA/mRNA杂合分子。 第三步：，用碱处理降解，或用RNaseH 酶切割cDNA/mRNA杂合分子中的mRNA 链获得
cDNA 第一链，再由第一链cDNA 合成第二链cDNA 。
第四步：双链DNA 与适当的载体重组，将重组体的群体导入大肠杆菌寄主细胞中增殖，
从而构成cDNA 文库。
cDNA文库的优点：（1） 以mRNA 材料出发，对于RNA 病毒特别适用；
（2） 库容量小（相当DNA 文库的15％）筛选工作量小；
（3） 假阳性比例小，因每一种mRNA 就应有一个克隆。
（4） 具特殊用途：（a ）克隆的真核基因在原核中表达需cDNA ； （b ）核苷酸序列测定；
（c ）发育过程中时空表达基因的研究分析。
48. 何为柯斯质粒载体，其结构、特点是什么？
定义：柯斯质粒载体是人工构建带有λ噬菌体的cos 位点和E.coli 质粒的复制子的新型质
粒载体。它具有质粒载体的特点和λ噬菌体的特点。
结构： （1） 具一个质粒的复制起点（ori ）；
（2）具若干来自质粒载体的选择记（1-2个）；
（3）具相当数量的来自质粒的核酸内切酶的单切点；
（4）具有λ噬菌体的cos 位点。
特点：（1）λ噬菌体的特点：（a ）导入寄主细胞后，可以重新环化起来；
（b ）经体外包装后转导效率大大提高；
（c ）无法进入溶菌周期，也不能形成噬菌体颗粒。
（2）具质粒载体特点：（a ）在寄主细胞内可像质粒DNA 一样复制；
（b ）在氯霉素作用下扩增；
（c ）具有抗生素抗性记号。
（3）具有高容量的克隆能力：上限45kb ，下限30kb ；
（4）能与带有同源序列的质粒DNA 重组。
49. 分别叙述原核基因组和真核基因组的结构特点 。
（1）原核基因组的结构特点：
（a ）高效的遗传信息利用率；
a. 既没有不必要的额外重复序列，也极少存在无功能的冗余序列；
b. 基因组９８％以上的核苷酸序列都是编码基因
c. 基因排列紧凑，同一个操纵子不同基因之间的间隔距离一般不超过 ２０
bp ，而且其中还存在着转录起始信号和终止信号；
d. 存在着编码序列彼此重叠、编码不同蛋白质的重叠基因。
（b ）双链ＤＮＡ的编码功能；
（c ）多基因聚集排列成操纵子结构形式；
（d ）染色体基因组的拷贝数平均每细胞为1.1条，在富裕培养基中可高达3～4条。
（2）真核基因组的结构特点：
（a ）包装成特定的染色体结构；
（b ）基因组的多倍性；
（c ）具有大量的重复序列；
（d ） 高比例的非编码的DNA 序列，以人为例，非编码序列占基因组总长的98%以上，
而蛋白质编码基因的序列还不到基因组总长的2%。包括基因与基因之间的非编
码的DNA 序列，以及基因内部的非编码的DNA 序列。
（e ） 庞大的基因数量；
如拟南芥：25，000个左右、水稻：40，000个左右、小鼠：30，000个左右、
人类：24，000个左右。
（f ）基因分布密度不均一。如基因分布有富集区和荒漠区之分。
50 .何为基因克隆？其主要的实验步骤
定义：基因克隆又叫DNA 克隆，它是指将外源基因插入到适当的克隆载体上，形成重组DNA 分子群体转化到大肠杆菌寄主细胞中进行复制繁殖，以便从大分子DNA 或DNA 片段中分离纯化出目的基因或特定的DNA 片段的实验操作，叫做基因克隆或DNA 克隆。
其主要步骤： （1） DNA 片段化：从实验材料分离纯化基因组DNA ，经机械方法或
酶切消化、超声波等方法获得一定长度的DNA 片段；
（2）体外重组：将片段化的DNA 与适当载体分子重组；
（3）重组子转化：将重组子转入到适当的寄主菌株中进行增殖；
（4）重组子的筛选：从大量的转化细胞中筛选阳性克隆的重组子；
（5）因的分离：用多种酶切后走凝胶电泳，并用探针进行杂交，分离出
目的基因的DNA ，并克隆在M13载体上进行测序；
（6）目的基因的表达与功能鉴定。
51. DNA 转录与复制有哪些差别？
基因的转录与复制的过程，无论在生物化学还是酶学方面都是十分相似的。它们二者都是在各自特有的核酸酶，即RNA 聚合酶和DNA 聚合酶的催化下，合成出一条与DNA 模板链互补的新的多核苷酸链。尽管如此，基因的转录（RNA 合成）和基因的复制（DNA 合成）之间，仍然存在着如下几个方面的差别：
（1）对引物需求有别 。在基因复制中，需要同时存在模板链和引物，DNA 聚合酶才能
启动DNA 新链的合成。而基因的转录则不同，它不需要引物，RNA 聚合酶便能启动RNA 新链的合成。
（2）使用的底物不一样。由于DNA 和RNA 分子的核苷酸组成成分不同，因此基因复制与转录所用的底物也不一样：前者是用脱氧核糖核苷三磷酸：dATP 、dGTP 、dTTP 、dCT P ；后者是用核糖核苷三磷酸：ATP 、GTP 、TTP 和CTP 。
（3）与模板的结合状态有异。基因的复制是按照半保留方式进行的，在新生成的两条子
代DNA 分子中，新生链和模板链始终是结合在一起的。而基因的转录则不同，新合成的RNA 链最终是要从模板上解离下来的。
－4（4）精确性程度差异悬殊。在基因的转录过程中错误参入RNA 链的核苷酸频率是10，
也就是说每参入10，000个核苷酸，就会出现一个错误（万分之一错误率）。而在基 因
－7的复制核苷酸错误参入频率是10，也就是说每参入10，000，000个核苷酸，仅出现
一次错误（千万分之一错误率）。这也就是说DNA 复制的精确度是超过转录的1000倍！
（5）涉及范围不同。基因复制往往是整个基因组从头至尾逐步进行，涉及范围包括整个基因组中的所有的DNA 和基因。而基因转录则不同，它所涉及的范围要比复制小得多，通常只是一个基因或一个操纵子。
52. 何为基因扩增，它有哪些方式？
基因扩增是指某种基因拷贝数增多的现象。
其方式有：（1）利用PCR 技术使某基因拷贝数增多；
（2）隆基因导入寄主细胞内使大量繁殖，使基因扩增(单拷贝基因可扩增到约
1x106的拷贝) ；
（3）环境压力影响使某种基因适应性的扩增；
（4）程序性基因扩增。如非洲爪蟾在形成卵发育过程中其rRNA 大量扩增；
（5）生物进化过程中的某种基因得以扩增。
53. 真核基因与原核基因表达调解机理的差异
（1）源于细胞结构水平的差异。真核细胞转录和翻译分别在细胞核和细胞质中分开进行；
没有涉及mRNA 运送过程的调节。原核细胞的转录和翻译是在细胞质中偶联发生。
（2）源于染色体结构水平的差异。真核细胞基因组被包装成染色体，存在于细胞质的有关蛋白质因子（如TF ）进入细胞核必须克服染色体的层层屏障才能与顺式元件结合。
（3）源于基因排列与结构的差异。真核基因为单顺反子，大多为断裂基因。转录后加工复杂，而原核基因为多顺反子，转录后加工也简单得多。
54. 说明mRNA 差别显示分离产物未知基因的基本原理并评述其优缺点。
答：这是建立在基因差别表达理论基础上，通过比较不同个体，或同一个体的不同组织或
不同发育阶段之间mRNA 种的差别，并应用反转录PCR 技术而发展出来的一种分离产物未知基因的方法。故又叫mRNA 差别显示反转录PCR ，简称DDRT-PCR 。
， 它的原理：根据真核基因3-端的mRNA 分子的poly （A ）尾巴如之前2位碱基，可
，把mRNA 分子分成12种类群，如1个碱基可把mRNA 分为3大类群。根据3-端的
，锚定引物，和5-端设计随机引物。从数理统计推算和实验经验，3种锚定引物和80
种随机引物(3×80＝240）240组合大体上涵盖95%的mRNA 。用此种方法可以分离到产物未知的真核基因。
它的优点：（1）简单方便，由于使用PCR 扩增和序列胶电泳技术，故简单快捷；
（2）灵敏度高，实验利用了PCR 技术、序列电泳技术和同位素自显影技
术，故具极高的灵敏度；
（3）多用性，可同时比较多个样品间的基因表达差异。④直观性，其每个
步骤均可被直观地检测。
mRNA 差别显示缺点：（1）假阳性比率高；
（2）扩增的片段分子量较小；
（3）工作量大。
55. 影响酶切反应的因素：
答：（1）DNA 分子的性质：（a ）. 酶切位点周围的碱基成分；
（b ）酶切位点的密度；
（c ） DNA 分子的构型；
（d ） DNA 分子的甲基化程度。
（2）酶切的温度；
（3）DNA 制剂的纯度。
56. 产生酶切星号活性的因素：
（1）每μg 样品酶切的用量不得超过10单位；
（2）酶切反应体系中的甘油浓度不得超过5%；
（3）其他金属离子取代二价Mg ；
（4）金属镁离子不得低于25mmol/L；
（5）pH 不得超过8；
（6）样品中有机溶剂污染的影响。
57. 一种基因产生多种蛋白质的原因分析
答：主要原因：
（1）许多基因都拥有多个启动子。在人类基因组中，至少有一半以上的基因都具
有多个启动子。在真核断裂基因的转录过程中，可变启动子的使用常常涉及到位于
转录起点的可变首位外显子（alternative first exon）。可变启动子的不同成员，驱动从相应的可变首位外显子开始转录反应。已经对有些基因的可变首位外显子作
了全阵列（whole arrays）分析，结果证明每个可变首位外显子都具有一个自身专
有的启动子。可变的首位外显子的不同产生的蛋白质产物不同；
一种基因产生多种蛋白质的原因之一多启动子的图
（由韩晓燕（农加所）和畜牧所化朝举）
化朝举（畜牧所）
韩晓燕（农加所）
（2）初级转录本的可变剪接可产生多种蛋白。可变剪接（alternative splicing ）又
称为差异剪接（differential splicing）或可变mRNA 剪接。这是指真核断裂基
因初级转录本，在不同类型的或处于不同发育阶段的细胞中发生的不同形式的剪
接作用。结果生成具有不同序列结构特征、并编码不同蛋白质异形体的成熟的mRNA
分子。因此说，可变剪接可以使同一个基因的初级转录本，最终翻译出多种不同
功能的蛋白质分子。以果蝇Dscam 基因为例，可形成38016种蛋白质异形体。
可见可变剪接是造成一种基因多种蛋白质现象的另一种重要原因。
次要原因：
（3）RNA 的编辑；致使mRNA 分子核苷酸序列的结构出现了变化。此种RNA 编辑具有
多种不同的效应，诸如产生出新的起始密码子、终止密码子或是造成多肽链编码
序列出现变化。因此，RNA 编辑的结果，改变了源自基因DNA 模板链的遗传信息，
翻译出不同于基因原来编码的新的蛋白质多肽。
（4）基因重排均可产生不同的蛋白。由于基因区段转位作用或随机连接造成的基因可变
区固有排列顺序的改变的基因重排（gene rearrangement）或DNA 重排，可使基因
产生不同的蛋白。
58. 基因工程的三个主要优点：
第一，具有跨越天然物种屏障的能力，可以把来自不同物种的DNA （基因）转移到与其毫无亲缘关系的新寄主细胞中进行复制与表达。这意味着应用基因工程技术有可能按照人们的主观愿望和社会需求，创造出自然界原本并不存在的新的生物类型。
第二，能够使特定的DNA 片段或目的基因在大肠杆菌寄主细胞中大量扩增。如此人们便
能够制备到大量纯化的特定DNA 片段或目的基因，从而极大地促进了有关基因分子遗传学的基础研究工作。
第三，确立了反向遗传学（reverse genetics ）研究途径。传统遗传学是根据生物个体的表
型特征去探究其相应的基因型的结构，人们习惯上称这样的遗传学研究途径为正向遗传学（forward genetics）。随着分子遗传学尤其是重组DNA 技术的发展与应用，科学工作者已有可能通过配合使用基因克隆、定点诱变（site-directed mutagenesis）、PCR 扩增及转基因等各项技术，首先从基因开始研究其核苷酸序列特征、蛋白质产物的结构与功能，进而根据人们的需求对基因进行修饰改造，然后再返回到生物体内观察其生物学活性与表型特征的变化。为与传统的正向遗传学相区别，人们称这样的遗传学研究途径为反向遗传学。
59. 生命体的遗传信息的三个层次：
第一个层次由基因组DNA 中编码蛋白质的基因构成。已知在人类基因组中，此类基因所占的比例还不到全部DNA 序列的2%，然而它对于生命活动的重要性已经是众所周知的事实。
第二个层次仅含有非编码的RNA （non-coding RNA,ncRNA）基因，主要包括rRNA 基因、tRNA 基因、snoRNA 基因以及miRNA 基因和siRNA 基因等。这类RNA 基因存在于基因组DNA 广袤的非编码蛋白质的序列中（详见第二章）。如同蛋白质编码基因一样，RNA 基因在生命过程中的作用也是不可或缺的。
第三个层次为表观遗传信息层（epigenetic layer of information）。它是贮藏于环绕在DNA 分子的周围、并同DNA 相互结合的蛋白质及其他化合物当中。尽管目前我们对于表观遗传信息层的功能效应尚不十分清楚，但有大量的报告提示它对于生命体的作用，可能比RNA 基因信息层还要重要。I
60. RNA 的主要功能：
第一， RNA 在蛋白质合成过程中起着关键性的作用。主要的参与者有mRNA 、rRNA 和
tRNA 三种，其中mRNA 是遗传信息从DNA 转移到蛋白质多肽链的中间媒介，
既是DNA 的转录本又是指导蛋白质多肽链合成的模板；rRNA 具有组装者
（assembler ）和催化剂的双重功能；tRNA 起着转运和信息衔接子（adaptor ）
的作用。
第二， RNA 分子具有支架（scaffold ）功能。由于RNA 分子可以起到支架或构架
(framework)的作用，而蛋白质多肽又能够识别RNA 一级核苷酸序列以及二级或
三级的结构基序。因此，依赖于RNA 支架，蛋白质分子便能够组装成具有特定功
能的RNA-蛋白质复合物。例如信号识别颗粒（signal recognition
particle,SRP ），便是一种与新生蛋白质的信号肽序列相互作用的、依赖RNA 提
供的支架基础组装而成的RNA-蛋白质复合物。
第三， RNA 具有催化功能。一类被称为核酶的特殊物质，是一种具有核酸内切酶活性、
可切割特异性RNA 序列的复杂的RNA 分子。亦即是一种高度特异的、能够自我
剪接的RNA 序列。它能够催化在胞内发生的许多生化反应，包括核酸复制、mRNA
自我降解、tRNA 加工、pre-mRNA 的剪接以及蛋白质合成等过程。例如在核糖
核酸酶P （RNase P）和核糖体颗粒中，起催化作用的部分都是RNA 而不是与之
结合的蛋白质。
第四， 小RNA （small RNA ）能够参与基因表达调节。这方面的内容涉及不同形式的
RNA 折叠、核糖开关（riboswitches ）、RNA 干扰（RNAi ）以及微RNA （micro
RNA,miRNA ）等的调节作用。
第五， RNA 可以是遗传物质。地球上绝大部分生命体的遗传物质都是DNA ，但也有许
多病毒的遗传物质是RNA 而不是DNA 。这类RNA 病毒基因组也可以通过DNA
形式的中间体进行复制，维持遗传信息代代稳定相传。
61. 蛋白质的主要功能：
（1）有些蛋白质具有催化功能。这类蛋白质统称酶蛋白，能够参与生命体所必需的数量
庞大、类型繁多的生化反应，并能引起新陈代谢的变化。所以普遍认为具有酶催化活性是蛋白质最主要的属性。没有酶，生命也就不可能存在。
（2）有些蛋白质具有支架功能。其主要作用是用以维持细胞的形态，并参与肌肉及器官
的形成。支架蛋白（scaffold protein）常含有数个不同的组件，它可识别其他蛋白质的有关结构元件并与之结合，形成多蛋白的复合物。
（3）有些蛋白质具有调节功能。这类蛋白质叫做调节蛋白（regulatory protein），它可
通过同DNA 或RNA 分子中特定序列的结合，调节基因的表达活性及其他细胞活性。转录因子可看作是一类典型的调节蛋白，基因的差异表达及其时空特异性表达活性，均与转录因子的功能作用密切相关。
（4）有些蛋白质具有信号传导功能。这类蛋白质负责细胞信号传导。例如哺乳动物胰腺
组织细胞分泌的胰岛素（一种主要的动物激素），能够把信号传导给肌肉细胞和肝脏细胞，促使它们从血液中吸收葡萄糖。当然一些常见的植物激素诸如植物生长素、细胞激动素、赤霉素和脱落素等，亦能通过多种类型的相互作用，以复杂的方式参与信号传导。
（5）有些蛋白质具有物质运送功能。这类蛋白质叫做转运蛋白（transport protein）。
例如在人体血液循环系统的红细胞中，含有大量的血红蛋白（hemoglobin ），能够将其在肺部结合的氧，运送到身体的各个部位，供生命活动需要。还有肌红蛋白（myoglobin ），能够在肌肉细胞的线粒体中，为氧化作用运输氧。
（6）有些蛋白质具有运动功能。这类蛋白特称马达蛋白（motor protein）。肌肉收缩和
细胞游动是蛋白质具有运动功能的两个典型事例。肌动蛋白和肌球蛋白，是构成细胞收缩系统的两种主要成分，其他的如微管蛋白、动力蛋白及驱动蛋白也都属于运动蛋白之例。
（7）有些蛋白质具有贮存功能。卵清蛋白、酪蛋白及菜豆蛋白等是主要的生命体贮存蛋
白（storage protein），在必要时可为生长发育提供足够的氮源。例如在鸟类中，由卵清蛋白为胚胎发育提供氮源；哺乳动物乳汁中的酪蛋白，可满足其幼仔发育对氮源
的大量需求；高等植物种子中的贮存蛋白，可为发芽供给足够的氮源。
（8）有些蛋白具有建造和维持生命体结构的功能。这类蛋白质称为结构蛋白(structural
protein ），主要包括α-角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白及蛋白聚糖等多种。其中α-角蛋白是构成动物毛发、角、蹄、甲等组织的主要成分，而胶原蛋白则是存在于骨骼、肌腱、韧带和表皮中的一类结构蛋白。
（9）有些蛋白质具有防护的功能。诸如免疫球蛋白、血液凝固蛋白、凝血酶和血纤蛋白
原等，都是常见的防护蛋白。其中最突出的是免疫球蛋白，亦即是所谓抗体。它是脊椎动 物免疫系统B 淋巴细胞产生的多功能。
62. 内含肽、外显肽及蛋白质剪接：
有些前体蛋白质多肽链内部，存在一种临时性的肽段或称间插序列（intervening sequence ）。在蛋白质翻译后加工过程中，这些内部肽段经过非酶催的转肽反应被剪除掉，而其两侧的多肽段便会连接成为具功能活性的成熟的蛋白质多肽。这种新近发现的蛋白质翻译后加工的方式，称为蛋白质剪接（protein splicing ）。其中被剪除掉的内部肽段称为内含肽（intein ），而被保留在成熟蛋白质中的两侧肽段称为外显肽（extein ）。
63. 安慰诱导物（Gratuitous induccer）：
是一种能够诱导细胞合成某种特定的蛋白酶，而它自己却不是该酶的作用底物的特殊物 质。因此安慰诱导物是一种不发生代谢变化的诱导物。例如IPTG 即是β-半乳糖苷酶的一种安慰诱导物。
64.M13载体系列的优点
（1）可以十分方便地分离任何特定的单链DNA 序列，克隆在M13RF DNA分子上的外源
DNA 片段，到了子代噬菌体便形成单链形式，故可制备单链DNA 。
（2）重组子化学检测。M13载体上有一条饰变的β-半乳糖苷酶基因片段，可以与相应寄
主产生α-互补作用，形成有活性的β-半乳糖苷酶，故可用X-gal 及IPTG 进行组织化学检测筛选重组体分子。
（3）lacZ 基因上具有一段多克隆序列因此便于外源DNA 片段的插入与克隆。
（4）可定向克隆。在M13mp 克隆载体上的多克隆位点的顺序是已知的，因此经两种不
同限制酶消化的DNA 的插入方向，便可据判断出来。
66. 丝状噬菌体展示技术
当外源基因插入到单链丝状噬菌体基因组之基因Ⅷ或基因Ⅲ的3'端编码序列中，在两
者读码结构保持一致的情况下，外源蛋白质或多肽，便会以融合蛋白质的形式表达，于是融合在外壳蛋白N 端的外源多肽(或蛋白质) 便被展示在噬菌体颗粒的表面上。根据这种事实，1985年G . P. Smith 建立了一种专门在丝状噬菌体颗粒表面表达蛋白质或多肽的所谓噬菌体表面展示技术简称为（phage display）噬菌体展示技术。
67. 噬菌体展示载体(phage display vectors)
根据在丝状噬菌体表面表达蛋白质或多肽的噬菌体表面展示技术，发展.
而来的一类
具有特殊用途的噬菌体载体叫做噬菌体展示载体。当外源基因插入在该载体的Gene Ⅲ或Gene Ⅷ编码序列中，并在两者保持正确读码结构的情况下，就会产生出融合蛋白质。
68. 噬菌粒展示载体：
是将噬菌体的基因间隔区（含有控制噬菌体DNA 复制和包装的全部顺式元 件），插入质粒载体而发展出来的展示载体。
噬菌粒分子量小，易于操作，转化效率高，适于构建大型文库。然而由于噬菌粒不含有噬菌体的复制与组装基因。因此，需要辅助噬菌体提供相应功能。
69. pBluescript噬菌粒载体的结构特征
pBluescript KS(+/-)或pBluescript SK(+/-)
SK 表示多克隆位点区的一种取向，即lacZ 基因是按照SacI →KpnI 方向转录的。 KS表示多克隆位点区的另一种取向，即lacZ 基因是按照KpnI →SacI 方向转录的。 (+/-)表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反取向。
70. pBluescript噬菌粒载体的用途
pBluescript 噬菌粒载体在基因工程及分子生物学研究中用途广泛，主要的有如下几点：
（1）制备同位素标记的DNA 杂交分子探针：基因文库或cDNA 文库筛选；Southern
杂交及Northern 杂交。
（2）制备克隆基因的转录本
（3）合成克隆基因编码的蛋白质
71. 辅助噬菌体(helper phage)
协助相关的克隆载体，并与之一道进入寄主细胞，并为克隆载体的复制提供所需核酸酶及其它蛋白质(如包装用的外壳蛋白质) ，这样的噬菌体称辅助噬菌体。复制蛋白质同突变的复制起点结合，尽管复制效率有限，但仍可产生出足够量的复制噬菌体，保证其自身遗传的稳定性。
72. 影响噬菌粒单链DNA 产量下降的可能因素
许多噬菌粒在辅助噬菌体感染后，有时其单链DNA 的产量较低，且重复性也差。只相当于带有同一外源DNA 区段的丝状噬菌体载体的病毒颗粒产量的1/100-1/10，其影响因素可能是：
（1）噬菌粒携带的基因间隔区的确切序列
携带完整基因间隔区的质粒，由于干扰了辅助病毒DNA 的复制，从而抑制了子代噬菌体颗粒的产生。
（2）基因间隔区插入质粒的具体位置
基因间隔区插入pBR322 HindⅢ位点所构成的噬菌粒，会严重干扰野生型噬菌体的生长，而将之插入Aha Ⅲ位点的效果则不然。
（3）辅助噬菌体的性质
野生型丝状噬菌体及其抗干扰突变株都被用作辅助噬菌体：一般说来，外源DNA 片段越大，产量也就越低。
73. 终止子（terminator ）和终止区（terminator region）
（1）终止区的定义：原核蛋白质基因终止区也叫做终止序列，相当于真核基因的终止
子。这是一段专指位于操纵子（或说是转录单位）3’-末端转录终止位点之后的一段核苷酸序列。
（2）终止区的功能：是为RNA 聚合酶提供转录终止信号，促使其停止对操纵子编码基因的转录作用，并从其结合的DNA 分子上解离下来。
（3）真核基因的终止子，指位于mRNA 转录终止位点下游的一段DNA 序列区，亦叫做3’
下游序列区，或3’-侧翼序列。
（4）终止子的信号： （a ） 转录终止作用信号；（b ） mRNA 3’-末端加工信号；（3）
大多数真核基因3’-末端还具有poly （A ）加尾信号，即多聚腺苷酸化信号。
74. 整合作用（Integration ）与参入作用（Incorporation ）
（1）整合作用也称为DNA 插入作用（insertion ）。它是一种DNA 的重组方式，系指小
分子量的DNA 分子（如λDNA ）组入到大分子量的DNA 分子（例如E.coli 染色体DNA ）的过程。噬菌体DNA 组入细菌染色体DNA 的过程，叫做噬菌体DNA 的整入或插入。
（2）参入作用：一般是指单核苷酸分子组入新合成的DNA 链或RNA 链的过程。例如在
DNA 裂口转移或PCR 反应过程中，游离的核苷酸分子按照碱基配对原则，组入新合成DNA 链的过程。
75. 超感染免疫性（Superrinfection inmunity）
（1） 定义：亦叫再感染免疫。有如下两种不同的情况：
（a ）溶源性细菌不能被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染的现象，称为超感染免疫性；
（b ） 两种完全相同或结构上极为相近的不相容性质粒，不能在同一细胞中共存的现象，叫做超感染免疫性。
77. 黏性末端位点
（a ）λ噬菌体的黏性末端位点（cohesive-end site）简称cos 位点。系指在λ噬菌体
线性双链DNA 分子两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5' 单链突出的序列，即黏性末端。在体内由此黏性末端结合形成双链区段称为cos 位点，它系英语cohesive-end site的缩写略语，意即黏性末端位点。
（b ） cos末端（cos ends）
λ噬菌体DNA 的cos 位点经末端酶的切割形成的具12个核苷酸碱基的单链延伸末端，叫做cos 黏性末端，简称cos 末端。在体内cos 末端可以彼此配对，使线性的λDNA 重新环化起来：
5'-----GGGCGGCGACCT-----3'
3'-----CCCGCCGCTGGA-----5'
一78. Spi正选择的λ噬菌体载体
野生型的不能够在P2噬菌体溶源性的细菌中生长亦即对P2噬菌体的抑制作用呈敏感
十（sensitiVe tO P2 inhibition）故表型为Spi 。
一可见，Spi 表型给我们提供了选择重组体分子的一种正选择标记。
十Spi 表型：不能够在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌细胞中生长，为非重组体分子；
一Spi 表型：能够在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌细胞中生长。即其red 和gam 基因被
外源DNA 片段取代，为重组体分子。
79. 柯斯质粒载体（cosmid vector）
一类人工构建的含λ噬菌体DNA 的cos 序列和大肠杆菌质粒复制子的特殊类型的质粒载体。其DNA 可以在体外被包装到噬菌体倒外壳内。
柯斯质粒载体的特点：
( 1）具有λ噬菌体的特点
a 导入寄主细胞后，其DNA 分子可以重新环化起来；
b 经过体外包装之后，可以高效地转导敏感的大肠杆菌寄主细胞；
c 无法进入溶菌周期，无法形成子代噬菌体。
（2）具有质粒载体的特点：
a 具有质粒的复制子，可在寄主细胞内像质粒一样进行复制；
b 可在氯霉素作用下扩增；
c 具了抗菌素抗性记号。
（3）具有高容量的克隆能力
（4）能够与带有同源序列的质粒发生重组作用
80.控制真核基因表达调节的主要方式：
（1）基因重排的调节方式；
（2）基因扩增的调节方式；
（3）基因调节蛋白质的转录调节方式；
（4）RNA 加工的调节方式；
（5）核质mRNA 转的调节方式；
（6）mRNA 稳定性的调节方式；
（7）mRNA 翻译的调节方式。
81.真核基因表达调节的主要特点：
（1）真核生物与原核生物在基因表达调节方面的相似性：已知有不少在大肠
杆菌中出现的调节机理，原则上也适用于真核生物，例如：（a ） 两者的转录调节，都是通过DNA 结合蛋白质，同基因启动子中的特异性顺式元件的结合作用进行的。（b ）两者DNA 结合蛋白质的多肽基序，在序列结构上也是相同的.
（2）真核生物与原核生物在基因表达调节方面的差异性：（a ） 真核生物细胞
类型的多样性，与原核相比，特别高等植物与动物，都具有数百种功能各异的不同细胞类型；（b ）真核生物具有细胞核结构，因此基因的转录和翻译是分别在细胞核与细胞质中分步进行的；（c ）真核生物具有庞大的基因组 ，其长度要超过原核的700多倍；（d ）真核生活物基因拥有大量的各种类型的基因，其总数可达数万种，相当原核生物的20多倍.
（3）真核基因表达调节方面与原核基因相比其复杂性或特殊性：（a ）发育调节,
基因表达的发育阶段性调节，器官和组织特异性调节；（b ）分化调节，同一受精卵究竟是如何分化出各具特定功能和形状态特征的不同类的组织、器官和细胞？；（c ）表达顺序性，复杂的多细胞生命体中，不同基因表达的顺序性的调节机理；（d ）同一生命个体中，不同细胞之间的生命活活动被此之间的协调和相对稳定性是息怎样维持的? ；（e ）选择性表达，相同基因组为什么在红细胞前体中会选择性表达编码血红蛋白的基因，而在胰腺细胞中却是选择性表达胰岛素的基因。此种精确控制基因差异表达的分子机理又是如何解释的呢？。
1、原核细胞与真核细胞基因表达调控最明显的区别在哪里？
2、反式作用因子与顺式作用元件物质本质是什么？顺式作用元件与反式作用因子的分子机理如何？
简述转基因动物的概念及研制转基因动物的主要方法。
简述转基因动物在生物学研究中的应用前景。
中国科学院究生院
《基因工程原理》复习题（2）
1. 原核基因（Prokaryotic gene ）：由原核生物（如大肠杆菌）基因组编码的基因，以及高等生物细胞器线粒体基因组和叶绿体基因组等编码的基因，统称原核基因。
2. 真核基因（Eukaryotic gene）：真核生物基因组染色体DNA 编码的基因, 以及感染了真核细胞的DNA 病毒和反转录病毒基因组编码的基因，统称真核基因。
3. . 前导序列（Leader sequence ）：又叫前导序列区或5' -非翻译区（5' -UTR ），，系指位于mRNA5' -起始密码子之前的一段长数百个核苷酸的不翻译的RNA 区段。
4. 尾随序列（Tai1er sequence ）：又称尾随序列区或3' -非翻译区（3' -UTR ），系指位于mRNA3' -终止密码子之后一段100多核苷酸的不翻译的RNA 区段。
5 复制子（Replicon ）和复制因子（Replicator ）：
复制子（Replicon ）：系指有一个复制起始位点的DNA 或RNA 复制单元。例如细菌染色体、病毒基因组、质粒基因组等，凡其DNA 能够进行复制的遗传单元，均称复制子。真核细胞基因组的复制子特称复制单元。
复制因子（Replicator ）：又叫复制区，系复制子的一个组成部分。在质粒分子中，指一个特定的DNA 区段。它含有质粒复制起点（ori ）和编码质粒复制所需蛋白质的DNA 序列结构。
6. . 增强子 （Enhancer ）：又叫增强子序列或增强子元件，是真核基因中发现的一种特异序列，能够在距离目标基因50kb 以上的位置，从上游或下游的不同位置及方向增强该基因的转录活性。
7. 沉默子（Silencer ）：在真核基因启动子中除了增强子之外，沉默子同样也是一种可远距离调控相关基因转录活性的顺式元件。与增强子一样，沉默子也能够从启动子的上游、下游甚至是基因内部三种不同的位置以及正向或反向，影响相关基因启动子的转录起始效率。同时沉默子往往是以组织特异性或时间特异的作用方式，控制基因的表达作用。但与增强子的功能效应相反，沉默子只能抑制而不能激活相关基因的转录起始活性。
8. 绝缘子（Insulator ）：亦即是增强子活性的物理边界元件（physical boundary element ），它是一段能够抑制或隔离增强子功能效应的顺式转录调节序列。绝缘子的这种功能作用的发挥，取决于它所在的位置。如果它是位于增强子和启动子之间，便能够阻断增强子的功能效应；但当它是位于增强子-启动子区段的外侧，便不能够阻断增强子的功能作用。因此也有的作者将绝缘子称为隔离邻近增强子对启动子激活作用的中间隔栅（neutral barrier）。绝缘子的作用是与特异结合蛋白IBP 的结合发挥作用。它的意义：能阻断增强子超远距离的激活作用影响生物的发育顺序；真核绝缘子能保护顺序表达以防无义基因的表达。
9. 调节子（Regulon ）：指在大肠杆菌基因组中，其表达活性受同一种基因编码的蛋白质协同调节的，一组不连续相邻排列的结构基因。调节子与操纵子不同之处在于，后者的结构基因是彼此相邻排列的，而调节子的结构基因则是分散于染色体的不同部位，甚至是位于不同染色体上
10. 基因差异表达（Differential expression of gene ）： 真核生物在每一特定的发育阶段，或是某一特定类型的细胞中，一般只有15%的基因进行表达。这种在生物个体发育的不同阶段，或是在不同组织和细胞中，发生不同基因按时间、空间进行有序表达的方式，叫基因的差异表达。
11. 基因内互补（Intragenic complementaion）：
系指编码同样的多肽序列，但又各具一个不同 突变的两个基因联合产生出一种有功能活
性的蛋白质多肽的生化过程。
12. 基因图（Gene map ）：描述染色体或DNA 分子上不同基因的排列顺序及其间隔距离的
线性图。它包括遗传图和物理图两种。
遗传图（genetic map ）：是根据遗传重组实验绘制的，用来表示同一染色体上不同基因
（或特定DNA 序列区）之间的排列顺序及其相对距离的线性图。其图距用厘摩(cM)
表示。
物理图（Physical map）：以精确的物理长度为单位，一般以核苷酸数表示不同基因在染
色体或DNA 分子上的排列顺序及其间隔距离的实际长度的线性图。
13. 基因簇（Gene cluster）与基因家族（Gene family）：系指原核生物基因组中，由不同或
相关的一组相合基因组成的一种特殊的排列组合方式。同一基因簇的各个基因在遗传
上往往是紧密连锁，它们可以是属于同一操纵子的不同结构基因，也可以是不同操纵
子的不同结构基因；它们可以是同一基因家族的不同成员，也可以是不同基因家族的
不同成员。
基因家族（Gene family：由同一生物中同一始祖基因经过重复突变进化而来，具相似的
结构、相似的产物和相似的功能。它们的特征：（1）多重姓；（2）紧密连锁（3）表型
及功能方面的相关性；（4）核苷酸序列的一致性。
14. 基因克隆（Gene cloning）：
基因克隆又叫DNA 克隆，它是指将外源基因插入到克隆载体上形成重组DNA 分子群
体，并转化到大肠杆菌寄主细胞中进行复制繁殖，以便从大分子DNA 或DNA 片段中
分离纯化目的基因或特定的DNA 片段的实验操作，叫做基因克隆或DNA 克隆。
15. 融合基因（Fusion gene）：
亦称重组基因、杂种基因或嵌合基因。通常是指通过自发突变形成或利用DNA 重组技
术构建的。是一类具有来自两个或两个以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。融合基
因可以形成融合蛋白，但融合基因不一定都形成融合蛋白。
16. 基因剂量 （Gene dosage）：
指的是一个细胞所拥有的同一种基因的拷贝数。基因剂量实验是建立在局部二倍体菌株
的基础上，专门来检测基因拷数的增加，对其编码产物合成速率之影响的分子遗传学的
研究技术。
17. 缺口（Gap ）：双链DNA 分子上的某一条链丢失一个或连续数个核苷酸造成的单链断
裂。
裂口（Nick ）：双链DNA 分子的某一条链的相邻核苷酸之间丢失一个磷酸二酯键造成的
单链断裂。
18. 切丁酶（Dicer ）：
亦有人译为RNAi 核酸酶。是一种RNase Ⅲ样（RNase Ⅲ like ）的核酸内切酶。能把双链RNA
（dsRNA ）分子切割成21~23bp的小分子干扰RNA 。这是一种需要A TP 的过程。
19. 异裂酶（Neoschizomer ）：
指一组来源不同，但具有相同的识别序列和不同的切割位点的一组核酸内切限制酶称异裂
酶
20. 同尾酶（Isocaudarner ）：
一组来源不同，识别序列各异，但能够切割形成相同黏性末端的核酸内切酶。
21. 同裂酶 (Isoschizomer)：
是一类来源不同，而识别序列相同，切割能产生相同的黏性末端的核酸内切酶。
22. 拓朴异构酶（T0poisomerase ）：
在原核和真核细胞中发现的，具有催化单链DNA 或双链DNA 产生瞬时断裂的功能。
具有切割与连接的双重功能，导致双链构型的改变。在抗癌研究中，发展抑制拓扑异构
酶的活性的抗癌药物好的开发研制具有重要意义。
23. 质粒DNA 迁移作用（Plasmid mobilization）：
指由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程。由于结合型质粒的mob 基因产生的迁移蛋白可作用于与其共存的非迁移型质粒的nic 位点所产生的迁移作用，称质
粒DNA 迁移作用。
24. 柯斯载体（Cosmid ）：
是一类人工构建的，含有λ噬菌体DNA 的cos 序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。它既具有λ噬菌体的特性，也具有质粒载体的特性。并且具有高容量的克隆能力，其DNA
可以体外被包装到噬菌体的外壳内。
25. 噬菌体展示载体（Phage display vector）：
根据单链噬菌体表面表达的蛋白质或多肽的噬菌体表面展示技术，当把外源基因插入在该载体的基因Ⅲ或基因Ⅷ的编码序列中，正确表达出融合蛋白的这类特殊用途的噬菌体
载体。
26. 穿梭质粒载体（S huttle plasmid vector）：
简称穿梭载体，或叫双功能载体。是一类人工构建具有两种不同的复制起点和选择记号，因而可在两种不同寄主细胞（如大肠杆菌和酿酒酵母）中进行复制与存留的质粒载体。
27. M13克隆体系的优点：
（1）可方便地产生外源单链DNA ；（2）重组子可用组织化学方法检测；（3）lacZ 基因上具多克隆位点，便于外源DNA 插入；（4）可定向克隆外源基因。
28. 质粒载体的结构特点：
（1）具复制起点（ori ）；（）具抗生素抗性基因（选择用）；（3）具若干核酸内切酶的单切点；（4）较小的分子量和较高的拷贝数。
29 启动子封堵（Promoter occlusion）：
由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制的现象，叫做启动子封堵。
30. Ⅱ型核酸内切酶的特点：
（a ）不具有多亚基结构（单一切割功能）；（b ）能识别双链DNA 分子中靶子序列；（c ）切割形成
不同长度的限制片段; （d ）由于不对称切割，能形成粘性末端；（e ）酶切反应不需能量A TP 。
31. 表观遗传信息层（Epigenetic layer of information）：
它是贮藏在围绕DNA 分子周围并与DNA 分子结合的蛋白质及化学物质中。表观遗传信息如同RNA 基因一样令人困惑，甚至比RNA 基因更为重要。
32. 分子伴侣（Molecular chaperone）：
专指一类多功能蛋白质，它能促使某些蛋白质按正确方式组装或折叠，而它本身却不是最终形成功能蛋白质的组成部分，此类蛋白质特称为分子伴侣。
33. RNA干扰（RNAi ）：
近年来研究发现，当一些小分子量的外源双链RNA 进入寄主细胞后，便可促进与其同源的内源mRNA 发生特异性的降解作用，从而高效而特异地阻断体内相应基因的活性，
在细胞内发挥基因的剔除作用。这种现象叫RNA 干扰。
34. 生命有机体遗传信息的三个层次是：
第一层次是由编码蛋白质的基因组成，如人类基因组的基因编码序列占总DNA 序列的
不到2%；
第二层次：仅由编码RNA 而不编码蛋白质的基因组DNA 组成。这一部分DNA 叫做非编码
的DNA ，它的转录产物称为非编码的RNA （不包括tRNA 、rRNA 和snoRNA ），
其相应的基因称为RNA 基因。这类基因隐藏在巨大的非编码的染色体DNA
序列当中。因此过去亦被称为隐藏基因（cryptic gene）；
第三层次：表观遗传信息层（epigenetic layer of information）。
它贮藏于围绕在DNA 分子周围并与DNA 结合的蛋白质及其他化学物质中。表
观遗传信息如同RNA 基因一样令人兴奋，甚至比RNA 基因更为重要。
35. 全局调节（Global regulation system）
原核生物如细菌细胞为了适应环境条件的大范围的重要变化，单靠一个操纵子作局
部的调节显然是不够的，它还需一种能够同时调节许多相关操纵子的，特殊调节体系。这种调节体系称全局调节体系。它是由许多单一的调控途经，交织组成的一种复杂的调控网络，来应付外界环境的压力的同时，能适时快速作出反应。
36 共线性 （Collinearity ）：
所谓共线性包括如下4种不同的情况：
其一是指位于同一条染色体DNA 分子或是同一条DNA 分子上，不同基因的位置排列
关系。这种情况有时特称为同线性（Synteny ）。
其二是指不同物种的相关染色体DNA 分子之间，基因排列顺序的一致性。
其三是指位于DNA 分子与其转录本RNA 分子之间，核苷酸碱基排列顺序的一致性。 其四是指位于DNA 分子或mRNA 分子上遗传密码子的排列顺序，与相应的蛋白质多肽链上氨基酸排列顺序之间的一致性。
37. 基因工程诞生的理论基础和技术基础是什么？
（1） 理论基础：
（a ）上世纪40年代明确了遗传物质携带者是DNA ，而不是蛋白质; 明确了基因的
载体。
（b ）上世纪50年代相继揭示了DNA 双螺旋结构模型和半保留复制机理，从而解
决了基因的复制。
（c ）上世纪50 世纪末和60年代初相继提出了中心法则和操纵子学说并成地破译
了遗传密码子，从而解决了遗传信息的流向和基因表达问题。
（2） 技术基础：
（a ）DNA 分子的体外切割与连接技术;
（b ）DNA 测序技术;
（c ）基因克隆的载体的发展与应用;
（d ）大肠杆菌的转化技术;
（e ）琼酯糖凝胶电泳技术;
（f ）核酸杂交技术。
38. RNA编辑（RNA editing）：
在有些基因的转录后加工过程中，会有大量的尿嘧啶核苷酸（Us ）加入到前体mRNA （pre-mRNA ）的核苷酸序列中去，或是从pre-mRNA 的核苷酸序列中缺失下来，甚至还会发生核苷酸碱基的取代反应。结果使得RNA 转录本的核苷酸序列与其对应的DNA 链的核苷酸序列无法完全匹配。由此饰变的mRNA 翻译出来的核苷酸序列与其对应的DNA 链的核苷酸编码序列并不完全匹配。由此饰变的mRNA 所翻译的蛋白质多肽链的氨基酸序列结构，便与按照其基因的核苷酸序列推导出来的有所差别。。这种在RNA 转录本加工成熟及修饰过程中发生的核苷酸的插入、缺失或取代的现象，叫做RNA 编辑（RNA editing）。
RNA 编辑的生物学意义：（a ）引起基因可读框结构发生移动，从而翻译出新型的蛋白
质。（b ）RNA 编辑所具有校正基因移码突变的功能，为生命应对不利突变提供了一种有用的调节机理。（c ）扩充了基因的遗传信息量。（d ）RNA 编辑对中心法则是一个重要的补充。 39（1）微小RNA(microRNA，miRNA) ：
是在真核细胞中发现的一类调节型的、非编码蛋白质的、小分子量的单链RNA 。miRNA 是由内源基因组编码转录成的Pri-miRNA 被果蝇酶切割生成70-80nt 的pre-miRNA ，经自我折叠成双链的发夹结构，进入细胞质后被切丁酶进一步切割并除去单链环，形成21～25bp 双链体(miRNA：miRNA*)分子，双链体解离出单链的存留链miRNA 同目标mRNA 结合阻止翻译，另一条消失链miRNA*被降解。
39（2）miRNA 与siRNA 的比较
相似点？：
，（1） 分子结构十分相似。长度均为21～25的小分子量RNA 、 5-端都具有P 基团、
，3-端都具有0H-基团；
（2）都通过与RISC 结合的方式发挥功能作用；
（3）终极作用都是抑制mRNA 的翻译活性，而导致基因沉默。
不同点：
（1）生物合成途径不同；
siRNA主要是由外源导入的双链(dsRNA)经切割产生的、少数的是由内源dsRNA
切割产生。
miRNA则不然，它是由内源基因组编码转录成Pri-miRNA ，被果蝇酶切割生成
70-80nt 的pre-miRNA ，由于pre-miRNA 存在回文结构自我折叠成双链的发夹结构→
由输出蛋白的作用进入细胞质后被切丁酶进一步切割加工成21～25bp 小片段并除
去单链环形成双链miRNA ，双链体(miRNA：miRNA*)分子，解离出单链的存留链miRNA
同目标mRNA 结合阻止翻译，另一条消失链miRNA*被降解。
（2）抑制翻译的方式不同；
siRNA是通过与目标mRNA 编码区中的靶序列的结合引导RISC 复合物中的切段
酶，从靶序列的中间部位切割断裂mRNA 分子，从而抑制翻译。
，miRNA 与此不同，它是通过与目标基因mRNA 的 3-UTR 序列中的结合位点的序
列互补作用，促使mRNA 失去翻译活性。因此在miRNA 作用过程中，虽然目标蛋白质
的数量减少了，但其mRNA 的丰度却没有明显的变化。
（3）碱基互补水平不同；
siRNA 与靶序列之间核苷酸碱基的互补水平达百分之百的完全匹配。
但miRNA 则依材料来源的差异而有两种不同的情况。植物mRNA 与靶序列核苷酸碱基
也是百分之百完全匹配的、而动物的miRNA 与其结合位点的核苷酸碱基则不是完全
互补的，两者之间存在着若干非配对的碱基。
40. 微量碱法分离纯化质粒DNA 的原理有如下几点：
（1）根据质粒DNA 与染色体线性 DNA 在拓扑学上的差异。质粒DNA （cccDNA ）是共价闭
合双链超盘旋构型的小分子DNA ，而细胞染色体DNA 在细胞裂解分离过程中断裂成线性DNA （LDNA ），虽然在化学本质上没有本质区别，但在高级结构拓扑学上存在差异。
（2）差异碱变性，在pH 12.0-12.5高pH 条件下，线性的DNA 容易变性解链，而质粒DNA 不易变性或很少变性。
（3）酸复性，在pH4.8条件下，cccDNA 很快复性，而线性的染色体DNA 不可逆的变性并与蛋白质、RNA 形成沉淀物，通过离心可以把LDNA 与cccDNA 分开。cccDNA 在上清液中。
（4）酒精沉淀cccDNA, 以2.5倍的95% 酒精沉淀质粒DNA ，(浓度为66%沉淀最好) 。保存在TE （pH8.o ）缓冲液中，放置在－20C o 下保存备用。
41. 图示λZAP 载体的组成结构及优点：
T3-MCS- T7
___________________________＼／____________________
cos_｜ ｜ ｜ pBluescriptSK噬菌粒 ｜ ｜ ___｜
｜______｜____｜________________________｜______｜__｜cos
I LacZ T
组成结构： （1）含有具内删除特性的pBluescriptSK 噬菌粒；
（2）在pBluescriptSK 噬菌粒两端具有f1的起始子（I ）和终止子（T ）；
（3）在pBluescriptSK 噬菌粒内部具有多克隆位点MCS ；
（4）在多克隆位点的两端带有T3和T7启动子；
（5）在该载体的两端具有cos 末端。
（6）在pBluescript 的内部带有缺陷的LacZ 基因，。
λZAP 的特点：
（1）可克隆10kb 大小的外源DNA ；
（2）当外源DNA 插入取向和读码结构正确，就能表达出融合蛋白质，并可用抗体筛选；
（3）当外源DNA 插入在多克隆位点，使β半乳糖苷酶失活故可用Xgal 显色的组织化
学筛选重组子（白色为重组子）；
（4） 克隆的外源DNA 可在体内随pBluescript 噬菌粒删除下来，省去了常规的亚克隆；
（5） 利用T3或T7噬菌体的RNA 聚合酶，可方便地制备外源插入的DNA 的任何一
条链的mRNA ；
（6）可定向克隆。
＋内删除源理：当含有外源DNA 插入的重组λZAP 载体，感染大肠杆菌F 菌株，再用辅助噬菌体
M13（或f1） 超感染。于是，在细胞内由此辅助噬菌体基因Ⅱ提供的反式作用蛋白质，便会识别位于λZAp 载体上的f1起始子和终止子，并最终导致含有外源DNA 插入的pBluescript 噬菌粒在体内从λZAP 载体上删除下来。最终被辅助噬菌体M13的蛋白质包装成单链DNA 噬菌体颗粒，并被挤出寄主细胞。
42. M13克隆体系中β-半乳糖苷酶Xgal 的显色原理
M13克隆体系包括M13克隆载体和M13特殊的寄主菌株两部分组成。β-半乳糖苷(LacZ)当它为四聚体时具有活性，可把无色的X-gal 切割成半乳糖和深蓝色靛蓝，因此Xgal 可作为β-半乳糖苷酶活性的一种指示剂。由于LacZ 基因分子量太大。依据基因内互补作用的原理。利用基因工程的方法，即将编码同样的蛋白质多肽链序列，但各自具突变的序列，当这种载体转入到特殊的寄主菌株中便组成具有功能活性的多肽的生化过程。根据这一原理，在M13克隆载体上LacZ －Hind Ⅱ片段具有β-半乳糖苷酶第2-92位氨基酸，大肠杆
，菌F 因子上带有缺失了第11-42位氨基酸的缺陷性LacZ(简称M15基因) 。当M13载体感染了这种M13特殊的寄主菌株如JM101后，便会产生具有功能活性的β-半乳糖苷酶，于是在含有指示剂Xgal 和诱导物IPTG 的培养基中，就会出现蓝色的噬菌斑。但当外源基因插入到M13克隆载体时，无法形成四聚体的具活性的LacZ ，就不能切割Xgal ，故白色噬菌斑为重组子。
43. DNA标签法分离产物未知基因的原理及主要步骤
根据DNA 插入突变作用原理，用已知的插入序列为探针，分离产物未知基因的方法。由于插入的DNA 序列是己知的，人为地给目的基因加上标签 ，故称DNA 标签法。
主要步骤：（1）当一段特定的DNA 标签序列插入到野生型的基因的内部或其附近位点时，便会诱发该基因发生突变，形成突变体；（2）用已知的标签序列作DNA 分子探针，从突变体
的基因组DNA 文库中筛选出突变的基因；（3）再利用筛选到的突变基因除标签序列以外的序列作探针，再从野生型的基因组DNA 文库中筛选出目的基因。
44. 用于克隆真核基因的大肠杆菌表达体系的优点和条件
大肠杆菌表达体系的优点：
（1）背景知识清楚，分子生物学、遗传学的基础研究，特别是表达调控知识丰富；
（2）具有完善安全的基因工程体系。包括安全的寄主菌株和载体系统；
（3）早期转基因表达调控研究扎实，许多基因如胰岛素基因、生长素基因等，都能 在大肠杆菌中高效的有效表达；
（4）易工业化批量生产，培养方便、操作简单、成本低廉，特别对药用蛋白发酵生产。 实现真核基因在大肠杆菌中有效表达的条件：
（1）真核基因的编码序列必须是连续的cDNA ，因为原核细胞中不具备剪辑加工的酶；
（2）原核的启动子，最好是诱导型的强启动子；
（3）以融合蛋白质的形式表达，稳定性好。
45. 酵母 双杂交体系的原理及其用途是什么？
酵母双杂交体系简称Y2H 。这是在上一世纪90年代初，在转录因子结构的基础上
发展出来的一种敏感的体内鉴定基因的方法。可用来有效地分离与己知靶蛋白相互作 的另一种蛋白质编码基因，也是分离与某种特定启动子调控元件结合的特异性转录因子 的有效手段。
如同许多真核生物的转录因子一样，酵母β-半乳糖苷酶的转录因子GAL4也含有两个结构上可分开的、功能上相互独立的结构域，即DNA 结合域(DNA_BD)和转录激活域(AD)。应用DNA 重组技术，可以把GAL4转录因子的这两个结构域分开。如果把它们放置在同一个酵母细胞中，所产生的GAL4 DNA-BD和AD 多肽，彼此之间不会直接发生相互作用，所以不具有转录因子的功能活性，无法激活相关基因转录，。但是应用DNA 重组技术，将两个分开的GAL4的 DNA-BD和AD ，甚至分别来自两个不同的转录因子的DNA-BD 和AD 重组成一个转录因子(使之在空间上彼此靠近) 则又可重新获得转录因子的功能活性，即可激活相关基因的转录。酵母双杂交体系就是根据这种原理建立的。 酵母双杂交体系包括两种大肠杆菌-酵母菌的穿梭载体；和一种特殊的己经缺失了内源GAL4转录因子的酵母寄主菌株。
第一种穿梭载体叫DNA-BD 质粒载体：
它具有色氨酸合成酶基因、把己知的靶基因按正确的读码结构和取向插入在该载
体的多克隆位点上，便可与GAL4 DNA-BD多肽形成第一种杂种蛋白(X)。
第二种穿梭载体叫AD 质粒载体：
它具有亮氨酸合成酶基因（leu ）、是用于构建cDNA 表达文库的专用载体。克隆的
cDNA 片段按正确的读码结构和取向插入在该载体的多克隆位上（构成cDNA 文库），cDNA 编码的蛋白质便与GAL4的AD 多肽融合成第二种杂种蛋白（Y ）。
酵母寄主菌株：
将上述两种杂种质粒共转化到酵母双杂交体系专用的寄主菌株特点：（1）这种菌株
己经丧失了内源GAL4转录因子的能力；（2）具有Lac Z 和his 3的报告基因；（3）具有trp 和leu 的转化标记，即在缺少Trp 和Leu 的缺陷性培养基上无法生长的。
将共转化的酵母细胞涂布在缺少亮氨酸(Leu）和色氨酸（Trp ）的SD 培养基上，
如果由笫一种质粒表达的靶蛋白与第二种质粒表达的cDNA 文库编码的某种蛋白质
发生了相互作用，这样DNA-BD 与AD 就会在空间上彼此靠近，而且它具有色氨酸和
亮氨酸的编码基因，因此在缺陷性的选择培养上就能生长，于是便构成了有功能活
性的GAL4转录因子，从而启动下游报告基因LacZ 的表达。据此选择出蓝色阳性克
隆，有可能含有与靶蛋白相互作用的另一种蛋白编码基因。 酵母双杂交体系可以
用于产物未知基因的分离、也可用于新基因功能的鉴定。
46. 表达载体的组成：
（1）原核启动子，最好是诱导型的强启动子，使外源基因蛋白表达量占总蛋白的10-30%， 如果表达的是毒蛋白，启动子应呈现低限的基础转录水平；
（2）多克隆位点(MCS)，用于插入外源基因；
（3）抗生素抗性基因，用作选择标记；
（4）复制起点(ori)，决定外源基因的拷贝数;
（5）转录终止子，防止启动子通读作用，提高蛋白质的稳定性；
（6）翻译起始序列和翻译增强子；
（7）翻译终止子，防止核糖体的跳跃(Skipping)。采用四联核苷酸UAAU 效果更好。
47. 简述构建cDNA 克隆的定义、主要步骤及其优越性？
定义：cDNA 克隆：从mRNA 出发，经反转录、与载体分子重组、转化寄主细胞增
殖，将目的基因克隆化的过程称为cDNA 克隆。从理论上讲该生物的每一种
mRNA 都应有一个克隆。故亦称cDNA 文库
步骤：
第一步：提取处于特定发育阶段的真核生物体的特定器官或组织中的总RNA ， 根据
mRNA poly(A)尾特点过Oligo(dT)柱，分离纯化出mRNA ；
第二步：利用适当引物(一般用Oligo(dT)和反转录酶，获得 cDNA/mRNA杂合分子。 第三步：，用碱处理降解，或用RNaseH 酶切割cDNA/mRNA杂合分子中的mRNA 链获得
cDNA 第一链，再由第一链cDNA 合成第二链cDNA 。
第四步：双链DNA 与适当的载体重组，将重组体的群体导入大肠杆菌寄主细胞中增殖，
从而构成cDNA 文库。
cDNA文库的优点：（1） 以mRNA 材料出发，对于RNA 病毒特别适用；
（2） 库容量小（相当DNA 文库的15％）筛选工作量小；
（3） 假阳性比例小，因每一种mRNA 就应有一个克隆。
（4） 具特殊用途：（a ）克隆的真核基因在原核中表达需cDNA ； （b ）核苷酸序列测定；
（c ）发育过程中时空表达基因的研究分析。
48. 何为柯斯质粒载体，其结构、特点是什么？
定义：柯斯质粒载体是人工构建带有λ噬菌体的cos 位点和E.coli 质粒的复制子的新型质
粒载体。它具有质粒载体的特点和λ噬菌体的特点。
结构： （1） 具一个质粒的复制起点（ori ）；
（2）具若干来自质粒载体的选择记（1-2个）；
（3）具相当数量的来自质粒的核酸内切酶的单切点；
（4）具有λ噬菌体的cos 位点。
特点：（1）λ噬菌体的特点：（a ）导入寄主细胞后，可以重新环化起来；
（b ）经体外包装后转导效率大大提高；
（c ）无法进入溶菌周期，也不能形成噬菌体颗粒。
（2）具质粒载体特点：（a ）在寄主细胞内可像质粒DNA 一样复制；
（b ）在氯霉素作用下扩增；
（c ）具有抗生素抗性记号。
（3）具有高容量的克隆能力：上限45kb ，下限30kb ；
（4）能与带有同源序列的质粒DNA 重组。
49. 分别叙述原核基因组和真核基因组的结构特点 。
（1）原核基因组的结构特点：
（a ）高效的遗传信息利用率；
a. 既没有不必要的额外重复序列，也极少存在无功能的冗余序列；
b. 基因组９８％以上的核苷酸序列都是编码基因
c. 基因排列紧凑，同一个操纵子不同基因之间的间隔距离一般不超过 ２０
bp ，而且其中还存在着转录起始信号和终止信号；
d. 存在着编码序列彼此重叠、编码不同蛋白质的重叠基因。
（b ）双链ＤＮＡ的编码功能；
（c ）多基因聚集排列成操纵子结构形式；
（d ）染色体基因组的拷贝数平均每细胞为1.1条，在富裕培养基中可高达3～4条。
（2）真核基因组的结构特点：
（a ）包装成特定的染色体结构；
（b ）基因组的多倍性；
（c ）具有大量的重复序列；
（d ） 高比例的非编码的DNA 序列，以人为例，非编码序列占基因组总长的98%以上，
而蛋白质编码基因的序列还不到基因组总长的2%。包括基因与基因之间的非编
码的DNA 序列，以及基因内部的非编码的DNA 序列。
（e ） 庞大的基因数量；
如拟南芥：25，000个左右、水稻：40，000个左右、小鼠：30，000个左右、
人类：24，000个左右。
（f ）基因分布密度不均一。如基因分布有富集区和荒漠区之分。
50 .何为基因克隆？其主要的实验步骤
定义：基因克隆又叫DNA 克隆，它是指将外源基因插入到适当的克隆载体上，形成重组DNA 分子群体转化到大肠杆菌寄主细胞中进行复制繁殖，以便从大分子DNA 或DNA 片段中分离纯化出目的基因或特定的DNA 片段的实验操作，叫做基因克隆或DNA 克隆。
其主要步骤： （1） DNA 片段化：从实验材料分离纯化基因组DNA ，经机械方法或
酶切消化、超声波等方法获得一定长度的DNA 片段；
（2）体外重组：将片段化的DNA 与适当载体分子重组；
（3）重组子转化：将重组子转入到适当的寄主菌株中进行增殖；
（4）重组子的筛选：从大量的转化细胞中筛选阳性克隆的重组子；
（5）因的分离：用多种酶切后走凝胶电泳，并用探针进行杂交，分离出
目的基因的DNA ，并克隆在M13载体上进行测序；
（6）目的基因的表达与功能鉴定。
51. DNA 转录与复制有哪些差别？
基因的转录与复制的过程，无论在生物化学还是酶学方面都是十分相似的。它们二者都是在各自特有的核酸酶，即RNA 聚合酶和DNA 聚合酶的催化下，合成出一条与DNA 模板链互补的新的多核苷酸链。尽管如此，基因的转录（RNA 合成）和基因的复制（DNA 合成）之间，仍然存在着如下几个方面的差别：
（1）对引物需求有别 。在基因复制中，需要同时存在模板链和引物，DNA 聚合酶才能
启动DNA 新链的合成。而基因的转录则不同，它不需要引物，RNA 聚合酶便能启动RNA 新链的合成。
（2）使用的底物不一样。由于DNA 和RNA 分子的核苷酸组成成分不同，因此基因复制与转录所用的底物也不一样：前者是用脱氧核糖核苷三磷酸：dATP 、dGTP 、dTTP 、dCT P ；后者是用核糖核苷三磷酸：ATP 、GTP 、TTP 和CTP 。
（3）与模板的结合状态有异。基因的复制是按照半保留方式进行的，在新生成的两条子
代DNA 分子中，新生链和模板链始终是结合在一起的。而基因的转录则不同，新合成的RNA 链最终是要从模板上解离下来的。
－4（4）精确性程度差异悬殊。在基因的转录过程中错误参入RNA 链的核苷酸频率是10，
也就是说每参入10，000个核苷酸，就会出现一个错误（万分之一错误率）。而在基 因
－7的复制核苷酸错误参入频率是10，也就是说每参入10，000，000个核苷酸，仅出现
一次错误（千万分之一错误率）。这也就是说DNA 复制的精确度是超过转录的1000倍！
（5）涉及范围不同。基因复制往往是整个基因组从头至尾逐步进行，涉及范围包括整个基因组中的所有的DNA 和基因。而基因转录则不同，它所涉及的范围要比复制小得多，通常只是一个基因或一个操纵子。
52. 何为基因扩增，它有哪些方式？
基因扩增是指某种基因拷贝数增多的现象。
其方式有：（1）利用PCR 技术使某基因拷贝数增多；
（2）隆基因导入寄主细胞内使大量繁殖，使基因扩增(单拷贝基因可扩增到约
1x106的拷贝) ；
（3）环境压力影响使某种基因适应性的扩增；
（4）程序性基因扩增。如非洲爪蟾在形成卵发育过程中其rRNA 大量扩增；
（5）生物进化过程中的某种基因得以扩增。
53. 真核基因与原核基因表达调解机理的差异
（1）源于细胞结构水平的差异。真核细胞转录和翻译分别在细胞核和细胞质中分开进行；
没有涉及mRNA 运送过程的调节。原核细胞的转录和翻译是在细胞质中偶联发生。
（2）源于染色体结构水平的差异。真核细胞基因组被包装成染色体，存在于细胞质的有关蛋白质因子（如TF ）进入细胞核必须克服染色体的层层屏障才能与顺式元件结合。
（3）源于基因排列与结构的差异。真核基因为单顺反子，大多为断裂基因。转录后加工复杂，而原核基因为多顺反子，转录后加工也简单得多。
54. 说明mRNA 差别显示分离产物未知基因的基本原理并评述其优缺点。
答：这是建立在基因差别表达理论基础上，通过比较不同个体，或同一个体的不同组织或
不同发育阶段之间mRNA 种的差别，并应用反转录PCR 技术而发展出来的一种分离产物未知基因的方法。故又叫mRNA 差别显示反转录PCR ，简称DDRT-PCR 。
， 它的原理：根据真核基因3-端的mRNA 分子的poly （A ）尾巴如之前2位碱基，可
，把mRNA 分子分成12种类群，如1个碱基可把mRNA 分为3大类群。根据3-端的
，锚定引物，和5-端设计随机引物。从数理统计推算和实验经验，3种锚定引物和80
种随机引物(3×80＝240）240组合大体上涵盖95%的mRNA 。用此种方法可以分离到产物未知的真核基因。
它的优点：（1）简单方便，由于使用PCR 扩增和序列胶电泳技术，故简单快捷；
（2）灵敏度高，实验利用了PCR 技术、序列电泳技术和同位素自显影技
术，故具极高的灵敏度；
（3）多用性，可同时比较多个样品间的基因表达差异。④直观性，其每个
步骤均可被直观地检测。
mRNA 差别显示缺点：（1）假阳性比率高；
（2）扩增的片段分子量较小；
（3）工作量大。
55. 影响酶切反应的因素：
答：（1）DNA 分子的性质：（a ）. 酶切位点周围的碱基成分；
（b ）酶切位点的密度；
（c ） DNA 分子的构型；
（d ） DNA 分子的甲基化程度。
（2）酶切的温度；
（3）DNA 制剂的纯度。
56. 产生酶切星号活性的因素：
（1）每μg 样品酶切的用量不得超过10单位；
（2）酶切反应体系中的甘油浓度不得超过5%；
（3）其他金属离子取代二价Mg ；
（4）金属镁离子不得低于25mmol/L；
（5）pH 不得超过8；
（6）样品中有机溶剂污染的影响。
57. 一种基因产生多种蛋白质的原因分析
答：主要原因：
（1）许多基因都拥有多个启动子。在人类基因组中，至少有一半以上的基因都具
有多个启动子。在真核断裂基因的转录过程中，可变启动子的使用常常涉及到位于
转录起点的可变首位外显子（alternative first exon）。可变启动子的不同成员，驱动从相应的可变首位外显子开始转录反应。已经对有些基因的可变首位外显子作
了全阵列（whole arrays）分析，结果证明每个可变首位外显子都具有一个自身专
有的启动子。可变的首位外显子的不同产生的蛋白质产物不同；
一种基因产生多种蛋白质的原因之一多启动子的图
（由韩晓燕（农加所）和畜牧所化朝举）
化朝举（畜牧所）
韩晓燕（农加所）
（2）初级转录本的可变剪接可产生多种蛋白。可变剪接（alternative splicing ）又
称为差异剪接（differential splicing）或可变mRNA 剪接。这是指真核断裂基
因初级转录本，在不同类型的或处于不同发育阶段的细胞中发生的不同形式的剪
接作用。结果生成具有不同序列结构特征、并编码不同蛋白质异形体的成熟的mRNA
分子。因此说，可变剪接可以使同一个基因的初级转录本，最终翻译出多种不同
功能的蛋白质分子。以果蝇Dscam 基因为例，可形成38016种蛋白质异形体。
可见可变剪接是造成一种基因多种蛋白质现象的另一种重要原因。
次要原因：
（3）RNA 的编辑；致使mRNA 分子核苷酸序列的结构出现了变化。此种RNA 编辑具有
多种不同的效应，诸如产生出新的起始密码子、终止密码子或是造成多肽链编码
序列出现变化。因此，RNA 编辑的结果，改变了源自基因DNA 模板链的遗传信息，
翻译出不同于基因原来编码的新的蛋白质多肽。
（4）基因重排均可产生不同的蛋白。由于基因区段转位作用或随机连接造成的基因可变
区固有排列顺序的改变的基因重排（gene rearrangement）或DNA 重排，可使基因
产生不同的蛋白。
58. 基因工程的三个主要优点：
第一，具有跨越天然物种屏障的能力，可以把来自不同物种的DNA （基因）转移到与其毫无亲缘关系的新寄主细胞中进行复制与表达。这意味着应用基因工程技术有可能按照人们的主观愿望和社会需求，创造出自然界原本并不存在的新的生物类型。
第二，能够使特定的DNA 片段或目的基因在大肠杆菌寄主细胞中大量扩增。如此人们便
能够制备到大量纯化的特定DNA 片段或目的基因，从而极大地促进了有关基因分子遗传学的基础研究工作。
第三，确立了反向遗传学（reverse genetics ）研究途径。传统遗传学是根据生物个体的表
型特征去探究其相应的基因型的结构，人们习惯上称这样的遗传学研究途径为正向遗传学（forward genetics）。随着分子遗传学尤其是重组DNA 技术的发展与应用，科学工作者已有可能通过配合使用基因克隆、定点诱变（site-directed mutagenesis）、PCR 扩增及转基因等各项技术，首先从基因开始研究其核苷酸序列特征、蛋白质产物的结构与功能，进而根据人们的需求对基因进行修饰改造，然后再返回到生物体内观察其生物学活性与表型特征的变化。为与传统的正向遗传学相区别，人们称这样的遗传学研究途径为反向遗传学。
59. 生命体的遗传信息的三个层次：
第一个层次由基因组DNA 中编码蛋白质的基因构成。已知在人类基因组中，此类基因所占的比例还不到全部DNA 序列的2%，然而它对于生命活动的重要性已经是众所周知的事实。
第二个层次仅含有非编码的RNA （non-coding RNA,ncRNA）基因，主要包括rRNA 基因、tRNA 基因、snoRNA 基因以及miRNA 基因和siRNA 基因等。这类RNA 基因存在于基因组DNA 广袤的非编码蛋白质的序列中（详见第二章）。如同蛋白质编码基因一样，RNA 基因在生命过程中的作用也是不可或缺的。
第三个层次为表观遗传信息层（epigenetic layer of information）。它是贮藏于环绕在DNA 分子的周围、并同DNA 相互结合的蛋白质及其他化合物当中。尽管目前我们对于表观遗传信息层的功能效应尚不十分清楚，但有大量的报告提示它对于生命体的作用，可能比RNA 基因信息层还要重要。I
60. RNA 的主要功能：
第一， RNA 在蛋白质合成过程中起着关键性的作用。主要的参与者有mRNA 、rRNA 和
tRNA 三种，其中mRNA 是遗传信息从DNA 转移到蛋白质多肽链的中间媒介，
既是DNA 的转录本又是指导蛋白质多肽链合成的模板；rRNA 具有组装者
（assembler ）和催化剂的双重功能；tRNA 起着转运和信息衔接子（adaptor ）
的作用。
第二， RNA 分子具有支架（scaffold ）功能。由于RNA 分子可以起到支架或构架
(framework)的作用，而蛋白质多肽又能够识别RNA 一级核苷酸序列以及二级或
三级的结构基序。因此，依赖于RNA 支架，蛋白质分子便能够组装成具有特定功
能的RNA-蛋白质复合物。例如信号识别颗粒（signal recognition
particle,SRP ），便是一种与新生蛋白质的信号肽序列相互作用的、依赖RNA 提
供的支架基础组装而成的RNA-蛋白质复合物。
第三， RNA 具有催化功能。一类被称为核酶的特殊物质，是一种具有核酸内切酶活性、
可切割特异性RNA 序列的复杂的RNA 分子。亦即是一种高度特异的、能够自我
剪接的RNA 序列。它能够催化在胞内发生的许多生化反应，包括核酸复制、mRNA
自我降解、tRNA 加工、pre-mRNA 的剪接以及蛋白质合成等过程。例如在核糖
核酸酶P （RNase P）和核糖体颗粒中，起催化作用的部分都是RNA 而不是与之
结合的蛋白质。
第四， 小RNA （small RNA ）能够参与基因表达调节。这方面的内容涉及不同形式的
RNA 折叠、核糖开关（riboswitches ）、RNA 干扰（RNAi ）以及微RNA （micro
RNA,miRNA ）等的调节作用。
第五， RNA 可以是遗传物质。地球上绝大部分生命体的遗传物质都是DNA ，但也有许
多病毒的遗传物质是RNA 而不是DNA 。这类RNA 病毒基因组也可以通过DNA
形式的中间体进行复制，维持遗传信息代代稳定相传。
61. 蛋白质的主要功能：
（1）有些蛋白质具有催化功能。这类蛋白质统称酶蛋白，能够参与生命体所必需的数量
庞大、类型繁多的生化反应，并能引起新陈代谢的变化。所以普遍认为具有酶催化活性是蛋白质最主要的属性。没有酶，生命也就不可能存在。
（2）有些蛋白质具有支架功能。其主要作用是用以维持细胞的形态，并参与肌肉及器官
的形成。支架蛋白（scaffold protein）常含有数个不同的组件，它可识别其他蛋白质的有关结构元件并与之结合，形成多蛋白的复合物。
（3）有些蛋白质具有调节功能。这类蛋白质叫做调节蛋白（regulatory protein），它可
通过同DNA 或RNA 分子中特定序列的结合，调节基因的表达活性及其他细胞活性。转录因子可看作是一类典型的调节蛋白，基因的差异表达及其时空特异性表达活性，均与转录因子的功能作用密切相关。
（4）有些蛋白质具有信号传导功能。这类蛋白质负责细胞信号传导。例如哺乳动物胰腺
组织细胞分泌的胰岛素（一种主要的动物激素），能够把信号传导给肌肉细胞和肝脏细胞，促使它们从血液中吸收葡萄糖。当然一些常见的植物激素诸如植物生长素、细胞激动素、赤霉素和脱落素等，亦能通过多种类型的相互作用，以复杂的方式参与信号传导。
（5）有些蛋白质具有物质运送功能。这类蛋白质叫做转运蛋白（transport protein）。
例如在人体血液循环系统的红细胞中，含有大量的血红蛋白（hemoglobin ），能够将其在肺部结合的氧，运送到身体的各个部位，供生命活动需要。还有肌红蛋白（myoglobin ），能够在肌肉细胞的线粒体中，为氧化作用运输氧。
（6）有些蛋白质具有运动功能。这类蛋白特称马达蛋白（motor protein）。肌肉收缩和
细胞游动是蛋白质具有运动功能的两个典型事例。肌动蛋白和肌球蛋白，是构成细胞收缩系统的两种主要成分，其他的如微管蛋白、动力蛋白及驱动蛋白也都属于运动蛋白之例。
（7）有些蛋白质具有贮存功能。卵清蛋白、酪蛋白及菜豆蛋白等是主要的生命体贮存蛋
白（storage protein），在必要时可为生长发育提供足够的氮源。例如在鸟类中，由卵清蛋白为胚胎发育提供氮源；哺乳动物乳汁中的酪蛋白，可满足其幼仔发育对氮源
的大量需求；高等植物种子中的贮存蛋白，可为发芽供给足够的氮源。
（8）有些蛋白具有建造和维持生命体结构的功能。这类蛋白质称为结构蛋白(structural
protein ），主要包括α-角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、丝蛋白及蛋白聚糖等多种。其中α-角蛋白是构成动物毛发、角、蹄、甲等组织的主要成分，而胶原蛋白则是存在于骨骼、肌腱、韧带和表皮中的一类结构蛋白。
（9）有些蛋白质具有防护的功能。诸如免疫球蛋白、血液凝固蛋白、凝血酶和血纤蛋白
原等，都是常见的防护蛋白。其中最突出的是免疫球蛋白，亦即是所谓抗体。它是脊椎动 物免疫系统B 淋巴细胞产生的多功能。
62. 内含肽、外显肽及蛋白质剪接：
有些前体蛋白质多肽链内部，存在一种临时性的肽段或称间插序列（intervening sequence ）。在蛋白质翻译后加工过程中，这些内部肽段经过非酶催的转肽反应被剪除掉，而其两侧的多肽段便会连接成为具功能活性的成熟的蛋白质多肽。这种新近发现的蛋白质翻译后加工的方式，称为蛋白质剪接（protein splicing ）。其中被剪除掉的内部肽段称为内含肽（intein ），而被保留在成熟蛋白质中的两侧肽段称为外显肽（extein ）。
63. 安慰诱导物（Gratuitous induccer）：
是一种能够诱导细胞合成某种特定的蛋白酶，而它自己却不是该酶的作用底物的特殊物 质。因此安慰诱导物是一种不发生代谢变化的诱导物。例如IPTG 即是β-半乳糖苷酶的一种安慰诱导物。
64.M13载体系列的优点
（1）可以十分方便地分离任何特定的单链DNA 序列，克隆在M13RF DNA分子上的外源
DNA 片段，到了子代噬菌体便形成单链形式，故可制备单链DNA 。
（2）重组子化学检测。M13载体上有一条饰变的β-半乳糖苷酶基因片段，可以与相应寄
主产生α-互补作用，形成有活性的β-半乳糖苷酶，故可用X-gal 及IPTG 进行组织化学检测筛选重组体分子。
（3）lacZ 基因上具有一段多克隆序列因此便于外源DNA 片段的插入与克隆。
（4）可定向克隆。在M13mp 克隆载体上的多克隆位点的顺序是已知的，因此经两种不
同限制酶消化的DNA 的插入方向，便可据判断出来。
66. 丝状噬菌体展示技术
当外源基因插入到单链丝状噬菌体基因组之基因Ⅷ或基因Ⅲ的3'端编码序列中，在两
者读码结构保持一致的情况下，外源蛋白质或多肽，便会以融合蛋白质的形式表达，于是融合在外壳蛋白N 端的外源多肽(或蛋白质) 便被展示在噬菌体颗粒的表面上。根据这种事实，1985年G . P. Smith 建立了一种专门在丝状噬菌体颗粒表面表达蛋白质或多肽的所谓噬菌体表面展示技术简称为（phage display）噬菌体展示技术。
67. 噬菌体展示载体(phage display vectors)
根据在丝状噬菌体表面表达蛋白质或多肽的噬菌体表面展示技术，发展.
而来的一类
具有特殊用途的噬菌体载体叫做噬菌体展示载体。当外源基因插入在该载体的Gene Ⅲ或Gene Ⅷ编码序列中，并在两者保持正确读码结构的情况下，就会产生出融合蛋白质。
68. 噬菌粒展示载体：
是将噬菌体的基因间隔区（含有控制噬菌体DNA 复制和包装的全部顺式元 件），插入质粒载体而发展出来的展示载体。
噬菌粒分子量小，易于操作，转化效率高，适于构建大型文库。然而由于噬菌粒不含有噬菌体的复制与组装基因。因此，需要辅助噬菌体提供相应功能。
69. pBluescript噬菌粒载体的结构特征
pBluescript KS(+/-)或pBluescript SK(+/-)
SK 表示多克隆位点区的一种取向，即lacZ 基因是按照SacI →KpnI 方向转录的。 KS表示多克隆位点区的另一种取向，即lacZ 基因是按照KpnI →SacI 方向转录的。 (+/-)表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反取向。
70. pBluescript噬菌粒载体的用途
pBluescript 噬菌粒载体在基因工程及分子生物学研究中用途广泛，主要的有如下几点：
（1）制备同位素标记的DNA 杂交分子探针：基因文库或cDNA 文库筛选；Southern
杂交及Northern 杂交。
（2）制备克隆基因的转录本
（3）合成克隆基因编码的蛋白质
71. 辅助噬菌体(helper phage)
协助相关的克隆载体，并与之一道进入寄主细胞，并为克隆载体的复制提供所需核酸酶及其它蛋白质(如包装用的外壳蛋白质) ，这样的噬菌体称辅助噬菌体。复制蛋白质同突变的复制起点结合，尽管复制效率有限，但仍可产生出足够量的复制噬菌体，保证其自身遗传的稳定性。
72. 影响噬菌粒单链DNA 产量下降的可能因素
许多噬菌粒在辅助噬菌体感染后，有时其单链DNA 的产量较低，且重复性也差。只相当于带有同一外源DNA 区段的丝状噬菌体载体的病毒颗粒产量的1/100-1/10，其影响因素可能是：
（1）噬菌粒携带的基因间隔区的确切序列
携带完整基因间隔区的质粒，由于干扰了辅助病毒DNA 的复制，从而抑制了子代噬菌体颗粒的产生。
（2）基因间隔区插入质粒的具体位置
基因间隔区插入pBR322 HindⅢ位点所构成的噬菌粒，会严重干扰野生型噬菌体的生长，而将之插入Aha Ⅲ位点的效果则不然。
（3）辅助噬菌体的性质
野生型丝状噬菌体及其抗干扰突变株都被用作辅助噬菌体：一般说来，外源DNA 片段越大，产量也就越低。
73. 终止子（terminator ）和终止区（terminator region）
（1）终止区的定义：原核蛋白质基因终止区也叫做终止序列，相当于真核基因的终止
子。这是一段专指位于操纵子（或说是转录单位）3’-末端转录终止位点之后的一段核苷酸序列。
（2）终止区的功能：是为RNA 聚合酶提供转录终止信号，促使其停止对操纵子编码基因的转录作用，并从其结合的DNA 分子上解离下来。
（3）真核基因的终止子，指位于mRNA 转录终止位点下游的一段DNA 序列区，亦叫做3’
下游序列区，或3’-侧翼序列。
（4）终止子的信号： （a ） 转录终止作用信号；（b ） mRNA 3’-末端加工信号；（3）
大多数真核基因3’-末端还具有poly （A ）加尾信号，即多聚腺苷酸化信号。
74. 整合作用（Integration ）与参入作用（Incorporation ）
（1）整合作用也称为DNA 插入作用（insertion ）。它是一种DNA 的重组方式，系指小
分子量的DNA 分子（如λDNA ）组入到大分子量的DNA 分子（例如E.coli 染色体DNA ）的过程。噬菌体DNA 组入细菌染色体DNA 的过程，叫做噬菌体DNA 的整入或插入。
（2）参入作用：一般是指单核苷酸分子组入新合成的DNA 链或RNA 链的过程。例如在
DNA 裂口转移或PCR 反应过程中，游离的核苷酸分子按照碱基配对原则，组入新合成DNA 链的过程。
75. 超感染免疫性（Superrinfection inmunity）
（1） 定义：亦叫再感染免疫。有如下两种不同的情况：
（a ）溶源性细菌不能被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染的现象，称为超感染免疫性；
（b ） 两种完全相同或结构上极为相近的不相容性质粒，不能在同一细胞中共存的现象，叫做超感染免疫性。
77. 黏性末端位点
（a ）λ噬菌体的黏性末端位点（cohesive-end site）简称cos 位点。系指在λ噬菌体
线性双链DNA 分子两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5' 单链突出的序列，即黏性末端。在体内由此黏性末端结合形成双链区段称为cos 位点，它系英语cohesive-end site的缩写略语，意即黏性末端位点。
（b ） cos末端（cos ends）
λ噬菌体DNA 的cos 位点经末端酶的切割形成的具12个核苷酸碱基的单链延伸末端，叫做cos 黏性末端，简称cos 末端。在体内cos 末端可以彼此配对，使线性的λDNA 重新环化起来：
5'-----GGGCGGCGACCT-----3'
3'-----CCCGCCGCTGGA-----5'
一78. Spi正选择的λ噬菌体载体
野生型的不能够在P2噬菌体溶源性的细菌中生长亦即对P2噬菌体的抑制作用呈敏感
十（sensitiVe tO P2 inhibition）故表型为Spi 。
一可见，Spi 表型给我们提供了选择重组体分子的一种正选择标记。
十Spi 表型：不能够在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌细胞中生长，为非重组体分子；
一Spi 表型：能够在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌细胞中生长。即其red 和gam 基因被
外源DNA 片段取代，为重组体分子。
79. 柯斯质粒载体（cosmid vector）
一类人工构建的含λ噬菌体DNA 的cos 序列和大肠杆菌质粒复制子的特殊类型的质粒载体。其DNA 可以在体外被包装到噬菌体倒外壳内。
柯斯质粒载体的特点：
( 1）具有λ噬菌体的特点
a 导入寄主细胞后，其DNA 分子可以重新环化起来；
b 经过体外包装之后，可以高效地转导敏感的大肠杆菌寄主细胞；
c 无法进入溶菌周期，无法形成子代噬菌体。
（2）具有质粒载体的特点：
a 具有质粒的复制子，可在寄主细胞内像质粒一样进行复制；
b 可在氯霉素作用下扩增；
c 具了抗菌素抗性记号。
（3）具有高容量的克隆能力
（4）能够与带有同源序列的质粒发生重组作用
80.控制真核基因表达调节的主要方式：
（1）基因重排的调节方式；
（2）基因扩增的调节方式；
（3）基因调节蛋白质的转录调节方式；
（4）RNA 加工的调节方式；
（5）核质mRNA 转的调节方式；
（6）mRNA 稳定性的调节方式；
（7）mRNA 翻译的调节方式。
81.真核基因表达调节的主要特点：
（1）真核生物与原核生物在基因表达调节方面的相似性：已知有不少在大肠
杆菌中出现的调节机理，原则上也适用于真核生物，例如：（a ） 两者的转录调节，都是通过DNA 结合蛋白质，同基因启动子中的特异性顺式元件的结合作用进行的。（b ）两者DNA 结合蛋白质的多肽基序，在序列结构上也是相同的.
（2）真核生物与原核生物在基因表达调节方面的差异性：（a ） 真核生物细胞
类型的多样性，与原核相比，特别高等植物与动物，都具有数百种功能各异的不同细胞类型；（b ）真核生物具有细胞核结构，因此基因的转录和翻译是分别在细胞核与细胞质中分步进行的；（c ）真核生物具有庞大的基因组 ，其长度要超过原核的700多倍；（d ）真核生活物基因拥有大量的各种类型的基因，其总数可达数万种，相当原核生物的20多倍.
（3）真核基因表达调节方面与原核基因相比其复杂性或特殊性：（a ）发育调节,
基因表达的发育阶段性调节，器官和组织特异性调节；（b ）分化调节，同一受精卵究竟是如何分化出各具特定功能和形状态特征的不同类的组织、器官和细胞？；（c ）表达顺序性，复杂的多细胞生命体中，不同基因表达的顺序性的调节机理；（d ）同一生命个体中，不同细胞之间的生命活活动被此之间的协调和相对稳定性是息怎样维持的? ；（e ）选择性表达，相同基因组为什么在红细胞前体中会选择性表达编码血红蛋白的基因，而在胰腺细胞中却是选择性表达胰岛素的基因。此种精确控制基因差异表达的分子机理又是如何解释的呢？。
1、原核细胞与真核细胞基因表达调控最明显的区别在哪里？
2、反式作用因子与顺式作用元件物质本质是什么？顺式作用元件与反式作用因子的分子机理如何？
简述转基因动物的概念及研制转基因动物的主要方法。
简述转基因动物在生物学研究中的应用前景。