1.基因工程：是要按人们的意愿去有目的地改造，创建生物遗传性，因此最基本的工程就是得到目的基因或核酸序列的克隆。分离或改建的基因和核酸序列不能自身繁殖，需要载体携带它们到合适的细胞中复制和表现功能。
2.载体：英文单词Vector，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。
3.理想中基因工程载体的特征：能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力；容易进入宿主细胞，而且进入效率要高；容易插入外源核酸片段，插入后不影响宿主细胞和其在细胞中的复制。要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点；容易从宿主细胞中分离纯化出来，便于重组操作；有容易被识别的筛选标志，便于克隆操作。
4.载体的种类：质粒（Plasmid）载体；入噬菌体；柯斯质粒（Cosmid）；M13噬菌体；杂交质粒；病毒载体，包括穿梭载体（Shuttle ）；细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)；酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)；来源于P1的细菌人工染色体（P1-derived artificial chromosome， PAC）；哺乳动物人工染色体（MAC，mamal artificial chromosome）；人类人工染色体（HAC，human artificial chromosome）；植物人工染色体(PAC)
5 Plasmid 质粒： 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。
1大肠杆菌的各个菌株中找到了不同类型的质粒，主要有三种类型的质粒：F质粒、R质粒和Col质粒。
2.F质粒 F因子或性质粒，能使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在的该质粒受体细胞中。
3.R质粒 通称抗药性因子，可编码一种或数种抗菌素抗性基因，并可将这种抗性转移到缺乏该质粒的适宜受体细胞中，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。
4.Col质粒 即产生大肠杆菌素因子，编码控制大肠杆菌素合成的基因，大肠杆菌素是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。
5.质粒的一般生物学特性
a细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分。可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆的整合到寄主染色体上，随染色体的复制
而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
b绝大多数质粒是环形双链的DNA组成的复制子。
c质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。也有线性质粒，酵母的杀伤质粒是一种RNA质粒。
d根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 e质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。
6.环形双链质粒的三种构型：超螺旋构型（SC）共价闭合环状DNA；开环DNA构型（OC）单链缺口环状DNA；线性分子构型（LC）双链断裂DNA。
7.适于基因克隆载体的质粒DNA分子特征：复制基因（replicator）；选择性记号；克隆位点。
8.质粒DNA编码的表型
a质粒DNA仅占细胞染色体组的一小部分，一般约为1%～3%左右，但却编码一些重要的非染色体控制的遗传性状。
b质粒赋予寄主细菌的特性，包括：抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子，以及其他方面特征。
9.质粒DNA的转移 根据遗传分子特性，质粒可分为：结合型和非结合型质粒。
结合型质粒：即自我转移质粒，除去具有自主复制所必须的遗传信息之外，还有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
非接合型质粒：不能自我转移的质粒。尽管具有自主复制的遗传信息，但失去了控制细胞配对和结合转移的基因，因此不能够从一个细胞自我转移到另一个质粒。（可用于基因克隆载体）
10.F质粒又叫F因子，即致育因子（fertility factor）的简称，是在某些大肠杆菌细胞中发现的一种最有代表性的单拷贝的接合型质粒。 F质粒有三种不同的存在方式：
（i）F+细胞：以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，其上不带有任何来自寄主染色体的基因或DNA区段。（ii）F′细胞：以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时在其上还
携带着细菌的染色体基因或DN区段。（iii）Hfr细胞（高频重组细胞）：以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体。
F因子是雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的F-细胞则叫做雌性细胞。F+细胞的表面可以形成一种叫做性须（pilus）的结构，它促进雄性细胞同雌性细胞进行配对。在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培养，由于性须的作用，就会形成雌雄细胞配对。我们称这种过种为细菌的接合作用(conjugation)。配对之后F-受体细胞获得了F因子，也变成为F+细胞。
由F因子整合到染色体而成的Hfr细胞，就可能引发寄主染色体发生高频转移。这是一种可逆的过程，在一定的条件下，Hfr细胞又可重新变成F+或F′细胞。
11.质粒的结合转移
①细胞交配对的形成 雄性细胞的性须顶端与受体细胞表面接触之后，便会迅速收缩，把给体细胞与受体细胞拉在一起。因此，性须在确立配对细胞表面间的紧密接触方面，起着至关重要的作用。但是，大肠杆菌雄性细胞是不会同其它的亦带有F质粒的细胞发生配对作用的，因为traS和traT编码的‚表面排斥‛蛋白质，使此种细胞无法成为接合作用的受体。这就决定了雄性细胞只能同不具F因子的雌性细胞配对的特异性。
②质粒DNA的转移 F质粒DNA的转移是从转移起点oriT开始的。当细胞交配对建立之后，TraY和TraI蛋白质首先在oriT位点作单链切割，随后缺口链在其游离的5′-端的引导下转移到受体细胞，并作为模板合成互补链，形成新的质粒分子。于是受体细胞便转变成为具有F因子的雄性细胞
12.质粒DNA的迁移作用
非接合型的质粒，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能够自多转移。但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用（mobilization）。
13.ColE1质粒的迁移模型
ColE1是一种可以迁移但是属于非接合型的质粒。需要质粒自己编码的两种基因参与。一个是位于ColE1 DNA上的特异位点bom；另一个是ColE1质粒特有的弥散的基因产物，即mob基
因（mobilization gene）编码的核酸酶。
相容性的两种质粒F和ColE1共存于同一细菌细胞中，F质粒可以为ColE1质粒提供经所缺乏的结合功能，这样使得ColE1质粒也能够发生转移作用。
14.质粒DNA的复制类型
根据寄主细胞所含的拷贝数的多少，可将质粒分成两种不同的复制型：一种是低拷贝数的质粒，每个寄主细胞中仅含有1～3份的拷贝，我们称这类质粒为‚严紧型‛复制控制的质粒（stringent plasmid）；另一类是高拷贝数的质粒，每个寄主细胞中可高达10～60份拷贝，这类质粒被称为‚松弛型‛复制控制的质粒（relaxed plasmid）。
质粒拷贝数,是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
15.质粒的不亲和性
质粒的不亲和性现象：所谓质粒的不亲和性（plasmid incompatibility），有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。
不亲和群（incompatibility group），指具有亲缘关系，但彼此之间是互不相容的质粒。
16.质粒不亲和性的分子基础
主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。
大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白质，其浓度是与质粒的拷贝数成正比的。阻遏蛋白质通过同其靶序列间的相互作用，使双链DNA中的一条链断裂，从而导致质粒DNA复制的启动，并建立起一种调节质粒拷贝数的负反馈环（negative feedback loop）。当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白质时，其复制启动便被抑制了；而当质粒处于低拷贝和低浓度遏蛋白质的条件下，它的复制反应便会继续进行。
由于每一种质粒的复制速率拷贝数控制，都是由一对不相容质粒产生的阻遏蛋白质总浓度联合调控的，这种交叉抑制的结果，使细胞中质粒拷贝数，比其单独感染状态下的正常拷贝数减少许多。
17.质粒DNA复制的多样性
不同质粒DNA的复制存在如下几个方面多样性：1）对寄主酶的依赖性 有些质粒完全依赖寄主细胞提供的核酸酶进行复制，也有的质粒自身编码有若干种核酸酶，直接参与DNA的复制。2）DNA聚合酶的利用 绝大多数质粒是利用polⅢ聚合酶进行链的延长合成。也有质粒ColE1，利用polⅡ聚合酶进行链的延长合成 3）复制的方向性 分为纯单向性的（ColE1）和纯双向性的（F质粒）两种不同的形式。 R6K质粒开始是单向进行，到晚期则从同一复制起点开始按相反方向进行。4）复制的终止 单向性复制的质粒，经过一个周期的复制在起点处终止复制。双向性的质粒有两种终止方式：一是待双向生长的复制叉同时到达同一位点时，才发生终止。二是具有一个共同的复制位点。5）复制型 碟状模型（butterfly model）
18.质粒DNA拷贝数的控制 天然质粒拷贝数的控制 高拷贝数的质粒倾向在松弛控制下复制，低拷贝数质粒倾向在严谨控制下复制。高拷贝数的质粒复制是由质粒编码基因合成的功能蛋白质调节的。低拷贝数质粒复制依赖寄主细胞不稳定的蛋白质控制，并随着寄主染色体的复制而复制。
19.杂种质粒拷贝数的控制 pSC134质粒的亲本质粒为ColE1和pSC101。
20.质粒复制控制的分子模型：抑制蛋白稀释模型、自体阻遏蛋白质模型
21.天然质粒做克隆载体的局限性
天然质粒是那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。常用的天然质粒有CoE1、RSF2124和pSC101等。CoE1是可产生大肠杆菌素的小型多拷贝数质粒，RSF2124是CoE1的派生质粒，pSC101来源于巴拿马沙门氏菌（Salmonella panama）。
22.pSC101质粒
第一个用于基因克隆的天然质粒，仅有一个EcoRI限制性内切酶识别位点，包含有四环素抗性。一种严谨型复制控制的地拷贝数的大肠杆菌质粒载体.平均每个寄主细胞仅有1～2个拷贝；分子量9.09kb 。局限性：分子量较大，拷贝数低，只有一个抗菌素抗性基因。
23.ColE1质粒
优点：复制松弛型质粒，拷贝数高。可通过氯霉素进行进一步扩增。局限性：必须通过大肠杆菌素E1的免疫筛选，在化学上相当麻烦。
24.质粒载体必须具备的条件：具有复制起点；具有抗菌素抗性基因；具有若干限制性内切酶单一识别位点；具有较小的分子量和较高的拷贝数。
25.环丝氨酸富集法选择插入tetr抗性基因的重组子
四环素抗菌作用的机理：通过一种细胞蛋白质的合成，迫使细菌停止生长。是一种抑菌性抗菌素。
26.不同类型的质粒载体
a高拷贝数的质粒载体，用途：用于一般性克隆实验（如：TA克隆，中间载体的构建），目的为了分离大量的高纯度的克隆基因的DNA片段，常用的有CoE1、pMB1或他们的派生质粒。具有分子量低，高拷贝数的优点，而且在没有蛋白质合成的条件下仍能复继续制。
b低拷贝数的质粒载体，自然产生的F因子和pSC101两种质粒外，派生出pLG338、pLG339和pHSG415等质粒。
低拷贝数使得制备大量克隆DNA很困难。在特定的场合下有特殊的用途，因为克隆编码基因用高拷贝数质粒载体时，其产物含量过高会严重扰乱寄主细胞的新陈代谢活动。
c失控的质粒载体，为了解决高拷贝质粒载体克隆基因的超量蛋白表达导致宿主细胞死亡，又可避免低拷贝质粒使克隆基因的表达能力明显下降的问题，使用失控的质粒载体是较好的解决方法。如pOU71质粒，低于37度培养条件下，每条染色体只有一个拷贝的质粒，上升到42度培养条件下，其拷贝数随着增加到1000个以上
d插入失活型载体，为了给载体提供可选择的表型特征，提供可选择性的标记，提高获得阳性克隆的几率。 这时选择使用插入失活型载体。如：pBR329质粒载体的EcoRI酶切位点插入外源DNA片段之后，会使氯霉素抗性基因（cmlr）失去活性。
e正选择的质粒载体，正选择原理：即应用只有突变体或重组DNA分子才能正常生长的的培养条件下进行选择。
.pKN80，可以克隆平末端的DNA片段，携带有Mu噬菌体DNA的EcoRI-C片段，编码一种致死功能的kil基因。转化Mu敏感细胞后，可有效表达。
f表达性质粒载体，按照特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转移成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体。分为：表
达型质粒载体和表达型噬菌体载体两种不同的类型。
典型的大肠杆菌表达型质粒载体，主要组成部分包括：大肠杆菌的启动子及操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因
27.重要的大肠杆菌质粒载体:pSC101载体 CoE1
29.pUC质粒载体的优点：（1）分子量更小、拷贝数更高；（2）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时；（3）MCS区方便转移外源DNA在不同载体系列中 ‚穿梭‛，使具有两种不同粘末端的外源DNA能直接克隆入p UC载体
30.TA克隆
对于基因克隆保存或测序来说，TA克隆是一种快速简便的方法。
TA克隆的策略： 1994年，几位学者发现Taq DNA 聚合酶会在PCR产物的3‘末端加上一个脱氧腺苷（A）。之后，invitrogen 公司发明了TA克隆技术，并拥有全球的TA cloning商标的专利权，直到2013年。线性化的T载体在3’末端拥有一个脱氧胸苷（T），与PCR产物的A尾巴互补。
31.pMD18-T Vector：pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物(TA Cloning) 的专用载体。这种载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体（参见第12章基因工程的载体）的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3'端添加"T" 而成。
因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3'末端添加一个 "A" 的特性，所以使用这种制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
32.E. coli DH5α ：受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal 。pUC质粒载体上的lacZ’ 编码肽与这个缺失突变的-半乳糖苷酶‚互补‛，使它能形成4聚体，又能分解Xgal。产生蓝色物质。
33.互补的插入失活 pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。
34.IPTG的诱导作用 IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZ’肽都表达,从而互补。但载体MCS上插入外源DNA后，
便不能产生肽！
IPTG诱导的结果：MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。 通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。
35.质粒载体不稳定的现象
克隆有外源基因的质粒载体转化到大肠杆菌受体细胞之后，会产生一系列的生理效应，影响到自身的稳定性；可能引起形态学上的变化：丝化现象和脆性增加；产生无质粒的突变体、或拷贝数低的突变体；结构重排导致无法正常表达的突变体。
36.质粒载体不稳定性的类型
分离的不稳定性：指在细胞分裂的过程中，有一个子细胞没有获得质粒DNA拷贝，并最终增殖为无质粒的优势群体。
结构的不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒DNA的重排和缺失。
结构的不稳定性：原因： DNA的缺失、插入和重排。人工构建的多个串联启动子的质粒载体容易发生缺失作用。寄主染色体及质粒载体上的IS因子或转位因子，同样也会引起结构的不稳定性。共同特征：同向重复序列之间的同源重组（short direct repeat）。例如：用含有酪氨酸操纵子的多拷贝质粒载体转化大肠杆菌tryR菌株时，由于IS1因子的插入效应，结果产生出具有插入或缺失的修饰型的质粒载体。
分离的不稳定性：原因：细胞分裂过程中发生的质粒的不平均分配。由于缺陷性分配（defective partitioning）所造成的质粒丢失现象叫质粒分离的不稳定性。
质粒稳定遗传的两个必要条件：a平均每个世代每个质粒至少发生一次复制；b细胞分裂时，复制产生的质粒拷贝必须分配到两个子细胞中去。
质粒拷贝分配到子细胞的途径可分成主动分配和随机分配两种不同的方式。
主动分配的方式有两种：平均分配---每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝；配对位点分配---只有一对质粒呈主动分配，其他随机分配。
由于主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳定。
随机分配：在细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细胞中随机分配的。
37.影响质粒载体稳定性的主要因素。
a新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应
质粒载体增加给寄主细胞DNA复制负荷效应曲线。即寄主细胞生长速度与质粒载体的分子量大小成正比，克隆的外源DNA片段越大，寄主细胞生长缓慢的时间就越长。
b拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响
差度：同样的大肠杆菌培养物中，每个细胞所拥有的质粒载体拷贝数是不尽相同的，这种不同细胞个体之间的质粒载体拷贝数差异程度，简称差度。
产生无质粒载体细胞的速率是由分裂细胞中的质粒载体拷贝数决定的。（实际上质粒载体拷贝数是实验测定大量细胞的平均值）
具低差度分布特性的质粒载体相当稳定，具有高差度分布特性的质粒载体稳定性较差。位于后者的这种分布的低拷贝数一段产生无质粒载体细胞的频率相当高。
c寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应(质粒寡聚体同样是造成质粒不稳定性的重要原因之一)
322和pUC当以单体形式存在时最稳定。随着质粒寡聚体比例的逐渐上升，其稳定性也就相应的下降。
41.随机分配的分子机理
维持随机分配的天然质粒稳定性的分子机理主要有几个方式：一、通过精巧的控制环路使质粒拷贝数的差度限制在最低的水平。天然质粒pMB1拷贝数控制系统中的两级控制，一级为质粒编码的RNAI分子负调控，另一级由质粒rom基因编码的另一种DNA复制阻遏物Rom蛋白质，促使RNAI分子与RNAII分子结合更加稳定，增强了阻遏物的效力。二、通过特异位点的重组作用消除天然质粒的寡聚体。在天然质粒ColE1中发现一个长度为240bp的寡聚体解离位点cer，其功能作用是参与位点特异的分子内重组，使质粒寡聚体转变为单体分子。有趣的是参与重组作用的蛋白质重组酶是由寄主染色体基因编码的。xcrC和xerD基因编码的两种产物所形成的一种异源二聚体重组酶XerCD，通过与cer位点的结合作用，参与重组过程的DNA链的断裂和链接。三、通过调节细胞的分裂活动阻止无质粒细胞的产生。M.E.Patient和
D.K.Summers(1993)在研究ColE1质粒时发现，存在于cer位点中间的一个启动子失活时，便会时质粒的稳定性下降，但并不影响其寡聚体的解离。这个启动子指导合成一种短小的Rcd转
录本，当其超量表达时就会抑制大肠杆菌寄主细胞的分裂。在含有质粒寡聚体的细胞中，因转录活性加强而提高的Rcd转录本水平，会导致这些细胞分裂活动的阻断，从而避免了无质粒细胞的产生，维持质粒的稳定性。四、大肠杆菌素的合成增进了质粒稳定性。大肠杆菌素是一类小分子量的多肽，释放到细胞周围的环境中之后，便会杀死不能产生免疫物质的无相应质粒的细胞。尽管大肠杆菌素的作用并不能改变产生无质粒细胞的频率，但它可以显著的增加此类细胞的表观稳定性（apparent stability），是在大肠杆菌自然群体中维持质粒稳定性的重要手段。
42.主动分配的分子机理
a分配区的结构与功能
低拷贝质粒的稳定性表明，它们在细胞分裂过程中式主动分配的。
仅由一个复制起点和一个选择记号构成的质粒，通常是不稳定的，如同随机分配的质粒一样容易在细胞分裂的过程中丢失掉，如果保持稳定，还需在分子结构中存在有一个编码主动分配体系的par区段。
Par区段，又叫分配区或分配座位，是指能够在细胞分裂过程中直接影响质粒拷贝分配行为的特定质粒DNA序列区。
P1原噬菌体和F因子的par区最为典型。两者的遗传结构相似，都编码有两个反式作用的蛋白质，和一个顺式作用位点。编码这两种分配蛋白质基因是以单一复制子的形式表达，而且其转录作用是在这两种蛋白质产物的协力作用下自动调节的。 P1原噬菌体par区任何一种分配蛋白质超量表达都会造成质粒的极大不稳定性。
b.预配对模型
假定单体形式的Par 蛋白质可与质粒的特定位点结合，结果Par蛋白质的二聚化作用，便带动了两个质粒进行配对，如此产生的二聚体形式的par蛋白质-质粒DNA的复合物，结合在细胞分裂面上的某个位点上，于是随着细胞隔膜的形成，配对的质粒便自然的彼此分开。随后经过DNA的复制反应促使Par蛋白质-质粒DNA复合物从细胞膜上脱落下来。
c.二聚体的解离有助于质粒的主动分配
由cre基因编码的Cre重组酶，能够使质粒二聚体中的正向重复的lox位点发生重组，使之恢
复成单位的形式，从而可以进行成功的分配;不稳定的p1质粒则已经缺失了loxP-cre区，不能合成作用位点特异的Cre重组酶。于是P1重组形成的二聚体就不会被切割成单体形式，故无法进行成功分配;在rec-的大肠杆菌寄主细胞中，p1微型质粒的不稳定性现象便可以大部分消除
d寄主致死功能对质粒稳定性的效应
偶联细胞分裂，含有条件复制缺陷的F派生质粒的寄主细胞培养物，当其被转移到非允许的条件下培养时，质粒便无法复制，细胞仅能生长1~2个世代也就停止了分裂活动，并形成纤丝。这种寄主细胞分裂活动与质粒复制作用之间的相关性现象。
寄主致死功能是通过杀死分裂后出现的无质粒子细胞的方式，提高了质粒的稳定性。
46.R1质粒的寄主致死体系
具质粒的细胞含有hok mRNA，其转移被sok反义RNA阻断。在无质粒细胞中，不稳定的sok RNA被降解掉，结果hok mRNA转译导致细胞死亡。
1.噬菌体的一般生物学特性
依赖于寄主细胞存活。脱离了寄主细胞后既不能生长也不能复制。
基本功能：保护自己的核酸分子（DNA或RNA）免遭环境化学物质的破坏；将其核酸分子注入到被感染的细菌细胞；经被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而能产生出大量的子代噬菌体颗粒；使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒
2.噬菌体的结构及其核酸类型
三种不同基本类型：无尾部的二十面体型；具尾部的二十面体型（大多数噬菌的构形）；线状体型。
3.噬菌体的核酸：双链线性DNA（最常见）；双链环形DNA；单链环形DNA；单链线性DNA；单链RNA
4.噬菌体的生命周期（1）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体）（2）溶源生长周期噬菌体（温和噬菌体）
5.溶菌周期的基本特征
吸附：噬菌体颗粒吸附到位于感染细胞表面的特殊接收器上；注入：噬菌体DNA穿过细胞壁
注入寄主细胞；转变：被感染的细菌细胞的功能发生变化，成为制造噬菌体颗粒的场所；合成：功能发生了转变的寄主细胞大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质；组装：包装了DNA的头部和尾部组装成噬菌体的颗粒，这个过程也叫做噬菌体的形态建成；释放：新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。
7.溶源生命周期
温和噬菌体（temperate phage）：既能进入溶菌生命周期，又能进入溶源生命周期的噬菌体。溶源性细菌（lysogen）：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌，如果某些噬菌体基因缺失了，那么这样的噬菌体就不能完成其溶菌周期，故含有这种噬菌体的细菌叫缺陷型溶源性细菌。 溶源化：用温和的噬菌体感染细菌培养物使之成为温和性噬菌体的过程。
整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体DNA中，叫做已整合的噬菌体DNA。这种噬菌体DNA进入细菌染色体DNA的过程，称为噬菌体DNA的整合或插入。以游离DNA分子形式存在的噬菌体DNA叫做非整合的噬菌体DNA。 原噬菌体：在溶源性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNＡ。
8.超感染免疫性:溶源性的细菌不能被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染，溶源性细菌所具有的这种抗御同种噬菌体再感染的特性，叫做超感染免疫性。
10.插入机理的Campbell模型过程：1.环化成环形分子；2.通过细菌DNA附着点和噬菌体DNA附着位点发生物理性的破裂；3.两个附着位点进行准确的噬菌体DNA和寄主DNA再结合，发生整合作用
11重组噬菌体的分离过程：1.接种培养寄主细胞培养物；2.λ噬菌体和寄主细胞培养物共培养；
3.利用CsCl密度梯度离心的方法分离
1 λ噬菌体的分子生物学概述：λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48 502bp，两端各有12个碱基的5`凸出黏性末端是互补的。进入细胞的λDNA通过两端的黏性末端环化。可用来构建柯斯质粒。λ噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期。
2.λ噬菌体基因组编码基因区域
左侧区：自基因A到基因J，包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因；中间区：介于基因J与基因N之间，这个区又称为非必要区。本区基因与保持噬菌斑形成能
力无关，但包括了一些与重组有关的基因（redA 和redB）。以及整合到大肠杆菌染色体中去的int基因。和把原噬菌体从寄主染色体上删除出去的xis基因；右侧区：位于Ｎ基因的右侧，包括全部主要的调控成分，噬菌体复制基因（Ｏ和Ｐ）以及溶菌基因（Ｓ和Ｒ）
3.注意：λ噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基因编码的蛋白质，同λ噬菌体的两个操纵基因（OL, OR)之间的相互作用来决定的；如果这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态，那么噬菌体便可以进入溶菌周期，否则进行溶源周期。
4.构建λ噬菌体载体的基本原理：野生型的λ噬菌体DNA，对大多数基因克隆中常用的核酸内切酶都有过多的限制位点，通过消除一些多余的限制位点和切除非必要的区段，才可能将它改造成适用的克隆载体。
5.λ噬菌体载体可分为：插入型载体、替换型载体
6.插入型载体：a免疫功能失活的插入型载体：载体基因组上存在一段免疫区，其中带有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。当外源DNA插入到这种位点上时，就会使载体所具有的合成性阻遏物的功能遭受到破坏，而不能进入溶源周期。因此带有外源DNA插入的λ重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成浑浊的噬菌斑。b.Β-半乳糖苷酶失活的插入型载体：载体基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，编码着Β-半乳糖苷酶基因lacZ。由这种载体感染到的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在添加IPTG和Xgal的培养基上就会形成蓝色的噬菌斑。
8.替换型载体
λ噬菌体的中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体 中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列。因此当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被臵换掉，从而有效的提高了克隆外源DNA片段的能力。
9.λ噬菌体载体主要有如下特点：(1)筛选简便；(2)可克隆的片段大，最大可达23 kb，而质粒最大仅10 kb左右；(3)转化效率高。
λ噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能： 38kb ~ 52kb。体外包装：λ噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白
10.凯伦噬菌体载体:既有替换型载体，如凯伦30，又有插入型载体，如凯伦2；
11.λ噬菌体载体的改良:围绕三个目的进行：a设计可对重组体分子作正选择的克隆载体，b构建可方便的通过转录作用制备外源DNA插入序列之RNA探针的克隆载体，c发展可使插入的真核cDNA与β-半乳糖苷酶形成融合蛋白质的克隆载体。
12.Spi-正选择的λ噬菌体载体
特征：中心限制片段上具有λ噬菌体的两个基因，red和gam。野生型的λ噬菌体，不能够在P2噬菌体溶源性细菌中生长，其表型为Spi+，即对P2噬菌体的抑制作用呈敏感性反应，这种抑制作用是受这两个基因编码的产物控制的。如果这两个基因突变，被外源DNA所取代，这样的噬菌体突变体就获得了Spi-表型，能够在P2噬菌体溶源性细菌中生长；具有red和gam基因的替换型载体，可以按照spi特性来选择重组体，因此Spi-表型为我们提供一种正选择标记。
13.具有体内删除特性的λ噬菌体载体
λZAP载体：可将外源DNA片段直接从λ载体转移到质粒载体的快速简便的体内系统；插入型的λ噬菌体载体；包含一个可在体内发生删除作用的pBluescript噬菌粒；由两个单链DNA噬菌体f1的复制信号；两端分别带有T3及T7噬菌体启动子的多克隆位点（MCS）；LacZ插入失活标记。
12.λZAP载体的主要特点：适合于cDNA克隆的并具有体内删除特性的插入型的λ噬菌体载体。a. 具有多种不同的核酸内切限制酶的单识别位点，可以克隆10kb大小的外源DNA片段b与λgt11载体一样，如果插入的外源DNA序列取向及读码结构均保持正确，就能从lacZ启动子表达杂种的或融合的蛋白质，并可用抗体筛选c在其lacZ基因的NH2部位有6个单克隆位点，能发生β-半乳糖甘酶的插入失活效应，故可以再Xgal显色反应平板上筛选重组体分子。d克隆外源DNA片段，可以在体内自动的从噬菌体载体上随pBluescript SK（-）一道删除下来，臵于较小型的噬菌粒载体上从而便于进行限制图的构建和DNA核苷酸的测定e.利用T3或T7噬菌体的RNA聚合酶，λZAP载体能够转录出任何一条链的mRNA分子，因此通过该载体可方便制备外源DNA插入序列的RNA转录本。此外λZAP载体可用于制备RNA探针
13.λ重组体DNA分子的体外包装
DNA过程叫做转染（transfection），它有别于以噬菌体颗
粒为媒介的转导（transduction）。
14.转染效率降低的原因：DNA的体外连接反应中，载体分子同外源DNA片段之间的结合，完全是按一种随机的方式进行的。由此所形成的各种重组体分子中，有相当比例是没有活性的。没有活性的分子不能够转染寄主细胞，因此只是转染效率明显下降。
提高转染率的方法：可使用辅助噬菌体对被感染的寄主细胞进行预处理，可明显提高噬菌斑的转染效率；可使用体外包装技术，把重组DNA分子包装成成熟的噬菌体颗粒，按照正常的噬菌体感染过程导入寄主细胞，可明显提高转染效率。
15.λDNA的体外包装:所谓λDNA的体外包装作用，就是指在体外试管里，完成发生于寄主细胞内的包装过程。第一步：包装反应的底物，即按照滚坏复制的机理合成的多连体形式的DNA，第二步：在具有噬菌体头部前体和A基因产物的条件下，会从COS位点处被切割成λDNA单体分子。第三步：线性分子适于包装，装填到头部外壳里，由于具有12bp长的粘性末端，重新环化。基因D的产物便掺入到完整的头部，接着通过基因W和FII产物的作用，把头部和分别组装的尾部结构连成一体，最终形成成熟的λ噬菌体。
16.λDNA 体外包装存在的两个问题：a包装蛋白质提取物，既能包装外源的DNA，也能包装内源的DNA。因此，用于制备包装蛋白质的溶源性细菌，它们的原噬菌体被诱发产生的内源DNA同样也会被包装起来，从而影响到包装噬菌体的纯度。解决办法：选择适当的原噬菌体基因型加以克服，例如：通过b2区缺失高效地删去了att位点，抑制在诱发过程中发生原噬菌体DNA的删除作用。b外源DNA和诱发的原噬菌体DNA在菌液中发生重组。解决办法：选用重组缺陷（red-，rec-）溶源性细菌，并用紫外线诱导法制备溶菌液。这样就消除了内源DNA的生物学活性，从而克服了这个令人担忧的内外源DNA间的重组问题。
18.λ重组噬菌体的成熟：λDNA的复制从θ形式向滚坏形式的转变，是受自己gam基因控制的。其基本的原理是，该基因的蛋白质产物能够同寄主细胞的外切核酸酶V结合成复合物，而使后者失去了对复制中的λDNA的作用活性。于是， 噬菌体便能够合成出成熟的多连体DNA，供作包装的底物。
19.λ重组体分子的选择方法：a.cI基因功能选择法b.lacZ基因功能选择法根c.Spi-选择法
pHC79载体：pHC79就是由λDNA片段和pBR322质粒DNA联合组成的。pHC79柯斯质粒兼
具了λ噬菌体载体和pBR322质粒载体的两方优点。其克隆能力为31~45kb，而且能够被包装成为具有感染性能的噬菌体颗粒。
2.柯斯质粒载体的特点：a、具有λ噬菌体的特性。柯斯质粒载体克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。但该载体不包含λ噬菌体的全部必要基因，因此不能够通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒。b、具有质粒载体的特性。柯斯质粒载体具有质粒复制子，能够在寄主细胞中象质粒DNA一样进行复制，通常具有抗菌素抗性基因，可作为重组体分子表型选择标记，其中一些还带有基因插入失活的克隆位点。c、具有高容量的克隆能力。柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和cos位点等三个组成部分，其分子量较小，一般只有5～7kb左右，及柯斯质粒载体的克隆极限可达45kb左右。d、具有与同源序列的质粒进行重组的能力。一旦柯斯质粒与一种带有同源序列的质粒共存在同一个寄主细胞当中时，它们之间便会形成共合体。因此，假若柯斯质粒与质粒各自具有一个互不相同的抗药性记号及相容性的复制起点，那么当他们转化到同一寄主细胞之后，便可容易的筛选出含有两个不同不同选择记号的共合体分子。
3.柯斯克隆：应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫做‚柯斯克隆‛
4.柯斯克隆的改良
柯斯克隆的问题：由于经核酸内切酶切割作用产生的线性的柯斯质粒载体，彼此间会通过分子内重组形成多聚体分子；由于经核酸内切酶做局部消化的折合基因组产生出来的DNA片段，在随后的连接反应中，往往会出现两个或数个片段随机在连接的情况。
Ish-Horowiez-Burke柯斯克隆方案
柯斯质粒pJB8特点：由高拷贝数的质粒pAT153派生而来在其BamHI识别位点的两侧，各有一个EcoRI识别位点，可将克隆在上面的片段删除下来。
Bates-Swift柯斯克隆方案
特点：1.具有两个平末端的核酸内切酶Smal 分隔开来的COS位点的柯斯质粒载体；2.使用柯斯质粒载体c2XB,具有核酸内切酶BamHI的单克隆位点。
其他的柯斯克隆方案1）在柯斯质粒载体的多克隆位点的两侧引入一对T3和T7噬菌体的RNA
聚合酶启动子。2）构建于常用大肠杆菌质粒载体没有同源性序列的柯斯载体。3）在柯斯质粒载体中导入真核生物的选择性记号，可作为穿梭载体使用。
1.单链噬菌体的优点：单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形DNA为中间媒介的；无论是复制型的DNA还是单链型的DNA，都能转染感受态的大肠杆菌寄主细胞；单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA多寡制约的；不存在包装限制的问题；可以容易的测定出外源DNA片段的插入取向；可产生大量纯化的含外源DNA片段插入的单链DNA分子。可用于测序。
2..M13噬菌体的生物学特性：M13噬菌体颗粒的外形呈丝状，其大小范围为900×9nm，颗粒中包装的仅是（+）链的DNA；一种雄性大肠杆菌特有的噬菌体，只能感染带有F性须得大肠杆菌菌株，也可通过转染作用导入雌性大肠杆菌细胞；存在RF型DNA和SS型DNA。
3.M13克隆体系中的β-半乳糖苷酶显色反应：常用的这类大肠杆菌菌株有JM101、JM105、JM107、JM109、JM110、TG1、TG2、XL1-Blue、XS127、XS101以及KK2186和MV1184等；β-半乳糖苷酶可以将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯靛蓝，M13克隆体系上有一个完整的lac操纵子。
4.M13载体系列的发展：基因间区段：在M13噬菌体的DNA序列的基因II和Ⅵ之间（第5498到6005个核苷酸止）存在一个长度为507个核苷酸的基因间区段为非必要区段。通过在这个基因间区段内插入外源DNA片段。
6. .M13噬菌体载体：6.4kb单链环状正链DNA基因组。
作载体的优点：（1）单链DNA噬菌体的复制是以双链环形DNA为媒介，这种复制形式的DNA和质粒DNA一样在体外进行纯化和操作；（2）RFDNA和SSDNA都可感染E.coli，产生噬菌斑；（3）无包装限制（可6倍于M13基因组）；（4）易侧出外源DNA的插入方向；（5）可产生能直接测序的单链DNA分子。
7.M13的定向克隆技术 基本思路：用两种不同的核酸内切酶消化外源DNA,可产生出带有两种不同的粘性末端的DNA片段，同样用这两种限制酶切割的载体分子，只有在缴入了一种具有与此功能相同的两种粘性末端的外源DNA片段，才能重新环化。
8.噬菌体展示载体
在丝状噬菌体，存在3到5个拷贝的基因III编码的蛋白质，这类蛋白质对于噬菌体颗粒的正
确组装，及其对大肠杆菌雄性细胞F性须得吸附过程，均具有重要的功能作用。根据这个事实，G.P.Smith于1985年建立了一种专门在丝状噬菌体表面表达蛋白质或多台的所谓噬菌体表面展示技术。
当外源DNA插入在噬菌体展示载体的基因III编码序列中，在两者读码结构保持一致的情况下，就会产生出克隆基因与基因III联合编码的融合蛋白质。
1.噬菌粒载体的概念：一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列，称为噬菌粒（phagemid或 phasmid）
2.噬菌粒载体的优点：1)分子量比m13载体小，3000bp，容易体外操作，可得到长达10kb外源DNA的单链序列；2）具有质粒的复制起点和噬菌体的复制起点，可按质粒的分子形式复制，产生双链DNA3）存在辅助噬菌体情况下，噬菌体的复制方式与m13相同滚环模型复制产生单链DNA，并在包装成噬菌体颗粒后挤压出寄主细胞4）能稳定遗传。
表达系统:基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞 据受体细胞的不同可分为：a原核表达系统：将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。b真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。
原核生物表达体系：大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌
大肠杆菌表达体系的优点： a积累了充足经验，有数不清的载体可供应用；b可因不同载体而选择不同菌种作宿主；c操作安全，致病能力低 ； d成本相对低得多 ；真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称为亚克隆（subclone），然后采用其它方式转移至真核细胞上表达。缺点：a原核生物载体构建的重组体是无法进入动物细胞进行表达；b没有加工所需的酶系统；c热源、内毒素不易除去 ；d常会形成包涵体。
基因工程的目的是使目的基因能高效表达。基因表达受DNA结构、蛋白质因子与核酸相互辨认、结合等组成的表达体系的调控。基因表达调控可在转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰等水平进行。基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。
原核生物基因结构和表达特点:原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶
联的连续进行;原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链; 一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统 ;原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子; 原核生物中参与转录的基因结构：启动子,终止子,增强子; 与转译有关的原核细胞结构：——核糖体结合位点
启动子(promoter, P)指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。具有保守序列：-10区（pribnow box）：TATAAT -35区：RNA聚合酶的δ因子的识别位点 终止子（terminator，T）位于基因3’端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列
外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：a外源基因臵于强启动子和SD顺序控制下b维持正确开放阅读框架（ORF）c mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解 d删除内含子和5’非编码区
影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：启动子：建立表达载体时，选择强启动子。基因剂量：核糖体结合位点： SD顺序与16srRNA3’末端互补程度。AUG—SD间距离。AUG后的核苷酸
常见原核强启动子：Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导。
原核表达载体： 适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。主要元件：强启动子;SD顺序;筛选标志;其它调控基因 类型：融合型表达载体：----融合蛋白
非融合型表达载体：---天然完整蛋白;分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙 卸甲载体：是解除武装的Ti或Ri质粒，其功能是构建转化载体的受体质粒。
Ti的生物学功能:a为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力b参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂素c诱发植物产生冠瘿瘤并决定冠瘿瘤的形态学特征和成分d赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力e赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性f决定寄主菌株的植物寄主范围g有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体的生长和发育，即具有噬菌体的‚排外性‛。
重组DNA的转移过程：a中间载体或重组子（转化）b E.coli(中宿主)（接合）c A.tumefaciens d
在根癌农杆菌中与天然Ti质粒或非致瘤质粒发生共整合作用 e感染植物受伤组织或与植物细胞共培养（转移）f T-DNA进入植物细胞并整合到染色体DNA中g 外源基因表达
Ti质粒作为基因工程载体的缺点：a分子量过大，160~240kb b分布的限制性内切酶多个切点cT-DNA区内含有许多编码基因，其中onc基因产物干扰植物内源激素的平衡，阻碍细胞分化和植株再生d不能在大肠杆菌中复制e存在一些对T-DNA转移不起作用的基因
.pUC118和pUC119噬菌粒载体
1.基因工程：是要按人们的意愿去有目的地改造，创建生物遗传性，因此最基本的工程就是得到目的基因或核酸序列的克隆。分离或改建的基因和核酸序列不能自身繁殖，需要载体携带它们到合适的细胞中复制和表现功能。
2.载体：英文单词Vector，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。
3.理想中基因工程载体的特征：能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力；容易进入宿主细胞，而且进入效率要高；容易插入外源核酸片段，插入后不影响宿主细胞和其在细胞中的复制。要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点；容易从宿主细胞中分离纯化出来，便于重组操作；有容易被识别的筛选标志，便于克隆操作。
4.载体的种类：质粒（Plasmid）载体；入噬菌体；柯斯质粒（Cosmid）；M13噬菌体；杂交质粒；病毒载体，包括穿梭载体（Shuttle ）；细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)；酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)；来源于P1的细菌人工染色体（P1-derived artificial chromosome， PAC）；哺乳动物人工染色体（MAC，mamal artificial chromosome）；人类人工染色体（HAC，human artificial chromosome）；植物人工染色体(PAC)
5 Plasmid 质粒： 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。
1大肠杆菌的各个菌株中找到了不同类型的质粒，主要有三种类型的质粒：F质粒、R质粒和Col质粒。
2.F质粒 F因子或性质粒，能使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在的该质粒受体细胞中。
3.R质粒 通称抗药性因子，可编码一种或数种抗菌素抗性基因，并可将这种抗性转移到缺乏该质粒的适宜受体细胞中，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。
4.Col质粒 即产生大肠杆菌素因子，编码控制大肠杆菌素合成的基因，大肠杆菌素是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。
5.质粒的一般生物学特性
a细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分。可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆的整合到寄主染色体上，随染色体的复制
而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
b绝大多数质粒是环形双链的DNA组成的复制子。
c质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。也有线性质粒，酵母的杀伤质粒是一种RNA质粒。
d根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 e质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。
6.环形双链质粒的三种构型：超螺旋构型（SC）共价闭合环状DNA；开环DNA构型（OC）单链缺口环状DNA；线性分子构型（LC）双链断裂DNA。
7.适于基因克隆载体的质粒DNA分子特征：复制基因（replicator）；选择性记号；克隆位点。
8.质粒DNA编码的表型
a质粒DNA仅占细胞染色体组的一小部分，一般约为1%～3%左右，但却编码一些重要的非染色体控制的遗传性状。
b质粒赋予寄主细菌的特性，包括：抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子，以及其他方面特征。
9.质粒DNA的转移 根据遗传分子特性，质粒可分为：结合型和非结合型质粒。
结合型质粒：即自我转移质粒，除去具有自主复制所必须的遗传信息之外，还有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
非接合型质粒：不能自我转移的质粒。尽管具有自主复制的遗传信息，但失去了控制细胞配对和结合转移的基因，因此不能够从一个细胞自我转移到另一个质粒。（可用于基因克隆载体）
10.F质粒又叫F因子，即致育因子（fertility factor）的简称，是在某些大肠杆菌细胞中发现的一种最有代表性的单拷贝的接合型质粒。 F质粒有三种不同的存在方式：
（i）F+细胞：以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，其上不带有任何来自寄主染色体的基因或DNA区段。（ii）F′细胞：以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时在其上还
携带着细菌的染色体基因或DN区段。（iii）Hfr细胞（高频重组细胞）：以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体。
F因子是雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的F-细胞则叫做雌性细胞。F+细胞的表面可以形成一种叫做性须（pilus）的结构，它促进雄性细胞同雌性细胞进行配对。在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培养，由于性须的作用，就会形成雌雄细胞配对。我们称这种过种为细菌的接合作用(conjugation)。配对之后F-受体细胞获得了F因子，也变成为F+细胞。
由F因子整合到染色体而成的Hfr细胞，就可能引发寄主染色体发生高频转移。这是一种可逆的过程，在一定的条件下，Hfr细胞又可重新变成F+或F′细胞。
11.质粒的结合转移
①细胞交配对的形成 雄性细胞的性须顶端与受体细胞表面接触之后，便会迅速收缩，把给体细胞与受体细胞拉在一起。因此，性须在确立配对细胞表面间的紧密接触方面，起着至关重要的作用。但是，大肠杆菌雄性细胞是不会同其它的亦带有F质粒的细胞发生配对作用的，因为traS和traT编码的‚表面排斥‛蛋白质，使此种细胞无法成为接合作用的受体。这就决定了雄性细胞只能同不具F因子的雌性细胞配对的特异性。
②质粒DNA的转移 F质粒DNA的转移是从转移起点oriT开始的。当细胞交配对建立之后，TraY和TraI蛋白质首先在oriT位点作单链切割，随后缺口链在其游离的5′-端的引导下转移到受体细胞，并作为模板合成互补链，形成新的质粒分子。于是受体细胞便转变成为具有F因子的雄性细胞
12.质粒DNA的迁移作用
非接合型的质粒，由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能够自多转移。但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫做质粒的迁移作用（mobilization）。
13.ColE1质粒的迁移模型
ColE1是一种可以迁移但是属于非接合型的质粒。需要质粒自己编码的两种基因参与。一个是位于ColE1 DNA上的特异位点bom；另一个是ColE1质粒特有的弥散的基因产物，即mob基
因（mobilization gene）编码的核酸酶。
相容性的两种质粒F和ColE1共存于同一细菌细胞中，F质粒可以为ColE1质粒提供经所缺乏的结合功能，这样使得ColE1质粒也能够发生转移作用。
14.质粒DNA的复制类型
根据寄主细胞所含的拷贝数的多少，可将质粒分成两种不同的复制型：一种是低拷贝数的质粒，每个寄主细胞中仅含有1～3份的拷贝，我们称这类质粒为‚严紧型‛复制控制的质粒（stringent plasmid）；另一类是高拷贝数的质粒，每个寄主细胞中可高达10～60份拷贝，这类质粒被称为‚松弛型‛复制控制的质粒（relaxed plasmid）。
质粒拷贝数,是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
15.质粒的不亲和性
质粒的不亲和性现象：所谓质粒的不亲和性（plasmid incompatibility），有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。
不亲和群（incompatibility group），指具有亲缘关系，但彼此之间是互不相容的质粒。
16.质粒不亲和性的分子基础
主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。
大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白质，其浓度是与质粒的拷贝数成正比的。阻遏蛋白质通过同其靶序列间的相互作用，使双链DNA中的一条链断裂，从而导致质粒DNA复制的启动，并建立起一种调节质粒拷贝数的负反馈环（negative feedback loop）。当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白质时，其复制启动便被抑制了；而当质粒处于低拷贝和低浓度遏蛋白质的条件下，它的复制反应便会继续进行。
由于每一种质粒的复制速率拷贝数控制，都是由一对不相容质粒产生的阻遏蛋白质总浓度联合调控的，这种交叉抑制的结果，使细胞中质粒拷贝数，比其单独感染状态下的正常拷贝数减少许多。
17.质粒DNA复制的多样性
不同质粒DNA的复制存在如下几个方面多样性：1）对寄主酶的依赖性 有些质粒完全依赖寄主细胞提供的核酸酶进行复制，也有的质粒自身编码有若干种核酸酶，直接参与DNA的复制。2）DNA聚合酶的利用 绝大多数质粒是利用polⅢ聚合酶进行链的延长合成。也有质粒ColE1，利用polⅡ聚合酶进行链的延长合成 3）复制的方向性 分为纯单向性的（ColE1）和纯双向性的（F质粒）两种不同的形式。 R6K质粒开始是单向进行，到晚期则从同一复制起点开始按相反方向进行。4）复制的终止 单向性复制的质粒，经过一个周期的复制在起点处终止复制。双向性的质粒有两种终止方式：一是待双向生长的复制叉同时到达同一位点时，才发生终止。二是具有一个共同的复制位点。5）复制型 碟状模型（butterfly model）
18.质粒DNA拷贝数的控制 天然质粒拷贝数的控制 高拷贝数的质粒倾向在松弛控制下复制，低拷贝数质粒倾向在严谨控制下复制。高拷贝数的质粒复制是由质粒编码基因合成的功能蛋白质调节的。低拷贝数质粒复制依赖寄主细胞不稳定的蛋白质控制，并随着寄主染色体的复制而复制。
19.杂种质粒拷贝数的控制 pSC134质粒的亲本质粒为ColE1和pSC101。
20.质粒复制控制的分子模型：抑制蛋白稀释模型、自体阻遏蛋白质模型
21.天然质粒做克隆载体的局限性
天然质粒是那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。常用的天然质粒有CoE1、RSF2124和pSC101等。CoE1是可产生大肠杆菌素的小型多拷贝数质粒，RSF2124是CoE1的派生质粒，pSC101来源于巴拿马沙门氏菌（Salmonella panama）。
22.pSC101质粒
第一个用于基因克隆的天然质粒，仅有一个EcoRI限制性内切酶识别位点，包含有四环素抗性。一种严谨型复制控制的地拷贝数的大肠杆菌质粒载体.平均每个寄主细胞仅有1～2个拷贝；分子量9.09kb 。局限性：分子量较大，拷贝数低，只有一个抗菌素抗性基因。
23.ColE1质粒
优点：复制松弛型质粒，拷贝数高。可通过氯霉素进行进一步扩增。局限性：必须通过大肠杆菌素E1的免疫筛选，在化学上相当麻烦。
24.质粒载体必须具备的条件：具有复制起点；具有抗菌素抗性基因；具有若干限制性内切酶单一识别位点；具有较小的分子量和较高的拷贝数。
25.环丝氨酸富集法选择插入tetr抗性基因的重组子
四环素抗菌作用的机理：通过一种细胞蛋白质的合成，迫使细菌停止生长。是一种抑菌性抗菌素。
26.不同类型的质粒载体
a高拷贝数的质粒载体，用途：用于一般性克隆实验（如：TA克隆，中间载体的构建），目的为了分离大量的高纯度的克隆基因的DNA片段，常用的有CoE1、pMB1或他们的派生质粒。具有分子量低，高拷贝数的优点，而且在没有蛋白质合成的条件下仍能复继续制。
b低拷贝数的质粒载体，自然产生的F因子和pSC101两种质粒外，派生出pLG338、pLG339和pHSG415等质粒。
低拷贝数使得制备大量克隆DNA很困难。在特定的场合下有特殊的用途，因为克隆编码基因用高拷贝数质粒载体时，其产物含量过高会严重扰乱寄主细胞的新陈代谢活动。
c失控的质粒载体，为了解决高拷贝质粒载体克隆基因的超量蛋白表达导致宿主细胞死亡，又可避免低拷贝质粒使克隆基因的表达能力明显下降的问题，使用失控的质粒载体是较好的解决方法。如pOU71质粒，低于37度培养条件下，每条染色体只有一个拷贝的质粒，上升到42度培养条件下，其拷贝数随着增加到1000个以上
d插入失活型载体，为了给载体提供可选择的表型特征，提供可选择性的标记，提高获得阳性克隆的几率。 这时选择使用插入失活型载体。如：pBR329质粒载体的EcoRI酶切位点插入外源DNA片段之后，会使氯霉素抗性基因（cmlr）失去活性。
e正选择的质粒载体，正选择原理：即应用只有突变体或重组DNA分子才能正常生长的的培养条件下进行选择。
.pKN80，可以克隆平末端的DNA片段，携带有Mu噬菌体DNA的EcoRI-C片段，编码一种致死功能的kil基因。转化Mu敏感细胞后，可有效表达。
f表达性质粒载体，按照特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转移成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体。分为：表
达型质粒载体和表达型噬菌体载体两种不同的类型。
典型的大肠杆菌表达型质粒载体，主要组成部分包括：大肠杆菌的启动子及操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因
27.重要的大肠杆菌质粒载体:pSC101载体 CoE1
29.pUC质粒载体的优点：（1）分子量更小、拷贝数更高；（2）免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时；（3）MCS区方便转移外源DNA在不同载体系列中 ‚穿梭‛，使具有两种不同粘末端的外源DNA能直接克隆入p UC载体
30.TA克隆
对于基因克隆保存或测序来说，TA克隆是一种快速简便的方法。
TA克隆的策略： 1994年，几位学者发现Taq DNA 聚合酶会在PCR产物的3‘末端加上一个脱氧腺苷（A）。之后，invitrogen 公司发明了TA克隆技术，并拥有全球的TA cloning商标的专利权，直到2013年。线性化的T载体在3’末端拥有一个脱氧胸苷（T），与PCR产物的A尾巴互补。
31.pMD18-T Vector：pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物(TA Cloning) 的专用载体。这种载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体（参见第12章基因工程的载体）的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3'端添加"T" 而成。
因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3'末端添加一个 "A" 的特性，所以使用这种制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
32.E. coli DH5α ：受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal 。pUC质粒载体上的lacZ’ 编码肽与这个缺失突变的-半乳糖苷酶‚互补‛，使它能形成4聚体，又能分解Xgal。产生蓝色物质。
33.互补的插入失活 pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。
34.IPTG的诱导作用 IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZ’肽都表达,从而互补。但载体MCS上插入外源DNA后，
便不能产生肽！
IPTG诱导的结果：MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。 通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。
35.质粒载体不稳定的现象
克隆有外源基因的质粒载体转化到大肠杆菌受体细胞之后，会产生一系列的生理效应，影响到自身的稳定性；可能引起形态学上的变化：丝化现象和脆性增加；产生无质粒的突变体、或拷贝数低的突变体；结构重排导致无法正常表达的突变体。
36.质粒载体不稳定性的类型
分离的不稳定性：指在细胞分裂的过程中，有一个子细胞没有获得质粒DNA拷贝，并最终增殖为无质粒的优势群体。
结构的不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒DNA的重排和缺失。
结构的不稳定性：原因： DNA的缺失、插入和重排。人工构建的多个串联启动子的质粒载体容易发生缺失作用。寄主染色体及质粒载体上的IS因子或转位因子，同样也会引起结构的不稳定性。共同特征：同向重复序列之间的同源重组（short direct repeat）。例如：用含有酪氨酸操纵子的多拷贝质粒载体转化大肠杆菌tryR菌株时，由于IS1因子的插入效应，结果产生出具有插入或缺失的修饰型的质粒载体。
分离的不稳定性：原因：细胞分裂过程中发生的质粒的不平均分配。由于缺陷性分配（defective partitioning）所造成的质粒丢失现象叫质粒分离的不稳定性。
质粒稳定遗传的两个必要条件：a平均每个世代每个质粒至少发生一次复制；b细胞分裂时，复制产生的质粒拷贝必须分配到两个子细胞中去。
质粒拷贝分配到子细胞的途径可分成主动分配和随机分配两种不同的方式。
主动分配的方式有两种：平均分配---每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝；配对位点分配---只有一对质粒呈主动分配，其他随机分配。
由于主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳定。
随机分配：在细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细胞中随机分配的。
37.影响质粒载体稳定性的主要因素。
a新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应
质粒载体增加给寄主细胞DNA复制负荷效应曲线。即寄主细胞生长速度与质粒载体的分子量大小成正比，克隆的外源DNA片段越大，寄主细胞生长缓慢的时间就越长。
b拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响
差度：同样的大肠杆菌培养物中，每个细胞所拥有的质粒载体拷贝数是不尽相同的，这种不同细胞个体之间的质粒载体拷贝数差异程度，简称差度。
产生无质粒载体细胞的速率是由分裂细胞中的质粒载体拷贝数决定的。（实际上质粒载体拷贝数是实验测定大量细胞的平均值）
具低差度分布特性的质粒载体相当稳定，具有高差度分布特性的质粒载体稳定性较差。位于后者的这种分布的低拷贝数一段产生无质粒载体细胞的频率相当高。
c寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应(质粒寡聚体同样是造成质粒不稳定性的重要原因之一)
322和pUC当以单体形式存在时最稳定。随着质粒寡聚体比例的逐渐上升，其稳定性也就相应的下降。
41.随机分配的分子机理
维持随机分配的天然质粒稳定性的分子机理主要有几个方式：一、通过精巧的控制环路使质粒拷贝数的差度限制在最低的水平。天然质粒pMB1拷贝数控制系统中的两级控制，一级为质粒编码的RNAI分子负调控，另一级由质粒rom基因编码的另一种DNA复制阻遏物Rom蛋白质，促使RNAI分子与RNAII分子结合更加稳定，增强了阻遏物的效力。二、通过特异位点的重组作用消除天然质粒的寡聚体。在天然质粒ColE1中发现一个长度为240bp的寡聚体解离位点cer，其功能作用是参与位点特异的分子内重组，使质粒寡聚体转变为单体分子。有趣的是参与重组作用的蛋白质重组酶是由寄主染色体基因编码的。xcrC和xerD基因编码的两种产物所形成的一种异源二聚体重组酶XerCD，通过与cer位点的结合作用，参与重组过程的DNA链的断裂和链接。三、通过调节细胞的分裂活动阻止无质粒细胞的产生。M.E.Patient和
D.K.Summers(1993)在研究ColE1质粒时发现，存在于cer位点中间的一个启动子失活时，便会时质粒的稳定性下降，但并不影响其寡聚体的解离。这个启动子指导合成一种短小的Rcd转
录本，当其超量表达时就会抑制大肠杆菌寄主细胞的分裂。在含有质粒寡聚体的细胞中，因转录活性加强而提高的Rcd转录本水平，会导致这些细胞分裂活动的阻断，从而避免了无质粒细胞的产生，维持质粒的稳定性。四、大肠杆菌素的合成增进了质粒稳定性。大肠杆菌素是一类小分子量的多肽，释放到细胞周围的环境中之后，便会杀死不能产生免疫物质的无相应质粒的细胞。尽管大肠杆菌素的作用并不能改变产生无质粒细胞的频率，但它可以显著的增加此类细胞的表观稳定性（apparent stability），是在大肠杆菌自然群体中维持质粒稳定性的重要手段。
42.主动分配的分子机理
a分配区的结构与功能
低拷贝质粒的稳定性表明，它们在细胞分裂过程中式主动分配的。
仅由一个复制起点和一个选择记号构成的质粒，通常是不稳定的，如同随机分配的质粒一样容易在细胞分裂的过程中丢失掉，如果保持稳定，还需在分子结构中存在有一个编码主动分配体系的par区段。
Par区段，又叫分配区或分配座位，是指能够在细胞分裂过程中直接影响质粒拷贝分配行为的特定质粒DNA序列区。
P1原噬菌体和F因子的par区最为典型。两者的遗传结构相似，都编码有两个反式作用的蛋白质，和一个顺式作用位点。编码这两种分配蛋白质基因是以单一复制子的形式表达，而且其转录作用是在这两种蛋白质产物的协力作用下自动调节的。 P1原噬菌体par区任何一种分配蛋白质超量表达都会造成质粒的极大不稳定性。
b.预配对模型
假定单体形式的Par 蛋白质可与质粒的特定位点结合，结果Par蛋白质的二聚化作用，便带动了两个质粒进行配对，如此产生的二聚体形式的par蛋白质-质粒DNA的复合物，结合在细胞分裂面上的某个位点上，于是随着细胞隔膜的形成，配对的质粒便自然的彼此分开。随后经过DNA的复制反应促使Par蛋白质-质粒DNA复合物从细胞膜上脱落下来。
c.二聚体的解离有助于质粒的主动分配
由cre基因编码的Cre重组酶，能够使质粒二聚体中的正向重复的lox位点发生重组，使之恢
复成单位的形式，从而可以进行成功的分配;不稳定的p1质粒则已经缺失了loxP-cre区，不能合成作用位点特异的Cre重组酶。于是P1重组形成的二聚体就不会被切割成单体形式，故无法进行成功分配;在rec-的大肠杆菌寄主细胞中，p1微型质粒的不稳定性现象便可以大部分消除
d寄主致死功能对质粒稳定性的效应
偶联细胞分裂，含有条件复制缺陷的F派生质粒的寄主细胞培养物，当其被转移到非允许的条件下培养时，质粒便无法复制，细胞仅能生长1~2个世代也就停止了分裂活动，并形成纤丝。这种寄主细胞分裂活动与质粒复制作用之间的相关性现象。
寄主致死功能是通过杀死分裂后出现的无质粒子细胞的方式，提高了质粒的稳定性。
46.R1质粒的寄主致死体系
具质粒的细胞含有hok mRNA，其转移被sok反义RNA阻断。在无质粒细胞中，不稳定的sok RNA被降解掉，结果hok mRNA转译导致细胞死亡。
1.噬菌体的一般生物学特性
依赖于寄主细胞存活。脱离了寄主细胞后既不能生长也不能复制。
基本功能：保护自己的核酸分子（DNA或RNA）免遭环境化学物质的破坏；将其核酸分子注入到被感染的细菌细胞；经被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而能产生出大量的子代噬菌体颗粒；使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒
2.噬菌体的结构及其核酸类型
三种不同基本类型：无尾部的二十面体型；具尾部的二十面体型（大多数噬菌的构形）；线状体型。
3.噬菌体的核酸：双链线性DNA（最常见）；双链环形DNA；单链环形DNA；单链线性DNA；单链RNA
4.噬菌体的生命周期（1）溶菌生长周期噬菌体（烈性噬菌体）（2）溶源生长周期噬菌体（温和噬菌体）
5.溶菌周期的基本特征
吸附：噬菌体颗粒吸附到位于感染细胞表面的特殊接收器上；注入：噬菌体DNA穿过细胞壁
注入寄主细胞；转变：被感染的细菌细胞的功能发生变化，成为制造噬菌体颗粒的场所；合成：功能发生了转变的寄主细胞大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质；组装：包装了DNA的头部和尾部组装成噬菌体的颗粒，这个过程也叫做噬菌体的形态建成；释放：新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。
7.溶源生命周期
温和噬菌体（temperate phage）：既能进入溶菌生命周期，又能进入溶源生命周期的噬菌体。溶源性细菌（lysogen）：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌，如果某些噬菌体基因缺失了，那么这样的噬菌体就不能完成其溶菌周期，故含有这种噬菌体的细菌叫缺陷型溶源性细菌。 溶源化：用温和的噬菌体感染细菌培养物使之成为温和性噬菌体的过程。
整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体DNA中，叫做已整合的噬菌体DNA。这种噬菌体DNA进入细菌染色体DNA的过程，称为噬菌体DNA的整合或插入。以游离DNA分子形式存在的噬菌体DNA叫做非整合的噬菌体DNA。 原噬菌体：在溶源性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNＡ。
8.超感染免疫性:溶源性的细菌不能被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染，溶源性细菌所具有的这种抗御同种噬菌体再感染的特性，叫做超感染免疫性。
10.插入机理的Campbell模型过程：1.环化成环形分子；2.通过细菌DNA附着点和噬菌体DNA附着位点发生物理性的破裂；3.两个附着位点进行准确的噬菌体DNA和寄主DNA再结合，发生整合作用
11重组噬菌体的分离过程：1.接种培养寄主细胞培养物；2.λ噬菌体和寄主细胞培养物共培养；
3.利用CsCl密度梯度离心的方法分离
1 λ噬菌体的分子生物学概述：λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48 502bp，两端各有12个碱基的5`凸出黏性末端是互补的。进入细胞的λDNA通过两端的黏性末端环化。可用来构建柯斯质粒。λ噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期。
2.λ噬菌体基因组编码基因区域
左侧区：自基因A到基因J，包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因；中间区：介于基因J与基因N之间，这个区又称为非必要区。本区基因与保持噬菌斑形成能
力无关，但包括了一些与重组有关的基因（redA 和redB）。以及整合到大肠杆菌染色体中去的int基因。和把原噬菌体从寄主染色体上删除出去的xis基因；右侧区：位于Ｎ基因的右侧，包括全部主要的调控成分，噬菌体复制基因（Ｏ和Ｐ）以及溶菌基因（Ｓ和Ｒ）
3.注意：λ噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基因编码的蛋白质，同λ噬菌体的两个操纵基因（OL, OR)之间的相互作用来决定的；如果这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态，那么噬菌体便可以进入溶菌周期，否则进行溶源周期。
4.构建λ噬菌体载体的基本原理：野生型的λ噬菌体DNA，对大多数基因克隆中常用的核酸内切酶都有过多的限制位点，通过消除一些多余的限制位点和切除非必要的区段，才可能将它改造成适用的克隆载体。
5.λ噬菌体载体可分为：插入型载体、替换型载体
6.插入型载体：a免疫功能失活的插入型载体：载体基因组上存在一段免疫区，其中带有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。当外源DNA插入到这种位点上时，就会使载体所具有的合成性阻遏物的功能遭受到破坏，而不能进入溶源周期。因此带有外源DNA插入的λ重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成浑浊的噬菌斑。b.Β-半乳糖苷酶失活的插入型载体：载体基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，编码着Β-半乳糖苷酶基因lacZ。由这种载体感染到的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在添加IPTG和Xgal的培养基上就会形成蓝色的噬菌斑。
8.替换型载体
λ噬菌体的中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体 中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列。因此当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA片段便会被臵换掉，从而有效的提高了克隆外源DNA片段的能力。
9.λ噬菌体载体主要有如下特点：(1)筛选简便；(2)可克隆的片段大，最大可达23 kb，而质粒最大仅10 kb左右；(3)转化效率高。
λ噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能： 38kb ~ 52kb。体外包装：λ噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白
10.凯伦噬菌体载体:既有替换型载体，如凯伦30，又有插入型载体，如凯伦2；
11.λ噬菌体载体的改良:围绕三个目的进行：a设计可对重组体分子作正选择的克隆载体，b构建可方便的通过转录作用制备外源DNA插入序列之RNA探针的克隆载体，c发展可使插入的真核cDNA与β-半乳糖苷酶形成融合蛋白质的克隆载体。
12.Spi-正选择的λ噬菌体载体
特征：中心限制片段上具有λ噬菌体的两个基因，red和gam。野生型的λ噬菌体，不能够在P2噬菌体溶源性细菌中生长，其表型为Spi+，即对P2噬菌体的抑制作用呈敏感性反应，这种抑制作用是受这两个基因编码的产物控制的。如果这两个基因突变，被外源DNA所取代，这样的噬菌体突变体就获得了Spi-表型，能够在P2噬菌体溶源性细菌中生长；具有red和gam基因的替换型载体，可以按照spi特性来选择重组体，因此Spi-表型为我们提供一种正选择标记。
13.具有体内删除特性的λ噬菌体载体
λZAP载体：可将外源DNA片段直接从λ载体转移到质粒载体的快速简便的体内系统；插入型的λ噬菌体载体；包含一个可在体内发生删除作用的pBluescript噬菌粒；由两个单链DNA噬菌体f1的复制信号；两端分别带有T3及T7噬菌体启动子的多克隆位点（MCS）；LacZ插入失活标记。
12.λZAP载体的主要特点：适合于cDNA克隆的并具有体内删除特性的插入型的λ噬菌体载体。a. 具有多种不同的核酸内切限制酶的单识别位点，可以克隆10kb大小的外源DNA片段b与λgt11载体一样，如果插入的外源DNA序列取向及读码结构均保持正确，就能从lacZ启动子表达杂种的或融合的蛋白质，并可用抗体筛选c在其lacZ基因的NH2部位有6个单克隆位点，能发生β-半乳糖甘酶的插入失活效应，故可以再Xgal显色反应平板上筛选重组体分子。d克隆外源DNA片段，可以在体内自动的从噬菌体载体上随pBluescript SK（-）一道删除下来，臵于较小型的噬菌粒载体上从而便于进行限制图的构建和DNA核苷酸的测定e.利用T3或T7噬菌体的RNA聚合酶，λZAP载体能够转录出任何一条链的mRNA分子，因此通过该载体可方便制备外源DNA插入序列的RNA转录本。此外λZAP载体可用于制备RNA探针
13.λ重组体DNA分子的体外包装
DNA过程叫做转染（transfection），它有别于以噬菌体颗
粒为媒介的转导（transduction）。
14.转染效率降低的原因：DNA的体外连接反应中，载体分子同外源DNA片段之间的结合，完全是按一种随机的方式进行的。由此所形成的各种重组体分子中，有相当比例是没有活性的。没有活性的分子不能够转染寄主细胞，因此只是转染效率明显下降。
提高转染率的方法：可使用辅助噬菌体对被感染的寄主细胞进行预处理，可明显提高噬菌斑的转染效率；可使用体外包装技术，把重组DNA分子包装成成熟的噬菌体颗粒，按照正常的噬菌体感染过程导入寄主细胞，可明显提高转染效率。
15.λDNA的体外包装:所谓λDNA的体外包装作用，就是指在体外试管里，完成发生于寄主细胞内的包装过程。第一步：包装反应的底物，即按照滚坏复制的机理合成的多连体形式的DNA，第二步：在具有噬菌体头部前体和A基因产物的条件下，会从COS位点处被切割成λDNA单体分子。第三步：线性分子适于包装，装填到头部外壳里，由于具有12bp长的粘性末端，重新环化。基因D的产物便掺入到完整的头部，接着通过基因W和FII产物的作用，把头部和分别组装的尾部结构连成一体，最终形成成熟的λ噬菌体。
16.λDNA 体外包装存在的两个问题：a包装蛋白质提取物，既能包装外源的DNA，也能包装内源的DNA。因此，用于制备包装蛋白质的溶源性细菌，它们的原噬菌体被诱发产生的内源DNA同样也会被包装起来，从而影响到包装噬菌体的纯度。解决办法：选择适当的原噬菌体基因型加以克服，例如：通过b2区缺失高效地删去了att位点，抑制在诱发过程中发生原噬菌体DNA的删除作用。b外源DNA和诱发的原噬菌体DNA在菌液中发生重组。解决办法：选用重组缺陷（red-，rec-）溶源性细菌，并用紫外线诱导法制备溶菌液。这样就消除了内源DNA的生物学活性，从而克服了这个令人担忧的内外源DNA间的重组问题。
18.λ重组噬菌体的成熟：λDNA的复制从θ形式向滚坏形式的转变，是受自己gam基因控制的。其基本的原理是，该基因的蛋白质产物能够同寄主细胞的外切核酸酶V结合成复合物，而使后者失去了对复制中的λDNA的作用活性。于是， 噬菌体便能够合成出成熟的多连体DNA，供作包装的底物。
19.λ重组体分子的选择方法：a.cI基因功能选择法b.lacZ基因功能选择法根c.Spi-选择法
pHC79载体：pHC79就是由λDNA片段和pBR322质粒DNA联合组成的。pHC79柯斯质粒兼
具了λ噬菌体载体和pBR322质粒载体的两方优点。其克隆能力为31~45kb，而且能够被包装成为具有感染性能的噬菌体颗粒。
2.柯斯质粒载体的特点：a、具有λ噬菌体的特性。柯斯质粒载体克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。但该载体不包含λ噬菌体的全部必要基因，因此不能够通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒。b、具有质粒载体的特性。柯斯质粒载体具有质粒复制子，能够在寄主细胞中象质粒DNA一样进行复制，通常具有抗菌素抗性基因，可作为重组体分子表型选择标记，其中一些还带有基因插入失活的克隆位点。c、具有高容量的克隆能力。柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点，一两个选择记号和cos位点等三个组成部分，其分子量较小，一般只有5～7kb左右，及柯斯质粒载体的克隆极限可达45kb左右。d、具有与同源序列的质粒进行重组的能力。一旦柯斯质粒与一种带有同源序列的质粒共存在同一个寄主细胞当中时，它们之间便会形成共合体。因此，假若柯斯质粒与质粒各自具有一个互不相同的抗药性记号及相容性的复制起点，那么当他们转化到同一寄主细胞之后，便可容易的筛选出含有两个不同不同选择记号的共合体分子。
3.柯斯克隆：应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫做‚柯斯克隆‛
4.柯斯克隆的改良
柯斯克隆的问题：由于经核酸内切酶切割作用产生的线性的柯斯质粒载体，彼此间会通过分子内重组形成多聚体分子；由于经核酸内切酶做局部消化的折合基因组产生出来的DNA片段，在随后的连接反应中，往往会出现两个或数个片段随机在连接的情况。
Ish-Horowiez-Burke柯斯克隆方案
柯斯质粒pJB8特点：由高拷贝数的质粒pAT153派生而来在其BamHI识别位点的两侧，各有一个EcoRI识别位点，可将克隆在上面的片段删除下来。
Bates-Swift柯斯克隆方案
特点：1.具有两个平末端的核酸内切酶Smal 分隔开来的COS位点的柯斯质粒载体；2.使用柯斯质粒载体c2XB,具有核酸内切酶BamHI的单克隆位点。
其他的柯斯克隆方案1）在柯斯质粒载体的多克隆位点的两侧引入一对T3和T7噬菌体的RNA
聚合酶启动子。2）构建于常用大肠杆菌质粒载体没有同源性序列的柯斯载体。3）在柯斯质粒载体中导入真核生物的选择性记号，可作为穿梭载体使用。
1.单链噬菌体的优点：单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形DNA为中间媒介的；无论是复制型的DNA还是单链型的DNA，都能转染感受态的大肠杆菌寄主细胞；单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA多寡制约的；不存在包装限制的问题；可以容易的测定出外源DNA片段的插入取向；可产生大量纯化的含外源DNA片段插入的单链DNA分子。可用于测序。
2..M13噬菌体的生物学特性：M13噬菌体颗粒的外形呈丝状，其大小范围为900×9nm，颗粒中包装的仅是（+）链的DNA；一种雄性大肠杆菌特有的噬菌体，只能感染带有F性须得大肠杆菌菌株，也可通过转染作用导入雌性大肠杆菌细胞；存在RF型DNA和SS型DNA。
3.M13克隆体系中的β-半乳糖苷酶显色反应：常用的这类大肠杆菌菌株有JM101、JM105、JM107、JM109、JM110、TG1、TG2、XL1-Blue、XS127、XS101以及KK2186和MV1184等；β-半乳糖苷酶可以将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯靛蓝，M13克隆体系上有一个完整的lac操纵子。
4.M13载体系列的发展：基因间区段：在M13噬菌体的DNA序列的基因II和Ⅵ之间（第5498到6005个核苷酸止）存在一个长度为507个核苷酸的基因间区段为非必要区段。通过在这个基因间区段内插入外源DNA片段。
6. .M13噬菌体载体：6.4kb单链环状正链DNA基因组。
作载体的优点：（1）单链DNA噬菌体的复制是以双链环形DNA为媒介，这种复制形式的DNA和质粒DNA一样在体外进行纯化和操作；（2）RFDNA和SSDNA都可感染E.coli，产生噬菌斑；（3）无包装限制（可6倍于M13基因组）；（4）易侧出外源DNA的插入方向；（5）可产生能直接测序的单链DNA分子。
7.M13的定向克隆技术 基本思路：用两种不同的核酸内切酶消化外源DNA,可产生出带有两种不同的粘性末端的DNA片段，同样用这两种限制酶切割的载体分子，只有在缴入了一种具有与此功能相同的两种粘性末端的外源DNA片段，才能重新环化。
8.噬菌体展示载体
在丝状噬菌体，存在3到5个拷贝的基因III编码的蛋白质，这类蛋白质对于噬菌体颗粒的正
确组装，及其对大肠杆菌雄性细胞F性须得吸附过程，均具有重要的功能作用。根据这个事实，G.P.Smith于1985年建立了一种专门在丝状噬菌体表面表达蛋白质或多台的所谓噬菌体表面展示技术。
当外源DNA插入在噬菌体展示载体的基因III编码序列中，在两者读码结构保持一致的情况下，就会产生出克隆基因与基因III联合编码的融合蛋白质。
1.噬菌粒载体的概念：一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列，称为噬菌粒（phagemid或 phasmid）
2.噬菌粒载体的优点：1)分子量比m13载体小，3000bp，容易体外操作，可得到长达10kb外源DNA的单链序列；2）具有质粒的复制起点和噬菌体的复制起点，可按质粒的分子形式复制，产生双链DNA3）存在辅助噬菌体情况下，噬菌体的复制方式与m13相同滚环模型复制产生单链DNA，并在包装成噬菌体颗粒后挤压出寄主细胞4）能稳定遗传。
表达系统:基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞 据受体细胞的不同可分为：a原核表达系统：将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。b真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。
原核生物表达体系：大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌
大肠杆菌表达体系的优点： a积累了充足经验，有数不清的载体可供应用；b可因不同载体而选择不同菌种作宿主；c操作安全，致病能力低 ； d成本相对低得多 ；真核生物的基因先在原核体系上构建克隆，称为亚克隆（subclone），然后采用其它方式转移至真核细胞上表达。缺点：a原核生物载体构建的重组体是无法进入动物细胞进行表达；b没有加工所需的酶系统；c热源、内毒素不易除去 ；d常会形成包涵体。
基因工程的目的是使目的基因能高效表达。基因表达受DNA结构、蛋白质因子与核酸相互辨认、结合等组成的表达体系的调控。基因表达调控可在转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰等水平进行。基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知识，应用已知的调控序列进行重组、改造。
原核生物基因结构和表达特点:原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶
联的连续进行;原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链; 一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统 ;原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子; 原核生物中参与转录的基因结构：启动子,终止子,增强子; 与转译有关的原核细胞结构：——核糖体结合位点
启动子(promoter, P)指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。具有保守序列：-10区（pribnow box）：TATAAT -35区：RNA聚合酶的δ因子的识别位点 终止子（terminator，T）位于基因3’端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列
外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：a外源基因臵于强启动子和SD顺序控制下b维持正确开放阅读框架（ORF）c mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解 d删除内含子和5’非编码区
影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：启动子：建立表达载体时，选择强启动子。基因剂量：核糖体结合位点： SD顺序与16srRNA3’末端互补程度。AUG—SD间距离。AUG后的核苷酸
常见原核强启动子：Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导。
原核表达载体： 适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。主要元件：强启动子;SD顺序;筛选标志;其它调控基因 类型：融合型表达载体：----融合蛋白
非融合型表达载体：---天然完整蛋白;分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙 卸甲载体：是解除武装的Ti或Ri质粒，其功能是构建转化载体的受体质粒。
Ti的生物学功能:a为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力b参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂素c诱发植物产生冠瘿瘤并决定冠瘿瘤的形态学特征和成分d赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力e赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性f决定寄主菌株的植物寄主范围g有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体的生长和发育，即具有噬菌体的‚排外性‛。
重组DNA的转移过程：a中间载体或重组子（转化）b E.coli(中宿主)（接合）c A.tumefaciens d
在根癌农杆菌中与天然Ti质粒或非致瘤质粒发生共整合作用 e感染植物受伤组织或与植物细胞共培养（转移）f T-DNA进入植物细胞并整合到染色体DNA中g 外源基因表达
Ti质粒作为基因工程载体的缺点：a分子量过大，160~240kb b分布的限制性内切酶多个切点cT-DNA区内含有许多编码基因，其中onc基因产物干扰植物内源激素的平衡，阻碍细胞分化和植株再生d不能在大肠杆菌中复制e存在一些对T-DNA转移不起作用的基因
.pUC118和pUC119噬菌粒载体