摘要:原虫体积微小,基本结构包括表膜、胞质及胞核。原虫的运动细胞器有伪足、鞭毛及纤毛三种,运动方式有伪足运动、鞭毛运动和纤毛运动。胞核多为泡状核,少数为实质核,原虫的营养期大多只含一个核,少数可有两个或更多。经染色后胞核的形态特征是鉴别医学原虫的重要依据。寄生原虫的生殖方式分无性生殖(二分裂,多分裂和出芽生殖)和有性生殖(接合生殖和配子生殖)。原虫病呈世界性分布,以热带和亚热带地区尤为多见。一般根据虫体寄生的部位, 将原虫病分为: 肠道原虫感染;肝脏及胆道原虫感染;血液及淋巴系统原虫感染;神经系统原虫病染;皮肤和肌肉原虫感染;肺部原虫感染;眼部原虫感染;泌尿生殖系原虫感染。主要包括以下四点:①虫体大量增殖,破坏寄主细胞和组织,并影响其功能。如果不及时治疗,不终止原虫的繁殖,最终将导致寄主病情的恶化,以至死亡;原虫的代谢产物和崩溃的虫体所产生的毒性、溶解和致敏作用;③感染原虫后寄主会产生一定的免疫力,虫体通过抗原的变异或其他途径而设法逃避这种免疫力的作用,从而使寄主与虫体保持暂时的平衡。当寄主全身或局部抵抗力下降时,则可使隐性感染转变为临床发作。此外,在寄主对原虫产生体液和细胞免疫反应的同时,也可出现变态反应,引起自身免疫性病理损害;④原虫的致病作用常与同时存在的病原微生物有协同作用。
原虫的主要检查方法
一、活滋养体检查:
涂片应较薄,方法同查蠕虫卵。气温愈接近体温,滋养体的活动愈明显。必要时可用保温台保持温度。
二、包囊的碘液染色检查:
直接涂片方法同上,以一滴碘液代替生理盐水,粪便涂抹方法同上。若同时需检查活滋养体,可在玻片另一侧滴一滴生理盐水。同上法涂抹粪便标本,再盖上盖片。片中滴碘液的一侧查包囊;另一侧查活滋养体。
碘液配方:碘化钾4g ,碘2g ,蒸馏水100ml 。
三、隐孢子虫卵囊染色检查:
目前最佳的方法为金安-酚改良抗酸染色法。其次为金胺酚染色法和改良抗酸染色法。对于新鲜粪便或经10%福尔马林固定保存(4℃1个月内)的含卵囊粪便都可用这三种方法染色。染色过程是先用金胺-酚染色,再用改良抗酸染色法复染。方法步骤如下:
金胺-酚(auramine-phenol )染色法:
1)染液配制:1g/l金胺—酚染色液(第一液):金胺0.1g ,石炭酸5.0g ,蒸馏水100ml ;3%盐酸酒精(第二液):盐酸3ml ,95%酒精100ml ;5g/l高锰酸钾液(第三液):高锰酸钾0.5g ,蒸馏水100ml 。
2)染色步骤:滴加第一液于晾干的粪膜上,10~15分钟后水洗;滴加第二液,1分钟后水洗;滴加第三液,1分钟后水洗,待干;置荧光显微镜检查。低倍荧光镜下,可见卵囊为一圆形小亮点,发出乳白色荧光。高倍镜下卵囊呈乳白或略带绿色,卵囊壁为一薄层,多数卵囊周围深染,中央淡染,呈环状,核深染结构偏位,有些卵囊全部为深染。但有些标本可出现非特异的荧光颗粒,应注意鉴别。
改良抗酸(modified acid-fast method)染色法:
1)染色液配制:石炭酸复红染色液(第一液):碱性复红4g ,95%,酒精20ml ,石炭酸8ml ,蒸馏水100ml ;10%硫酸溶液(第二液):纯硫酸10ml ,蒸馏水90ml (边搅拌边将硫酸徐徐倾入水中);20g/l孔雀绿液(第三液):20g/l孔雀绿原液1ml ,蒸馏水10ml 。
2)染色步骤:滴加第一液于晾干的粪膜上,1.5~10分钟后水洗;滴加第二液,1~10 分钟
后水洗;滴加第三液,1分钟后水洗,待干;置显微镜下观察。经染色后,卵囊呈玫瑰红色,圆形或椭圆形,背景为绿色。如染色(1.5分钟)和脱色(2分钟)时间短,卵囊内子孢子边界不明显;如染色时间长(5~10分钟)脱色时间需相应延长,子孢子边界明显。卵囊内子孢子均染为玫瑰红色,子孢子呈月牙形,共4个。其他非特异颗粒则染成蓝黑色,容易与卵囊区分。
不具备荧光镜的实验室,亦可用本方法先染色,然后在光镜低、高倍下过筛检查。如发现小红点再用油镜观察的效果好,可提高检出速度和准确性。
金胺-酚染色-改良抗酸复染法
用本法可克服上述染色法的缺点。具体方法是:先用金胺酚染色后,再用改良抗酸染色法复染。再用光学显微镜观察,卵囊同抗酸染色法所见,但非特异性颗粒被染成兰黑色,两者颜色截然不同,极易鉴别,使检出率和准确性大大提高。
四、汞碘醛离心沉淀法:
本法既可浓集,又可固定和染色,适用于原虫包囊:取粪便1g ,加适量(约10ml )汞碘醛液,充分调匀,用2层脱脂纱布过滤,再加入乙醚4ml ,摇2分钟,离心(2000rpm/min)1~2分钟,即分成乙醚、粪渣、汞碘醛及沉淀物4层。吸弃上面3层,取沉渣镜检。 汞碘醛配制:
1)汞醛(MF )液:1/1000硫柳汞酊200ml ,甲醛(40%)25ml ,甘油50ml ,蒸 馏水200ml 。
2)卢戈氏液:碘5g ,碘化钾10g ,蒸馏水100ml 。检查时取汞醛液2.35ml 及5%卢戈氏液0.15ml 混合备用。但混合液保存8小时后即变质,不应再用;碘液亦不宜于1周后再用。
五、醛醚沉淀法(formalin-ether sedimentation):
取粪便1~2g 置于小容器内,加水10~20ml 调匀,将粪便混悬液经2层纱布(或100目金属筛网)过滤,离心(200rpm/min)2分钟;倒去上层粪液,保留沉渣,加水10ml 混匀,离心2分钟;倒去上液,加10%甲醛7ml 。5分钟后加乙醚3ml ,塞紧管口并充分摇匀,取下管口塞,离心2分钟;即可见管内自上而下分为4层。取管底沉渣涂片镜检。
本法不仅浓集效果好,而且不损伤包囊和虫卵的形态,易于观察和鉴定。对于含脂肪较多的粪便,本法效果优于硫酸锌漂浮法。
六、硫酸锌离心浮聚法:
此法适用于检查原虫包囊、球虫卵囊、线虫卵和微小膜壳绦虫卵。取粪便约1g ,加10—15倍的水,充分搅碎,按离心沉淀法过滤,反复离心3—4次,至清水为止,最后倒去上清液,在沉渣中加入比重1.18的硫酸锌液(33%的溶液),调匀后再加硫酸锌溶液至距管口约1cm 处,离心1分钟。用金属环钩取表面的粪液置于载玻片上,加碘液一滴(查包囊),镜检。钩取标本时,用金属环轻轻接触液面即可,切勿搅动。离心后应立即取标本镜检,如若放置时间超过1小以上,会因包囊或虫卵变形而影响观察效果。
七、蔗糖离心浮聚法:
此法适用于检查粪便中隐孢子虫的卵囊。取粪便约5g ,加水15-20ml ,以260目尼龙袋或4层纱布过滤。取滤液离心5-10分钟,吸弃上清液,加蔗糖溶液(蔗糖500g ,蒸馏水320ml ,石炭酸6.5ml )再离心,然后如同饱和盐水浮聚法,取其表面膜镜检(高倍或油镜)。卵囊透明无色,囊壁光滑,内含一小暗点和发出蛋黄色的子孢子。隐孢子虫的卵囊在漂浮液中浮力较大,常紧贴于盖片之下,鉴于1小时后卵囊脱水变形不易辨认,故应立即镜检。也可用饱和硫酸锌溶液或饱和盐水替代蔗糖容液。
摘要:原虫体积微小,基本结构包括表膜、胞质及胞核。原虫的运动细胞器有伪足、鞭毛及纤毛三种,运动方式有伪足运动、鞭毛运动和纤毛运动。胞核多为泡状核,少数为实质核,原虫的营养期大多只含一个核,少数可有两个或更多。经染色后胞核的形态特征是鉴别医学原虫的重要依据。寄生原虫的生殖方式分无性生殖(二分裂,多分裂和出芽生殖)和有性生殖(接合生殖和配子生殖)。原虫病呈世界性分布,以热带和亚热带地区尤为多见。一般根据虫体寄生的部位, 将原虫病分为: 肠道原虫感染;肝脏及胆道原虫感染;血液及淋巴系统原虫感染;神经系统原虫病染;皮肤和肌肉原虫感染;肺部原虫感染;眼部原虫感染;泌尿生殖系原虫感染。主要包括以下四点:①虫体大量增殖,破坏寄主细胞和组织,并影响其功能。如果不及时治疗,不终止原虫的繁殖,最终将导致寄主病情的恶化,以至死亡;原虫的代谢产物和崩溃的虫体所产生的毒性、溶解和致敏作用;③感染原虫后寄主会产生一定的免疫力,虫体通过抗原的变异或其他途径而设法逃避这种免疫力的作用,从而使寄主与虫体保持暂时的平衡。当寄主全身或局部抵抗力下降时,则可使隐性感染转变为临床发作。此外,在寄主对原虫产生体液和细胞免疫反应的同时,也可出现变态反应,引起自身免疫性病理损害;④原虫的致病作用常与同时存在的病原微生物有协同作用。
原虫的主要检查方法
一、活滋养体检查:
涂片应较薄,方法同查蠕虫卵。气温愈接近体温,滋养体的活动愈明显。必要时可用保温台保持温度。
二、包囊的碘液染色检查:
直接涂片方法同上,以一滴碘液代替生理盐水,粪便涂抹方法同上。若同时需检查活滋养体,可在玻片另一侧滴一滴生理盐水。同上法涂抹粪便标本,再盖上盖片。片中滴碘液的一侧查包囊;另一侧查活滋养体。
碘液配方:碘化钾4g ,碘2g ,蒸馏水100ml 。
三、隐孢子虫卵囊染色检查:
目前最佳的方法为金安-酚改良抗酸染色法。其次为金胺酚染色法和改良抗酸染色法。对于新鲜粪便或经10%福尔马林固定保存(4℃1个月内)的含卵囊粪便都可用这三种方法染色。染色过程是先用金胺-酚染色,再用改良抗酸染色法复染。方法步骤如下:
金胺-酚(auramine-phenol )染色法:
1)染液配制:1g/l金胺—酚染色液(第一液):金胺0.1g ,石炭酸5.0g ,蒸馏水100ml ;3%盐酸酒精(第二液):盐酸3ml ,95%酒精100ml ;5g/l高锰酸钾液(第三液):高锰酸钾0.5g ,蒸馏水100ml 。
2)染色步骤:滴加第一液于晾干的粪膜上,10~15分钟后水洗;滴加第二液,1分钟后水洗;滴加第三液,1分钟后水洗,待干;置荧光显微镜检查。低倍荧光镜下,可见卵囊为一圆形小亮点,发出乳白色荧光。高倍镜下卵囊呈乳白或略带绿色,卵囊壁为一薄层,多数卵囊周围深染,中央淡染,呈环状,核深染结构偏位,有些卵囊全部为深染。但有些标本可出现非特异的荧光颗粒,应注意鉴别。
改良抗酸(modified acid-fast method)染色法:
1)染色液配制:石炭酸复红染色液(第一液):碱性复红4g ,95%,酒精20ml ,石炭酸8ml ,蒸馏水100ml ;10%硫酸溶液(第二液):纯硫酸10ml ,蒸馏水90ml (边搅拌边将硫酸徐徐倾入水中);20g/l孔雀绿液(第三液):20g/l孔雀绿原液1ml ,蒸馏水10ml 。
2)染色步骤:滴加第一液于晾干的粪膜上,1.5~10分钟后水洗;滴加第二液,1~10 分钟
后水洗;滴加第三液,1分钟后水洗,待干;置显微镜下观察。经染色后,卵囊呈玫瑰红色,圆形或椭圆形,背景为绿色。如染色(1.5分钟)和脱色(2分钟)时间短,卵囊内子孢子边界不明显;如染色时间长(5~10分钟)脱色时间需相应延长,子孢子边界明显。卵囊内子孢子均染为玫瑰红色,子孢子呈月牙形,共4个。其他非特异颗粒则染成蓝黑色,容易与卵囊区分。
不具备荧光镜的实验室,亦可用本方法先染色,然后在光镜低、高倍下过筛检查。如发现小红点再用油镜观察的效果好,可提高检出速度和准确性。
金胺-酚染色-改良抗酸复染法
用本法可克服上述染色法的缺点。具体方法是:先用金胺酚染色后,再用改良抗酸染色法复染。再用光学显微镜观察,卵囊同抗酸染色法所见,但非特异性颗粒被染成兰黑色,两者颜色截然不同,极易鉴别,使检出率和准确性大大提高。
四、汞碘醛离心沉淀法:
本法既可浓集,又可固定和染色,适用于原虫包囊:取粪便1g ,加适量(约10ml )汞碘醛液,充分调匀,用2层脱脂纱布过滤,再加入乙醚4ml ,摇2分钟,离心(2000rpm/min)1~2分钟,即分成乙醚、粪渣、汞碘醛及沉淀物4层。吸弃上面3层,取沉渣镜检。 汞碘醛配制:
1)汞醛(MF )液:1/1000硫柳汞酊200ml ,甲醛(40%)25ml ,甘油50ml ,蒸 馏水200ml 。
2)卢戈氏液:碘5g ,碘化钾10g ,蒸馏水100ml 。检查时取汞醛液2.35ml 及5%卢戈氏液0.15ml 混合备用。但混合液保存8小时后即变质,不应再用;碘液亦不宜于1周后再用。
五、醛醚沉淀法(formalin-ether sedimentation):
取粪便1~2g 置于小容器内,加水10~20ml 调匀,将粪便混悬液经2层纱布(或100目金属筛网)过滤,离心(200rpm/min)2分钟;倒去上层粪液,保留沉渣,加水10ml 混匀,离心2分钟;倒去上液,加10%甲醛7ml 。5分钟后加乙醚3ml ,塞紧管口并充分摇匀,取下管口塞,离心2分钟;即可见管内自上而下分为4层。取管底沉渣涂片镜检。
本法不仅浓集效果好,而且不损伤包囊和虫卵的形态,易于观察和鉴定。对于含脂肪较多的粪便,本法效果优于硫酸锌漂浮法。
六、硫酸锌离心浮聚法:
此法适用于检查原虫包囊、球虫卵囊、线虫卵和微小膜壳绦虫卵。取粪便约1g ,加10—15倍的水,充分搅碎,按离心沉淀法过滤,反复离心3—4次,至清水为止,最后倒去上清液,在沉渣中加入比重1.18的硫酸锌液(33%的溶液),调匀后再加硫酸锌溶液至距管口约1cm 处,离心1分钟。用金属环钩取表面的粪液置于载玻片上,加碘液一滴(查包囊),镜检。钩取标本时,用金属环轻轻接触液面即可,切勿搅动。离心后应立即取标本镜检,如若放置时间超过1小以上,会因包囊或虫卵变形而影响观察效果。
七、蔗糖离心浮聚法:
此法适用于检查粪便中隐孢子虫的卵囊。取粪便约5g ,加水15-20ml ,以260目尼龙袋或4层纱布过滤。取滤液离心5-10分钟,吸弃上清液,加蔗糖溶液(蔗糖500g ,蒸馏水320ml ,石炭酸6.5ml )再离心,然后如同饱和盐水浮聚法,取其表面膜镜检(高倍或油镜)。卵囊透明无色,囊壁光滑,内含一小暗点和发出蛋黄色的子孢子。隐孢子虫的卵囊在漂浮液中浮力较大,常紧贴于盖片之下,鉴于1小时后卵囊脱水变形不易辨认,故应立即镜检。也可用饱和硫酸锌溶液或饱和盐水替代蔗糖容液。