534
doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2009.04.023
LETTERSINBIOTECHNOLOGY
生物技术通讯
Vol.20No.4July,2009
研究报告
温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵过程的影响
赵春光,谢希贤,程立坤,徐庆阳,陈宁
天津科技大学生物工程学院,天津300457[摘要]
目的:研究变温控制对大肠杆菌TRTHL-色氨酸补料分批发酵过程中生物量、色氨酸产量、比生长速率及质粒稳
定性的影响。方法:利用5L自控发酵罐对L-色氨酸补料分批发酵过程进行温度控制,对不同温度下相关参数进行分析比较,确定优化的温度控制方案。结果:以30~36℃顺序升温的工艺进行发酵得到理想结果,与单一温度控制策略相比,L-色氨酸产量提高了15.4%;色氨酸的比合成速率提高了21.6%;质粒稳定性增加,未出现质粒丢失现象,质粒拷贝数保持在恒定水平。结论:温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵有重要影响。[关键词]
L-色氨酸;变温控制;质粒稳定性;发酵;大肠杆菌
TQ922
[文献标识码]
[中图分类号]A[文章编号]1009-0002(2009)04-0534-04
EffectofTemperatureontheProcessofEscherichiacoliL-TryptophanFermentation
ZHAOChun-Guang,XIEXi-Xian,CHENGLi-Kun,XUQing-Yang,CHENNing
CollageofBioengineering,TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300457,China
[Abstract]
Objective:Tostudytheeffectofvariabletemperatureonbiomass,L-tryptophanyield,thegrowthrateand
toanalyses
thestabilityoftheplasmidintheprocessofEscherichiacoliTRTHL-tryptophanfed-batchfermentation.Methods:5L-controlledfermentatorwasusedintemperaturecontrolintheprocessofL-tryptophanfed-batchfermentation,differenttemperature-relatedparametersanddeterminetheoptimaltemperaturecontrolstrategy.
Results:
Undertheopti-
mizedfermentationconditionsof30~36℃variabletemperaturecontrolstrategy,afinalL-tryptophanconcentrationof30.19g/Lwasobtainedafter45hin5literfermentor,increasedby15.4%;tryptophansynthesisrateincreased21.6%;nolossofplasmidwasobserved,plasmidcopynumberremainedataconstantlevel.Conclusion:ThetemperatureisanimportantimpactontheL-tryptophanproduction.
[Keywords]
L-tryptophan;temperaturecontrol;plasmidstability;fermentation;Escherichiacoli
L-色氨酸(L-tryptophan)的化学名称为α-氨基-β-吲哚基
丙酸,是人体和动物生命活动中8种必需氨基酸之一,对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用,被称为第二必需氨基酸,广泛应用于医药、食品和饲料等方面[1]。目前利用微生物生产色氨酸的方法主要有酶法、微生物转化法和微生物发酵法[2]。酶法和微生物转化法产酸水平低、成本高、质量难以控制,而微生物发酵法将是大规模生产L-色氨酸的首选技术。微生物发酵法以通过代谢工程手段构建的重组菌为生产菌种,采用高密度培养技术,为色氨酸产品开发开辟了新的生产途径。重组菌产物的高表达,不仅涉及宿主、载体和克隆基因之间的相互关系,而且与其所处的环境条件息息相关。尤其是温度,不仅可以影响细胞代谢过程中各种关键酶的活性,而且会影响产物表达和乙酸等副产物的生成[3]。同时,在基因工程菌高密度培养过程中,温度的变化还与质粒拷贝数的变化息息相关。因此,在发酵过程中须采用一定的温度控制策略。
我们利用5L自控发酵罐对L-色氨酸补料分批发酵过程进行温度控制,考察了不同温度条件下大肠杆菌TRTH生产色氨酸的发酵动力学特性,探讨了变温控制模式对菌体生长、耗糖强度、产酸及大肠杆菌质粒稳定性的影响,最终确定了有效的变温控制工艺。
[4]
1
1.1
材料与方法
材料
大肠杆菌TRTH/pSV-709(trpEDCBA+tetR),由天津科技大
学工业微生物菌种保藏室提供。
种子培养基:葡萄糖40g/L,酵母浸出粉15g/L,(NH4)2SO4
10g/L,柠檬酸三钠0.5g/L,MgSO4·7H2O5g/L,KH2PO41.5
·g/L,FeSO47H2O15mg,维生素B1100mg,四环素25mg。
发酵培养基:葡萄糖70g/L,酵母浸出粉1g/L,柠檬酸三钠2g/L,MgSO4·7H2O5g/L,KH2PO42g/L,FeSO4·7H2O100
mg。1.21.2.1
培养方法种子培养
吸取适量无菌生理盐水于5支活化斜面菌种
中,将所有菌悬液全部接入5L种子罐中,搅拌转速300~700r/
min,通过自动流加氨水控制pH7.0,培养温度32℃。
[收稿日期]2009-01-09
[基金项目]“十一五”国家科技支撑计划(2008BAI63B01);
国家科技重大专项(2008ZX09401-05)
[作者简介]赵春光(1983-),男,硕士研究生[通信作者]陈宁,(E-mail)ningch@tust.edu.cn
赵春光等:温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵过程的影响
535
大肠杆菌染色体DNA的浓度。
1.2.2发酵培养按10%的接种量将种子液接入5L发酵罐中,
初始通风量2L/min,搅拌转速500~800r/min,通过自动流加氨水控制pH7.0,培养温度32℃,以泡敌消泡,发酵到一定时间将
1.4动力学参数计算[9]
分别根据以下公式计算不同温度下菌体比生长速率(μcell)和
800g/L葡萄糖溶液连续流加入培养基中,保持发酵罐中葡萄糖
的浓度值不超过15g/L。
色氨酸比生成速率(μTrp),用Origin绘图软件对实验数据进行插值计算(时间间隔为0.1h),再用Excel软件求解不同时刻的
1.31.3.11.3.21.3.31.3.41.3.5
分析方法菌体干重
取10mL发酵液,100000r/min离心20采用蒽酮硫酸法[6]。
采用SBA-40C(山东科学院生物研究
μcell和μTrp。式中x为菌体量(g/L),t为时间(h),p为色氨酸产量
(g/L)。
min,洗涤后将菌体于105℃烘干至恒重,分析天平称重。
蔗糖浓度测定葡萄糖浓度测定
μcell=dx1;
μTrp=dp1
所)生物传感仪测定。
2
采用高效液相分析
结果与讨论
不同温度下L-色氨酸的分批发酵曲线
微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的,
L-色氨酸及副产物氨基酸含量测定
质粒稳定性
系统测定[7]。
在发酵过程中每隔一段时间取菌液进行适
当稀释,取100μL均匀涂布于不含四环素的LB琼脂平板上,
2.1
温度是保证酶活性的重要条件。从酶动力学来看,温度升高,反应速度加快,生产期提前。但温度升高后酶的失活也加快,菌体易于衰老而影响产物的生成[7]。图1A和B为不同温度下大肠杆菌TRTH发酵生产L-色氨酸时的细胞生长和糖消耗速度的变化曲线。可以看出,在一定温度范围内菌体生物量与糖消耗速率成正比,菌体生长的延迟期随着发酵温度升高而逐渐缩短,且在
36℃培养20h后,从平板上挑取1000个单菌落转接到含50mg/L四环素的LB平板上,36℃培养20h后计数菌落数,计算
与总菌落数的比例。
1.3.6质粒拷贝数[4,8]参见文献[4],按下式计算:
N=Me×Cp
pe
式中,N为质粒拷贝数,Me为大肠杆菌染色体的大小(4.7×
36℃时获得了最高的菌体量,说明适当提高温度有利于菌体生
长。但高温(36℃)也使菌体提前(35h)进入衰亡期。图1C和D为不同温度下大肠杆菌TRTH发酵生产L-色氨酸的产量和质粒
10kb),Mp为质粒大小(16.8kb);Cp为质粒DNA的浓度;Ce为
3
图1不同温度下大肠杆菌TRTH发酵生产L-
色氨酸的过程曲线
536
稳定性变化曲线。结合图1A分析,在发酵前期,色氨酸的浓度随着细胞的生长而逐渐提高,但进入生长稳定期后,影响色氨酸合成的因素除了细胞生物量外还有质粒的稳定性。当温度为33℃时,产酸水平达到最大值(27.35g/L),过低或过高的温度均不利于色氨酸的合成;36℃时虽然获得最高的菌体量,但产酸却不是最高的,质粒丢失比较严重,说明温度升高使生产菌比生长速率过大,从而增加了质粒分配的不稳定性。28℃时质粒基本不丢失,但过低的温度使菌体生长缓慢,产酸下降。因此,需要选择一个适当的温度,使菌体在保证质粒稳定性的基础上达到较快的生长速率。
LETTERSINBIOTECHNOLOGY
生物技术通讯
Vol.20No.4July,2009
大值(1.66/h),然后迅速降低;而在33℃时可获得最大的L-色氨酸的比合成速率(0.88/h)。
结合图3和图1D分析,在低温(28、33℃)条件下,细胞的比生长速率维持在较低的水平,质粒基本不会丢失,而且质粒拷贝数维持在一个恒定的水平,但μ值太低也会延长发酵期,影响单位时间/体积产率的提高。而在较高温度(33、36℃)培养时,细胞比生长速率高,产酸速率也相对较高,但到后期质粒的复制速率跟不上细胞分裂的速率,从而导致质粒拷贝数降低,最终质粒丢失,影响到细胞的产率。可见细胞生长、质粒的稳定和色氨酸合成需要不同的最适温度,在分批发酵过程中始终维持单一的温度是不够的。
2.2温度对细胞比生长速率、比产酸速率及质粒拷贝数的影响钟根深等[8]认为,发酵过程中比生长速率μ是一个重要的参
2.3色氨酸分批发酵过程分阶段温度控制策略的确定及验证根据Gaden代谢产物的生成动力学模型[10]可知,氨基酸的生
数,它能影响质粒的拷贝数,与重组蛋白的表达量、乙酸等生长抑制性副产物的形成也有很大关系。发酵温度升高,酶反应速率提高,生长代谢加快,从而提高菌体的生物量,但单纯的生物量(细胞干重)并不能代表有用的生物表达量,生长速率严重影响菌体的物质组成。Seo和Bailey发现,生长速率提高,质粒的拷贝数下降,认为在高比生长速率下,质粒的复制速率跟不上细胞分裂的速率[9]。
比较图2A和B可知,在发酵过程中温度对细菌比生长速率和L-色氨酸比合成速率的影响有显著差异。随着发酵温度的提高,细胞比生长速率达到最大值的时间逐渐缩短。当发酵温度为
产属于部分相关模型,即产物的形成与菌体生长部分相关,在细胞生长期内基本无产物生成。结合以上结果,在色氨酸发酵前期,应该优先考虑菌体的生长和质粒的稳定性,宜采用相对较低的培养温度(如30℃),控制细胞比生长速率处于较低状态,使菌体在保证质粒稳定性及质粒拷贝数恒定增加的基础上达到较快的生长速率;在发酵中后期菌体生长处于稳定期时,应该提高发酵温度,这样可以使色氨酸比合成速率保持相对较高值,从而提高色氨酸的最终产量。
基于以上分析,我们提出色氨酸发酵过程中的温度控制策略:0~16h发酵温度为30℃,16h后缓慢升温至36℃,升温方式
36℃时,细胞在发酵前期表现出较高的比生长速率,7h达到最
图2不同温度下细菌比生长速率及L-色氨酸比合成速率随时间的变化曲线
图3不同温度下质粒拷贝数随时间的变化曲线图4
采用分阶段控制温度的发酵过程曲线
赵春光等:温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵过程的影响
为每小时提高0.5℃,利用发酵罐的温度顺控模式进行自动控制(表1)。
表1色氨酸发酵过程中的温度顺序控制表
时间(h)
温度(℃)
时间(h)
温度(℃)
时间(h)温度(℃)
537
参考文献
[1][2][3][4]
赵春光,程立坤,徐庆阳,等.微生物法生产L-色氨酸的研究进展
[J].发酵科技通讯,2008,37(4):34-36.
陈宁.氨基酸工艺学[M].北京:中国轻工业出版社,2007:366.邹祥,廖志华.温度对重组大肠杆菌产番茄红素的影响及控制策略
[1**********]30.53131.[**************].53333.53434.5
[1**********]5.53636
[J].微生物学通报,2005,32(5):19-23.
丁满生,马文峰,郭美锦,等.温度诱导模式对重组大肠杆菌质粒拷贝数的影响[J].华东理工大学学报(自然科学版),2006,32(1):33-
采用这一温度控制策略在5L发酵罐上进行验证,发酵过程曲线如图4所示。结果表明:①采用分阶段温度控制策略可使色氨酸产量达到最大值(30.19g/L),比恒定温度(33℃)下最高产量(26.15g/L)提高了15.4%;②色氨酸的比合成速率(1.07/h)比恒定温度(33℃)下最高比合成速率(0.88/h)提高了21.6%;③质粒稳定性增加,未出现质粒丢失现象,质粒拷贝数保持在恒定水平。
37.[5]
HeinriksonRL,MeredithSC.Aminoacidanalysisbyreverse-phasehigh-performanceliquidchromatography:precolumnderivati-zationwithphenylisothiocynate[J].AnalBiochem,1984,136(1):65-74.[6][7][8][9]
刘慧娟,华兆哲,堵国成,等.芽孢杆菌发酵生产碱性果胶酶的温度控制策略[J].过程工程学报,2007,4:786-789.
童群义,陈坚.分批培养时pH和温度对重组大肠杆菌生产谷胱甘肽合成酶系的影响[J].工业微生物,2001,31(4):17-21.
钟根深,石炳兴,吴祖泽.重组大肠杆菌高密度培养[J].中国生物工程杂志(增),2005:27-31.
3结论
我们采用5L自控发酵罐进行补料分批发酵,研究了不同的
SeoJH,BaileyJE.ContinuouscultivationofrecombinantEs-BiotechnolBioeng,
温度控制策略对大肠杆菌L-色氨酸发酵过程的影响,结果表明采用分阶段温度控制策略使色氨酸产量提高了15.4%,色氨酸的比合成速率提高了21.6%;质粒稳定性增加,未出现质粒丢失现象,质粒拷贝数保持在恒定水平,获得了较好的结果。
cherichiacoli:Existenceofanoptimumdilutionrateformaximumplasmidandgeneproductconcentration[J].1985,28:1590-1594.
[10]贾士儒.生物反应工程原理(2版)[M].北京:科学出版社,2003:
67-68.
534
doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2009.04.023
LETTERSINBIOTECHNOLOGY
生物技术通讯
Vol.20No.4July,2009
研究报告
温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵过程的影响
赵春光,谢希贤,程立坤,徐庆阳,陈宁
天津科技大学生物工程学院,天津300457[摘要]
目的:研究变温控制对大肠杆菌TRTHL-色氨酸补料分批发酵过程中生物量、色氨酸产量、比生长速率及质粒稳
定性的影响。方法:利用5L自控发酵罐对L-色氨酸补料分批发酵过程进行温度控制,对不同温度下相关参数进行分析比较,确定优化的温度控制方案。结果:以30~36℃顺序升温的工艺进行发酵得到理想结果,与单一温度控制策略相比,L-色氨酸产量提高了15.4%;色氨酸的比合成速率提高了21.6%;质粒稳定性增加,未出现质粒丢失现象,质粒拷贝数保持在恒定水平。结论:温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵有重要影响。[关键词]
L-色氨酸;变温控制;质粒稳定性;发酵;大肠杆菌
TQ922
[文献标识码]
[中图分类号]A[文章编号]1009-0002(2009)04-0534-04
EffectofTemperatureontheProcessofEscherichiacoliL-TryptophanFermentation
ZHAOChun-Guang,XIEXi-Xian,CHENGLi-Kun,XUQing-Yang,CHENNing
CollageofBioengineering,TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300457,China
[Abstract]
Objective:Tostudytheeffectofvariabletemperatureonbiomass,L-tryptophanyield,thegrowthrateand
toanalyses
thestabilityoftheplasmidintheprocessofEscherichiacoliTRTHL-tryptophanfed-batchfermentation.Methods:5L-controlledfermentatorwasusedintemperaturecontrolintheprocessofL-tryptophanfed-batchfermentation,differenttemperature-relatedparametersanddeterminetheoptimaltemperaturecontrolstrategy.
Results:
Undertheopti-
mizedfermentationconditionsof30~36℃variabletemperaturecontrolstrategy,afinalL-tryptophanconcentrationof30.19g/Lwasobtainedafter45hin5literfermentor,increasedby15.4%;tryptophansynthesisrateincreased21.6%;nolossofplasmidwasobserved,plasmidcopynumberremainedataconstantlevel.Conclusion:ThetemperatureisanimportantimpactontheL-tryptophanproduction.
[Keywords]
L-tryptophan;temperaturecontrol;plasmidstability;fermentation;Escherichiacoli
L-色氨酸(L-tryptophan)的化学名称为α-氨基-β-吲哚基
丙酸,是人体和动物生命活动中8种必需氨基酸之一,对人和动物的生长发育、新陈代谢起着重要的作用,被称为第二必需氨基酸,广泛应用于医药、食品和饲料等方面[1]。目前利用微生物生产色氨酸的方法主要有酶法、微生物转化法和微生物发酵法[2]。酶法和微生物转化法产酸水平低、成本高、质量难以控制,而微生物发酵法将是大规模生产L-色氨酸的首选技术。微生物发酵法以通过代谢工程手段构建的重组菌为生产菌种,采用高密度培养技术,为色氨酸产品开发开辟了新的生产途径。重组菌产物的高表达,不仅涉及宿主、载体和克隆基因之间的相互关系,而且与其所处的环境条件息息相关。尤其是温度,不仅可以影响细胞代谢过程中各种关键酶的活性,而且会影响产物表达和乙酸等副产物的生成[3]。同时,在基因工程菌高密度培养过程中,温度的变化还与质粒拷贝数的变化息息相关。因此,在发酵过程中须采用一定的温度控制策略。
我们利用5L自控发酵罐对L-色氨酸补料分批发酵过程进行温度控制,考察了不同温度条件下大肠杆菌TRTH生产色氨酸的发酵动力学特性,探讨了变温控制模式对菌体生长、耗糖强度、产酸及大肠杆菌质粒稳定性的影响,最终确定了有效的变温控制工艺。
[4]
1
1.1
材料与方法
材料
大肠杆菌TRTH/pSV-709(trpEDCBA+tetR),由天津科技大
学工业微生物菌种保藏室提供。
种子培养基:葡萄糖40g/L,酵母浸出粉15g/L,(NH4)2SO4
10g/L,柠檬酸三钠0.5g/L,MgSO4·7H2O5g/L,KH2PO41.5
·g/L,FeSO47H2O15mg,维生素B1100mg,四环素25mg。
发酵培养基:葡萄糖70g/L,酵母浸出粉1g/L,柠檬酸三钠2g/L,MgSO4·7H2O5g/L,KH2PO42g/L,FeSO4·7H2O100
mg。1.21.2.1
培养方法种子培养
吸取适量无菌生理盐水于5支活化斜面菌种
中,将所有菌悬液全部接入5L种子罐中,搅拌转速300~700r/
min,通过自动流加氨水控制pH7.0,培养温度32℃。
[收稿日期]2009-01-09
[基金项目]“十一五”国家科技支撑计划(2008BAI63B01);
国家科技重大专项(2008ZX09401-05)
[作者简介]赵春光(1983-),男,硕士研究生[通信作者]陈宁,(E-mail)ningch@tust.edu.cn
赵春光等:温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵过程的影响
535
大肠杆菌染色体DNA的浓度。
1.2.2发酵培养按10%的接种量将种子液接入5L发酵罐中,
初始通风量2L/min,搅拌转速500~800r/min,通过自动流加氨水控制pH7.0,培养温度32℃,以泡敌消泡,发酵到一定时间将
1.4动力学参数计算[9]
分别根据以下公式计算不同温度下菌体比生长速率(μcell)和
800g/L葡萄糖溶液连续流加入培养基中,保持发酵罐中葡萄糖
的浓度值不超过15g/L。
色氨酸比生成速率(μTrp),用Origin绘图软件对实验数据进行插值计算(时间间隔为0.1h),再用Excel软件求解不同时刻的
1.31.3.11.3.21.3.31.3.41.3.5
分析方法菌体干重
取10mL发酵液,100000r/min离心20采用蒽酮硫酸法[6]。
采用SBA-40C(山东科学院生物研究
μcell和μTrp。式中x为菌体量(g/L),t为时间(h),p为色氨酸产量
(g/L)。
min,洗涤后将菌体于105℃烘干至恒重,分析天平称重。
蔗糖浓度测定葡萄糖浓度测定
μcell=dx1;
μTrp=dp1
所)生物传感仪测定。
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采用高效液相分析
结果与讨论
不同温度下L-色氨酸的分批发酵曲线
微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的,
L-色氨酸及副产物氨基酸含量测定
质粒稳定性
系统测定[7]。
在发酵过程中每隔一段时间取菌液进行适
当稀释,取100μL均匀涂布于不含四环素的LB琼脂平板上,
2.1
温度是保证酶活性的重要条件。从酶动力学来看,温度升高,反应速度加快,生产期提前。但温度升高后酶的失活也加快,菌体易于衰老而影响产物的生成[7]。图1A和B为不同温度下大肠杆菌TRTH发酵生产L-色氨酸时的细胞生长和糖消耗速度的变化曲线。可以看出,在一定温度范围内菌体生物量与糖消耗速率成正比,菌体生长的延迟期随着发酵温度升高而逐渐缩短,且在
36℃培养20h后,从平板上挑取1000个单菌落转接到含50mg/L四环素的LB平板上,36℃培养20h后计数菌落数,计算
与总菌落数的比例。
1.3.6质粒拷贝数[4,8]参见文献[4],按下式计算:
N=Me×Cp
pe
式中,N为质粒拷贝数,Me为大肠杆菌染色体的大小(4.7×
36℃时获得了最高的菌体量,说明适当提高温度有利于菌体生
长。但高温(36℃)也使菌体提前(35h)进入衰亡期。图1C和D为不同温度下大肠杆菌TRTH发酵生产L-色氨酸的产量和质粒
10kb),Mp为质粒大小(16.8kb);Cp为质粒DNA的浓度;Ce为
3
图1不同温度下大肠杆菌TRTH发酵生产L-
色氨酸的过程曲线
536
稳定性变化曲线。结合图1A分析,在发酵前期,色氨酸的浓度随着细胞的生长而逐渐提高,但进入生长稳定期后,影响色氨酸合成的因素除了细胞生物量外还有质粒的稳定性。当温度为33℃时,产酸水平达到最大值(27.35g/L),过低或过高的温度均不利于色氨酸的合成;36℃时虽然获得最高的菌体量,但产酸却不是最高的,质粒丢失比较严重,说明温度升高使生产菌比生长速率过大,从而增加了质粒分配的不稳定性。28℃时质粒基本不丢失,但过低的温度使菌体生长缓慢,产酸下降。因此,需要选择一个适当的温度,使菌体在保证质粒稳定性的基础上达到较快的生长速率。
LETTERSINBIOTECHNOLOGY
生物技术通讯
Vol.20No.4July,2009
大值(1.66/h),然后迅速降低;而在33℃时可获得最大的L-色氨酸的比合成速率(0.88/h)。
结合图3和图1D分析,在低温(28、33℃)条件下,细胞的比生长速率维持在较低的水平,质粒基本不会丢失,而且质粒拷贝数维持在一个恒定的水平,但μ值太低也会延长发酵期,影响单位时间/体积产率的提高。而在较高温度(33、36℃)培养时,细胞比生长速率高,产酸速率也相对较高,但到后期质粒的复制速率跟不上细胞分裂的速率,从而导致质粒拷贝数降低,最终质粒丢失,影响到细胞的产率。可见细胞生长、质粒的稳定和色氨酸合成需要不同的最适温度,在分批发酵过程中始终维持单一的温度是不够的。
2.2温度对细胞比生长速率、比产酸速率及质粒拷贝数的影响钟根深等[8]认为,发酵过程中比生长速率μ是一个重要的参
2.3色氨酸分批发酵过程分阶段温度控制策略的确定及验证根据Gaden代谢产物的生成动力学模型[10]可知,氨基酸的生
数,它能影响质粒的拷贝数,与重组蛋白的表达量、乙酸等生长抑制性副产物的形成也有很大关系。发酵温度升高,酶反应速率提高,生长代谢加快,从而提高菌体的生物量,但单纯的生物量(细胞干重)并不能代表有用的生物表达量,生长速率严重影响菌体的物质组成。Seo和Bailey发现,生长速率提高,质粒的拷贝数下降,认为在高比生长速率下,质粒的复制速率跟不上细胞分裂的速率[9]。
比较图2A和B可知,在发酵过程中温度对细菌比生长速率和L-色氨酸比合成速率的影响有显著差异。随着发酵温度的提高,细胞比生长速率达到最大值的时间逐渐缩短。当发酵温度为
产属于部分相关模型,即产物的形成与菌体生长部分相关,在细胞生长期内基本无产物生成。结合以上结果,在色氨酸发酵前期,应该优先考虑菌体的生长和质粒的稳定性,宜采用相对较低的培养温度(如30℃),控制细胞比生长速率处于较低状态,使菌体在保证质粒稳定性及质粒拷贝数恒定增加的基础上达到较快的生长速率;在发酵中后期菌体生长处于稳定期时,应该提高发酵温度,这样可以使色氨酸比合成速率保持相对较高值,从而提高色氨酸的最终产量。
基于以上分析,我们提出色氨酸发酵过程中的温度控制策略:0~16h发酵温度为30℃,16h后缓慢升温至36℃,升温方式
36℃时,细胞在发酵前期表现出较高的比生长速率,7h达到最
图2不同温度下细菌比生长速率及L-色氨酸比合成速率随时间的变化曲线
图3不同温度下质粒拷贝数随时间的变化曲线图4
采用分阶段控制温度的发酵过程曲线
赵春光等:温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵过程的影响
为每小时提高0.5℃,利用发酵罐的温度顺控模式进行自动控制(表1)。
表1色氨酸发酵过程中的温度顺序控制表
时间(h)
温度(℃)
时间(h)
温度(℃)
时间(h)温度(℃)
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参考文献
[1][2][3][4]
赵春光,程立坤,徐庆阳,等.微生物法生产L-色氨酸的研究进展
[J].发酵科技通讯,2008,37(4):34-36.
陈宁.氨基酸工艺学[M].北京:中国轻工业出版社,2007:366.邹祥,廖志华.温度对重组大肠杆菌产番茄红素的影响及控制策略
[1**********]30.53131.[**************].53333.53434.5
[1**********]5.53636
[J].微生物学通报,2005,32(5):19-23.
丁满生,马文峰,郭美锦,等.温度诱导模式对重组大肠杆菌质粒拷贝数的影响[J].华东理工大学学报(自然科学版),2006,32(1):33-
采用这一温度控制策略在5L发酵罐上进行验证,发酵过程曲线如图4所示。结果表明:①采用分阶段温度控制策略可使色氨酸产量达到最大值(30.19g/L),比恒定温度(33℃)下最高产量(26.15g/L)提高了15.4%;②色氨酸的比合成速率(1.07/h)比恒定温度(33℃)下最高比合成速率(0.88/h)提高了21.6%;③质粒稳定性增加,未出现质粒丢失现象,质粒拷贝数保持在恒定水平。
37.[5]
HeinriksonRL,MeredithSC.Aminoacidanalysisbyreverse-phasehigh-performanceliquidchromatography:precolumnderivati-zationwithphenylisothiocynate[J].AnalBiochem,1984,136(1):65-74.[6][7][8][9]
刘慧娟,华兆哲,堵国成,等.芽孢杆菌发酵生产碱性果胶酶的温度控制策略[J].过程工程学报,2007,4:786-789.
童群义,陈坚.分批培养时pH和温度对重组大肠杆菌生产谷胱甘肽合成酶系的影响[J].工业微生物,2001,31(4):17-21.
钟根深,石炳兴,吴祖泽.重组大肠杆菌高密度培养[J].中国生物工程杂志(增),2005:27-31.
3结论
我们采用5L自控发酵罐进行补料分批发酵,研究了不同的
SeoJH,BaileyJE.ContinuouscultivationofrecombinantEs-BiotechnolBioeng,
温度控制策略对大肠杆菌L-色氨酸发酵过程的影响,结果表明采用分阶段温度控制策略使色氨酸产量提高了15.4%,色氨酸的比合成速率提高了21.6%;质粒稳定性增加,未出现质粒丢失现象,质粒拷贝数保持在恒定水平,获得了较好的结果。
cherichiacoli:Existenceofanoptimumdilutionrateformaximumplasmidandgeneproductconcentration[J].1985,28:1590-1594.
[10]贾士儒.生物反应工程原理(2版)[M].北京:科学出版社,2003:
67-68.