细胞免疫荧光实验步骤

细胞免疫荧光实验步骤

细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白 H7.2-7.4 37 度 PBS 2 小时. 2.-20 度甲醇固定 20 分钟后,自然、干燥 10 分钟 3.PBS 洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成 50ultriton+5mlpBS 5.PBS 洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度 ８.４度 ９.二抗 PBS 洗净，３min＊５次 ３７度小于一小时 PBS 洗净，３＊５min １－２小时

１０.３７度

凉干封片（封闭液ＰＨ８.５）

活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用 10％FCS RPMI1640 调整细胞浓度为

5×10６～１×10７／ml ↓ 取 40μ l 细胞悬液加入预先有特异性 McAb(5～50μ l) 的小玻璃管或塑料离心管，再加 50μ l 1∶20(用 DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤 2 次，每次加洗涤液 2ml 左右 1000rpm×5min

↓ 弃上清，加入 50μ l 工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓ 4℃ 30min

用洗涤液洗涤 2 次，每次加液 2ml 左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为 FCM 制备标本，一般加入 1ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入 100～500μ l 固定液) ↓ FCM 检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存 5～7 天)

（二）试剂和器材 1. 2. 3. 4. 各种特异性单克隆抗体。 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

（三）注意事项 1. 整个操作在 4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高 10 倍的 NaN

３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白 Fc 受体，降低和防 洗涤要充分， 以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假

止非特异性染色。 4. 附: 1. DPBS (×10, 贮存液) 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

NaCl 80g KCl 2g 蒸馏水加至 1000ml

Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水 1∶10 稀释 KH２PO４ 2g 2. 洗涤液 DPBS FCS 50ml (终浓度 900ml 5％)

4％NaN３???50ml (终浓度 0.2％) 3. 固定液 DPBS 葡萄糖 甲 醛 1000ml 20g (终浓度 2％) 10ml 0.2g (终浓度 0.02％)

NaN３ 4.

玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

（三）注意事项 1. 整个操作在 4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高 10 倍的 NaN

３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白 Fc

受体，降低和防 洗涤要充分， 以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假

止非特异性染色。 4. 附: 1. DPBS (×10, 贮存液) NaCl 80g KCl 2g 蒸馏水加至 1000ml 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水 1∶10 稀释 KH２PO４ 2g 2. 洗涤液

DPBS FCS 50ml (终浓度

900ml 5％)

4％NaN３???50ml (终浓度 0.2％) 3. 固定液 DPBS 葡萄糖 甲 醛 1000ml 20g (终浓度 2％) 10ml 0.2g (终浓度 0.02％)

NaN３

严重同意楼上的讲解。 我是做流式细胞分析的间接荧光，图简单加一抗后只洗涤 一次，二抗后没有洗涤，就直接加另外一个抗体，结果做了好多次就是呈阴性反 应！排除了好久才多洗涤了两次，结果很是令人满意。 我想请问楼上：NaN３哪里有卖？谢谢！我找过，发现它是一种化学工业产品， 成桶成桶的卖，而且有剧毒啊！是不是不是同一种东东？

我做的是 zo-1 的免疫荧光，步骤如下： 1、细胞在盖片上生长融合到 95％－100％时，从孵箱中取出。 2、用预温的 1×PBS 洗 3 次，每次 10 分钟 3、4％的甲醛室温固定 20－30 分钟 4、1×PBS 洗 3 次，每次 10 分钟 5、0.2％Triton X－100 透化 2－5 分钟 6、1×PBS 洗 3 次，每次 10 分钟 7、5%BSA 室温封闭 30 分钟 8、加一抗（用 1％BSA 稀释）放在湿盒里，4 度过夜 9、1×PBS 洗 3 次，每次 10 分钟 10、加二抗（用 1％BSA 稀释）30 分钟，闭光！！！ 11、1×PBS 洗 3 次，每次 10 分钟 12、95％甘油封片 注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA 均用 1×PBS 稀释

从大鼠分离的 T 细胞能否直接做细胞免疫荧光

我做的大部分细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致： 1.取出细胞爬片放到 35mm 或 60mm 用过的细胞培养皿里，PBS 洗三遍。 注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意 反正 面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加 PBS 不要太冲，不 要细胞冲下来。洗的时候我都是多加 PBS，稍晃一下就倒掉，没有等 5 分钟或 10 分钟。 2. 4％冷的多聚甲醛固定 20 分钟，PBS 洗三遍。 3. 0.2％Triton X－100 通透 10 分钟，PBS 洗三遍。 4. 与二抗相同宿主的血清封闭 30 分钟，PBS 洗三遍。 5. 一抗 4 度湿盒内过夜，也可 37 度 2 小时，感觉前者效果好，PBS 洗三遍。 6.二抗室温 2 小时（避光），或者 37 度 1 半小时，PBS 洗三遍。 7.最好用 DAPI 染核，然后直接照荧光片。 8.蒸馏水洗掉 PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会 干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。 建议： 1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问 题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光

会崔灭的。2.荧光的片子一 定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之 前一定离心， 不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光 光点，非常难看。

我要做的是 occludin，可是效果不是很好，可以用甲醇固定吗，和甲醛比那个 合适

各位同仁:

我现在急于做人乳腺癌细胞 MCF-7 的免疫荧光实验， 目的是测凋亡时， 基因 bax、 bcl-2 的蛋白表达变化。不知道怎么选一抗和二抗试剂盒。请高手指教。

万分感谢！

能发一个邮件更好，再一次感谢！ 我的 E-mail：[email protected]

抗淬灭剂可拿来直接封片,20 微升即可.之后片子可保留更长时间

bu 不是原创

我是做悬浮细胞 THP-1 的， 是人单核细胞系，主要问题是悬浮细胞在洗涤以及孵 育次数多了会越洗越少， 请问各位怎么洗法细胞不会变少。 （离心转速比较重要， 还有有人说离心后上清不用移液器吸，直接倒比较好，我也试过，可还是越来越 少）

顶一下

我也遇到了同样的问题， 不知那位高人能够指点迷津？另悬浮培养的细胞是不是 也需要先固定在做后面的处理？

我听说悬浮细胞是最后一步才固定，我的实验步骤中太多道听途说啊，没办法， 找不到完全相同的文献，很多 protocol 都是针对贴壁细胞。。。

不是悬浮细胞，是检测的蛋白在细胞膜上的是最后一步固定

MTT 分 析 法 以 活 细 胞 代 谢 物 还 原 剂 3-(4 ， 5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3 ， 5-diphenytetrazoliumromide， MTT 噻唑蓝为基础。MTT 为黄色化合物，是一种接受氢离子的 染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和 细胞色素 C 的作用下 tetrazolium 环开裂，生成蓝色的 formazan 结晶，formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目 成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将 MTT 还原)。还原生成的 formazan 结晶可在含 50%的 N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的 MTT 溶解液中溶解，利用

酶标仪测定490 nm 处的光密度 OD 值，以反映出活细胞数目。也可以用 DMSO 来溶解。 MTT 粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超 净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 一、步骤 1、接种细胞 用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96 孔板，每孔体积200ul。 2、培养细胞 同一般培养条件，培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。 3、呈色 培养3-5天后，每孔加 MTT 溶液(5mg/ml 用 PBS 配)20ul.继续孵育4小时，终止培养， 小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡

10分钟，使结晶物充分融解。 4、比色 选择490nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐 标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 二、注意事项 1、选择适当得细胞接种浓度。 2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽 孔内残余培养液。 3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致， 最后比色以空白调零。 MTT 实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系， IC50是半抑制率，意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度， 然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50%抑制 率时候的药品浓度，就是 IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可! 三、举例 各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度 为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式： Pm=0.95 Pn=0.06 P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1 lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025 IC50=0.00025 有一个公式可供参考;

lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) Xm：lg 最大剂量 I：lg(最大剂量/相临剂量) P：阳性反应率之和 Pm：最大阳性反应率 Pn：最小阳性反应率 抑制率=1-加药组 OD 值/对照组 OD 值 公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率 例： 用96孔板培养 SMMC-7721肝癌做 MTT 测细胞活力，应该加多少1640培养基，多少 MTT 和 DMSO 合适?根据书上说的加200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO 加 DMSO 之前 要尽量去掉培养液，便于 DMSO 溶解甲臜颗粒进行比色测定 一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT 加20ul，作用四小时后洗 掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然 后测吸光值。 一般要低于 IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。我 一般用1/2-1/3的 IC50，作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%，用 药后一般为5-10%(Annexin V)，细胞周期的亚 G0峰比较明显。

一、开机程序 1、检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。 2、 打开储液箱，倒掉废液， 并在废液桶中加入400ml 漂白水原液。打开压力阀，取 出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水，做分选必须用 PBS 或 FACSFlow)，合上 压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 3、将 FACSCalibur 开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是 STANDBY，预热5-10 分钟。排出过滤器内的气泡。 4、如果需要打印，打开打印机电源。 5、打开电脑，等待屏幕

显示出标准的苹果标志。 6、执行仪器 PRIME 功能一次，以排除 Flow Cell 中的气泡。 7、分析样品时，先用 FACAFlow 或 PBS 进行 HIGH RUN 约2分钟。 8、做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml 离心管，不接通 浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。 二、预设获取模式文件(Acquisition Template Files) 1、从苹果标志中选择 CELLQuest 见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文 件。 2、选取屏幕左列绘图工具中的 Dot plot，绘出一个或多个 Dot Plots(点图)。从 Dot Plot

对话框中选取 Acquisition 作为图形资料来源，并确定适当的 x 轴和 y 轴参数。 3、选取屏幕左列绘图工具中的 Histogram，同上法可绘出 Histogram(直方图)。 4、将此视窗命名后储存于 FACStation G3BD Applications CELLQuest Folder EXP 文 件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。 5 、本计算机中已设定两个模式文件： ACQ 和 EXP ，储存于 FACStation G3BD Applications CELLQuest EXP 文件夹中，ACQ 用于细胞 DNA 检测，EXP 用于细胞表面标 志分析。 三、用 CELLQuest 进行仪器的设定和调整 1、从苹果画面中选取 CELLQuest，进入 CELLQuest 后在 File 指令栏中打开合适的获 取模式文件。 2、从屏幕上方 Acquire 指令栏中，选取 Connect to Cytometer(快捷键： +B)进行电脑 和仪器的连机。将出现的 Acquisiton Control 对话框移至合适位置。 3、 从 Cytometer 指令栏中， 开启 Detectors/Amps、 Threshold、 Compensation、 Status 等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用 +1， 2，3，4获得此四个对话框。 4、在 Detectors/Amps 对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode)： 线性模式 Lin 或对数模式 Log。 一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时， FSC 和 SSC 多以线性模式 Lin 测量，且 DDM Param 选择 FL2，而 FL1， FL2与 FL3则以 对数模式 Log 测量;分析细胞 DNA 含量时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以 Lin 进行测 量，且 DDM Param 选择 FL2;分析血小板表型时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3等均以 Log 进行测量。 5、放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于 RUN，流速可在 HIGH 或 LOW 上。 6、在 Acquisiton Control 对话框中，选取 Acquire，开始获取细胞。在以下的仪器调整 过程中随时选取 Pause，Restart 以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉 SETUP 前 的 。 7、在 Detectors/Amps 对话框中，调整 FSC 和 SSC 探测器中的信号倍增度：PMT voltages(粗调)与 Amp Gains(细调)，使样品信号出现在 FSC-SSC 点图内，且三群细胞合 理分布。 8、在 Threshold 对话框中选择适当的参数设定 Threshold，并调

整 Threshold 的高低， 以减少噪音信号(细胞碎片)。 一般做细胞表型时用 FSC-H 而做 DNA 时用 FL2-H。 Threshold 并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质量。 9、从屏幕左列绘图工具中选取 Region(区域)，并在靶细胞周围设定区域线，即通常所 说的门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。 10、在 Detectors/Amps 对话框中，调整荧光检测器(FL1， FL2， FL3， FL4等)的倍 增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群，使之分布在正确的区域内。 11、在 Compensation 对话框中，根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色(或多色) 荧光染色所需的荧光补偿。比如应该为 FL1+ FL2- 的细胞群却分布在 FL1+ FL2+区域内，

则需调大 FL2-?%FL1中的“?”，并从 FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当 12、 在 Status 对话框中可见： Laser Power： 正常值—Run/Ready 为14.7mW， Standby 为5mW;Laser current：正常值为6Amps 左右。 13、调整好的仪器设定可在 Instrument Settings 对话框中储存，下次进行相同实验时 可调出使用，届时只需微调即可。 四、通过预设的获取模式文件进行样品分析 1、从苹果标志中选择 CELLQUEST，新视窗出现后从 File 指令栏中选择 Open，打开 预设的获取模式文件。 2、 从屏幕上方 Acquire 指令栏中， 选取 Connect to Cytometer 进行电脑和仪器的连机。 将出现的 Acquisiton Control 对话框移至合适位置。 3、从 Cytometer 指令栏中选取 Instrument Settings，在其对话框中选择 Open 以调出 以前存储的相同实验的仪器设定，按 Set 确定。 4、在 Acquire 指令栏中，选择 Acquisition&Storage 决定储存的细胞数，参数，信号道 数。 其中 Resolution 在做细胞表面标志时选择256， 做 DNA 时选择1024。 Parameter Saved… 则根据不同的检测对象选择不同的参数。 5、在 Acquire 指令栏中，选择 Parameter Description，以决定文件存储位置(folder)， 文件名称(file)，样品代号以及各种参数的标记(panel)，即安排 tube1，2，3…的检测参数。 一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于 FACStation G3BD Applications CELLQuest IMM 和 DNA 文件夹中。文件根据日期命名。 6、在 Cytometer 指令栏中，选择 Counters，将此对话框移至合适位置，以便于随时观 察 events 计数。 7、将样品试管放至检测区，在 Acquire Control 对话框中选取 Acquire 以启动样品分析 测定。 8、 微调仪器设定， 待细胞群分布合适后选择 Acquire Control 对话框中 Pause， Abort， 去除 Setup 前的 ，开始正式获取信号，存储数据。 9、当一定数目的细胞被测定后，获取会自动停止，并会自动存储数据。重复步骤7， 继续分析下一个样品，直到所有的样品数据分析完毕。 10、当所有样品分析分

析完毕，即换上三蒸水，并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态， 以保护激光管。 五、关机程序 1、从 File 中选择 Quit， 退出软件，选择 Don't Save 至苹果屏幕。 2、用4ml 1：10稀释的漂白水作样品，将样品置于旁位(vacuum is on)，以外管吸去约 2ml，在将样品架置于中位(vacuum is off)，再 HIGH RUN 5分钟(内管吸去2ml)。 3、改用三蒸水4ml 作样品，同上处理。 4、按 Prime 三次。 5、此时仪器自动转为 STANDBY 状态，换2ml 三蒸水。必须在仪器处于“STANDBY” 状态10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源，以延长激光管寿命，并确保

应用软件的正常运行。 6、填写使用登记表。

细胞免疫荧光实验步骤

细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白 H7.2-7.4 37 度 PBS 2 小时. 2.-20 度甲醇固定 20 分钟后,自然、干燥 10 分钟 3.PBS 洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成 50ultriton+5mlpBS 5.PBS 洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度 ８.４度 ９.二抗 PBS 洗净，３min＊５次 ３７度小于一小时 PBS 洗净，３＊５min １－２小时

１０.３７度

凉干封片（封闭液ＰＨ８.５）

活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用 10％FCS RPMI1640 调整细胞浓度为

5×10６～１×10７／ml ↓ 取 40μ l 细胞悬液加入预先有特异性 McAb(5～50μ l) 的小玻璃管或塑料离心管，再加 50μ l 1∶20(用 DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤 2 次，每次加洗涤液 2ml 左右 1000rpm×5min

↓ 弃上清，加入 50μ l 工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓ 4℃ 30min

用洗涤液洗涤 2 次，每次加液 2ml 左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为 FCM 制备标本，一般加入 1ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入 100～500μ l 固定液) ↓ FCM 检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存 5～7 天)

（二）试剂和器材 1. 2. 3. 4. 各种特异性单克隆抗体。 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

（三）注意事项 1. 整个操作在 4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高 10 倍的 NaN

３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白 Fc 受体，降低和防 洗涤要充分， 以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假

止非特异性染色。 4. 附: 1. DPBS (×10, 贮存液) 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

NaCl 80g KCl 2g 蒸馏水加至 1000ml

Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水 1∶10 稀释 KH２PO４ 2g 2. 洗涤液 DPBS FCS 50ml (终浓度 900ml 5％)

4％NaN３???50ml (终浓度 0.2％) 3. 固定液 DPBS 葡萄糖 甲 醛 1000ml 20g (终浓度 2％) 10ml 0.2g (终浓度 0.02％)

NaN３ 4.

玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

（三）注意事项 1. 整个操作在 4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高 10 倍的 NaN

３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白 Fc

受体，降低和防 洗涤要充分， 以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假

止非特异性染色。 4. 附: 1. DPBS (×10, 贮存液) NaCl 80g KCl 2g 蒸馏水加至 1000ml 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水 1∶10 稀释 KH２PO４ 2g 2. 洗涤液

DPBS FCS 50ml (终浓度

900ml 5％)

4％NaN３???50ml (终浓度 0.2％) 3. 固定液 DPBS 葡萄糖 甲 醛 1000ml 20g (终浓度 2％) 10ml 0.2g (终浓度 0.02％)

NaN３

严重同意楼上的讲解。 我是做流式细胞分析的间接荧光，图简单加一抗后只洗涤 一次，二抗后没有洗涤，就直接加另外一个抗体，结果做了好多次就是呈阴性反 应！排除了好久才多洗涤了两次，结果很是令人满意。 我想请问楼上：NaN３哪里有卖？谢谢！我找过，发现它是一种化学工业产品， 成桶成桶的卖，而且有剧毒啊！是不是不是同一种东东？

我做的是 zo-1 的免疫荧光，步骤如下： 1、细胞在盖片上生长融合到 95％－100％时，从孵箱中取出。 2、用预温的 1×PBS 洗 3 次，每次 10 分钟 3、4％的甲醛室温固定 20－30 分钟 4、1×PBS 洗 3 次，每次 10 分钟 5、0.2％Triton X－100 透化 2－5 分钟 6、1×PBS 洗 3 次，每次 10 分钟 7、5%BSA 室温封闭 30 分钟 8、加一抗（用 1％BSA 稀释）放在湿盒里，4 度过夜 9、1×PBS 洗 3 次，每次 10 分钟 10、加二抗（用 1％BSA 稀释）30 分钟，闭光！！！ 11、1×PBS 洗 3 次，每次 10 分钟 12、95％甘油封片 注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA 均用 1×PBS 稀释

从大鼠分离的 T 细胞能否直接做细胞免疫荧光

我做的大部分细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致： 1.取出细胞爬片放到 35mm 或 60mm 用过的细胞培养皿里，PBS 洗三遍。 注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意 反正 面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加 PBS 不要太冲，不 要细胞冲下来。洗的时候我都是多加 PBS，稍晃一下就倒掉，没有等 5 分钟或 10 分钟。 2. 4％冷的多聚甲醛固定 20 分钟，PBS 洗三遍。 3. 0.2％Triton X－100 通透 10 分钟，PBS 洗三遍。 4. 与二抗相同宿主的血清封闭 30 分钟，PBS 洗三遍。 5. 一抗 4 度湿盒内过夜，也可 37 度 2 小时，感觉前者效果好，PBS 洗三遍。 6.二抗室温 2 小时（避光），或者 37 度 1 半小时，PBS 洗三遍。 7.最好用 DAPI 染核，然后直接照荧光片。 8.蒸馏水洗掉 PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会 干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。 建议： 1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问 题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光

会崔灭的。2.荧光的片子一 定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之 前一定离心， 不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光 光点，非常难看。

我要做的是 occludin，可是效果不是很好，可以用甲醇固定吗，和甲醛比那个 合适

各位同仁:

我现在急于做人乳腺癌细胞 MCF-7 的免疫荧光实验， 目的是测凋亡时， 基因 bax、 bcl-2 的蛋白表达变化。不知道怎么选一抗和二抗试剂盒。请高手指教。

万分感谢！

能发一个邮件更好，再一次感谢！ 我的 E-mail：[email protected]

抗淬灭剂可拿来直接封片,20 微升即可.之后片子可保留更长时间

bu 不是原创

我是做悬浮细胞 THP-1 的， 是人单核细胞系，主要问题是悬浮细胞在洗涤以及孵 育次数多了会越洗越少， 请问各位怎么洗法细胞不会变少。 （离心转速比较重要， 还有有人说离心后上清不用移液器吸，直接倒比较好，我也试过，可还是越来越 少）

顶一下

我也遇到了同样的问题， 不知那位高人能够指点迷津？另悬浮培养的细胞是不是 也需要先固定在做后面的处理？

我听说悬浮细胞是最后一步才固定，我的实验步骤中太多道听途说啊，没办法， 找不到完全相同的文献，很多 protocol 都是针对贴壁细胞。。。

不是悬浮细胞，是检测的蛋白在细胞膜上的是最后一步固定

MTT 分 析 法 以 活 细 胞 代 谢 物 还 原 剂 3-(4 ， 5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3 ， 5-diphenytetrazoliumromide， MTT 噻唑蓝为基础。MTT 为黄色化合物，是一种接受氢离子的 染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和 细胞色素 C 的作用下 tetrazolium 环开裂，生成蓝色的 formazan 结晶，formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目 成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将 MTT 还原)。还原生成的 formazan 结晶可在含 50%的 N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的 MTT 溶解液中溶解，利用

酶标仪测定490 nm 处的光密度 OD 值，以反映出活细胞数目。也可以用 DMSO 来溶解。 MTT 粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超 净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 一、步骤 1、接种细胞 用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96 孔板，每孔体积200ul。 2、培养细胞 同一般培养条件，培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。 3、呈色 培养3-5天后，每孔加 MTT 溶液(5mg/ml 用 PBS 配)20ul.继续孵育4小时，终止培养， 小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡

10分钟，使结晶物充分融解。 4、比色 选择490nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐 标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 二、注意事项 1、选择适当得细胞接种浓度。 2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽 孔内残余培养液。 3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致， 最后比色以空白调零。 MTT 实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系， IC50是半抑制率，意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度， 然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50%抑制 率时候的药品浓度，就是 IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可! 三、举例 各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度 为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式： Pm=0.95 Pn=0.06 P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1 lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025 IC50=0.00025 有一个公式可供参考;

lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) Xm：lg 最大剂量 I：lg(最大剂量/相临剂量) P：阳性反应率之和 Pm：最大阳性反应率 Pn：最小阳性反应率 抑制率=1-加药组 OD 值/对照组 OD 值 公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率 例： 用96孔板培养 SMMC-7721肝癌做 MTT 测细胞活力，应该加多少1640培养基，多少 MTT 和 DMSO 合适?根据书上说的加200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO 加 DMSO 之前 要尽量去掉培养液，便于 DMSO 溶解甲臜颗粒进行比色测定 一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT 加20ul，作用四小时后洗 掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然 后测吸光值。 一般要低于 IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。我 一般用1/2-1/3的 IC50，作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%，用 药后一般为5-10%(Annexin V)，细胞周期的亚 G0峰比较明显。

一、开机程序 1、检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。 2、 打开储液箱，倒掉废液， 并在废液桶中加入400ml 漂白水原液。打开压力阀，取 出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满(一般可用三蒸水，做分选必须用 PBS 或 FACSFlow)，合上 压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 3、将 FACSCalibur 开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是 STANDBY，预热5-10 分钟。排出过滤器内的气泡。 4、如果需要打印，打开打印机电源。 5、打开电脑，等待屏幕

显示出标准的苹果标志。 6、执行仪器 PRIME 功能一次，以排除 Flow Cell 中的气泡。 7、分析样品时，先用 FACAFlow 或 PBS 进行 HIGH RUN 约2分钟。 8、做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml 离心管，不接通 浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。 二、预设获取模式文件(Acquisition Template Files) 1、从苹果标志中选择 CELLQuest 见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文 件。 2、选取屏幕左列绘图工具中的 Dot plot，绘出一个或多个 Dot Plots(点图)。从 Dot Plot

对话框中选取 Acquisition 作为图形资料来源，并确定适当的 x 轴和 y 轴参数。 3、选取屏幕左列绘图工具中的 Histogram，同上法可绘出 Histogram(直方图)。 4、将此视窗命名后储存于 FACStation G3BD Applications CELLQuest Folder EXP 文 件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。 5 、本计算机中已设定两个模式文件： ACQ 和 EXP ，储存于 FACStation G3BD Applications CELLQuest EXP 文件夹中，ACQ 用于细胞 DNA 检测，EXP 用于细胞表面标 志分析。 三、用 CELLQuest 进行仪器的设定和调整 1、从苹果画面中选取 CELLQuest，进入 CELLQuest 后在 File 指令栏中打开合适的获 取模式文件。 2、从屏幕上方 Acquire 指令栏中，选取 Connect to Cytometer(快捷键： +B)进行电脑 和仪器的连机。将出现的 Acquisiton Control 对话框移至合适位置。 3、 从 Cytometer 指令栏中， 开启 Detectors/Amps、 Threshold、 Compensation、 Status 等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用 +1， 2，3，4获得此四个对话框。 4、在 Detectors/Amps 对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode)： 线性模式 Lin 或对数模式 Log。 一般进行细胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴细胞亚群时， FSC 和 SSC 多以线性模式 Lin 测量，且 DDM Param 选择 FL2，而 FL1， FL2与 FL3则以 对数模式 Log 测量;分析细胞 DNA 含量时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以 Lin 进行测 量，且 DDM Param 选择 FL2;分析血小板表型时，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3等均以 Log 进行测量。 5、放上待检测的样品，将流式细胞仪设定于 RUN，流速可在 HIGH 或 LOW 上。 6、在 Acquisiton Control 对话框中，选取 Acquire，开始获取细胞。在以下的仪器调整 过程中随时选取 Pause，Restart 以观察调整效果。未完全调整好之前不要去掉 SETUP 前 的 。 7、在 Detectors/Amps 对话框中，调整 FSC 和 SSC 探测器中的信号倍增度：PMT voltages(粗调)与 Amp Gains(细调)，使样品信号出现在 FSC-SSC 点图内，且三群细胞合 理分布。 8、在 Threshold 对话框中选择适当的参数设定 Threshold，并调

整 Threshold 的高低， 以减少噪音信号(细胞碎片)。 一般做细胞表型时用 FSC-H 而做 DNA 时用 FL2-H。 Threshold 并不影响检测器对信号的获取，但可改善画面质量。 9、从屏幕左列绘图工具中选取 Region(区域)，并在靶细胞周围设定区域线，即通常所 说的门。圈定合适的细胞群可使仪器调整更为容易。 10、在 Detectors/Amps 对话框中，调整荧光检测器(FL1， FL2， FL3， FL4等)的倍 增程度。根据所用的荧光阴性对照样品调整细胞群，使之分布在正确的区域内。 11、在 Compensation 对话框中，根据所用的调补偿用标准荧光样品调整双色(或多色) 荧光染色所需的荧光补偿。比如应该为 FL1+ FL2- 的细胞群却分布在 FL1+ FL2+区域内，

则需调大 FL2-?%FL1中的“?”，并从 FL1-FL2点图中观察新的调整是否恰当 12、 在 Status 对话框中可见： Laser Power： 正常值—Run/Ready 为14.7mW， Standby 为5mW;Laser current：正常值为6Amps 左右。 13、调整好的仪器设定可在 Instrument Settings 对话框中储存，下次进行相同实验时 可调出使用，届时只需微调即可。 四、通过预设的获取模式文件进行样品分析 1、从苹果标志中选择 CELLQUEST，新视窗出现后从 File 指令栏中选择 Open，打开 预设的获取模式文件。 2、 从屏幕上方 Acquire 指令栏中， 选取 Connect to Cytometer 进行电脑和仪器的连机。 将出现的 Acquisiton Control 对话框移至合适位置。 3、从 Cytometer 指令栏中选取 Instrument Settings，在其对话框中选择 Open 以调出 以前存储的相同实验的仪器设定，按 Set 确定。 4、在 Acquire 指令栏中，选择 Acquisition&Storage 决定储存的细胞数，参数，信号道 数。 其中 Resolution 在做细胞表面标志时选择256， 做 DNA 时选择1024。 Parameter Saved… 则根据不同的检测对象选择不同的参数。 5、在 Acquire 指令栏中，选择 Parameter Description，以决定文件存储位置(folder)， 文件名称(file)，样品代号以及各种参数的标记(panel)，即安排 tube1，2，3…的检测参数。 一般本仪器获取的数据按照检测对象的不同分别储存于 FACStation G3BD Applications CELLQuest IMM 和 DNA 文件夹中。文件根据日期命名。 6、在 Cytometer 指令栏中，选择 Counters，将此对话框移至合适位置，以便于随时观 察 events 计数。 7、将样品试管放至检测区，在 Acquire Control 对话框中选取 Acquire 以启动样品分析 测定。 8、 微调仪器设定， 待细胞群分布合适后选择 Acquire Control 对话框中 Pause， Abort， 去除 Setup 前的 ，开始正式获取信号，存储数据。 9、当一定数目的细胞被测定后，获取会自动停止，并会自动存储数据。重复步骤7， 继续分析下一个样品，直到所有的样品数据分析完毕。 10、当所有样品分析分

析完毕，即换上三蒸水，并将流式细胞仪置于“STANDBY”状态， 以保护激光管。 五、关机程序 1、从 File 中选择 Quit， 退出软件，选择 Don't Save 至苹果屏幕。 2、用4ml 1：10稀释的漂白水作样品，将样品置于旁位(vacuum is on)，以外管吸去约 2ml，在将样品架置于中位(vacuum is off)，再 HIGH RUN 5分钟(内管吸去2ml)。 3、改用三蒸水4ml 作样品，同上处理。 4、按 Prime 三次。 5、此时仪器自动转为 STANDBY 状态，换2ml 三蒸水。必须在仪器处于“STANDBY” 状态10分钟后再依次关掉计算机、打印机、主机、稳压电源，以延长激光管寿命，并确保

应用软件的正常运行。 6、填写使用登记表。