实验25 动物细胞线粒体及线粒体DNA 的制备、酶切图谱分析
实验目的：
了解并掌握细胞线粒体(mitochondria)的提取原理及操作方法；了解线粒体DNA 的限制性片段长度多态性（RFLP ）分析技术的原理及操作方法。
实验原理：
线粒体是真核细胞中产生能量的重要细胞器。细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成A TP ，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
1、 线粒体的获得
细胞器的游离：细胞器的游离需要破碎细胞，破碎细胞常用的方法有化学法和机械法。化学法有渗透压作用、酶水解、自溶、冻融等几种类型。渗透压作用是利用低表面张力使细胞膜破碎，其作用温和。自溶法是利用生物自生的活细胞内含有各种大量的消化酶，它们能将细胞膜溶解掉，同时也可能将线粒体膜溶解而使线粒体DNA 释放出来。冻融法是利用冻结和溶解的双重作用，其作用可能会造成细胞膜和有膜结构的细胞器的破裂，其作用较为剧烈。 机械法有研磨破碎、均质机破碎、超声波破碎和匀浆器破碎。研磨破碎是利用盘磨研磨剪切破碎，作用中等。均质机破碎是用电带动刀片进行剪切组织器官，其作用较剧烈，基本能够将组织器官破碎。超声波破碎是随机地将组织细胞打成各种大小不同的片段，其作用非常剧烈。匀浆器破碎是一种手动的方法，由于匀浆器容器壁较为粗糙，通过相互的摩擦，基本能将细胞膜磨破，其作用温和。要获得较为完整而大量的线粒体，通常用STE 抽提缓冲液浸泡材料并用玻璃匀浆器或研钵研磨破碎。
线粒体的粗提：由于动物细胞的线粒体较小（15~19kb），而真核细胞及其碎片、蛋白质沉淀物都比较大，所以用差速离心的方法可以将它们分离开来。差速离心法又叫分级离心法，是当非均一粒子(大小、密度各不相同) 的悬浮液被离心时，各种粒子将以各自的沉降速率移至离心管底部，逐步在管底形成沉淀。为了分出特定组分，需进行一系列离心。首先选择一个离心速度和离心时间，第一次离心时把大部分不需要的更大粒子沉降去掉。这时所需要的组分大部分还留在上清液中，又选择第二个离心速度和离心时间，使大部分不需要的更小的粒子留在上清液。去掉上清液后，添加相同介质把沉淀悬浮起来，重复上述的差速离心，反复几次，直至达到所需要的粒子纯度为止。一般去细胞碎片及杂质的离心力(500~2000g)和离心时间(5~15min)，沉淀线粒体的离心力(12000~20000g)和离心时间(20~40min)。
2、线粒体的鉴定
JanusGreen B 是对线粒体专一的活体染料，具有脂溶性，能跨过细胞膜，有染色能力的基团带正电，结合在负电性的线粒体内膜上，内膜的细胞色素C 氧化酶使染料保持氧化状态，呈现蓝绿色，而在胞质内，染料被还原成无色。线粒体浸没在JanusGreen B中能维持活性数小时，可直接观察到生活状态线粒体的外形、分布及运动。线粒体制品经JanusGreen B特意染色后，光学显微镜下放大100倍镜检能够发现是否有线粒体存在及它的大小、形状、数量、结构。
必须指出的是，只有具有活性的细胞色素C 氧化酶才能够把詹纳斯绿B 氧化，从而使它显出颜色，因此，在实验过程中务必保持所取的材料的活性。通常，需要把生物材料置于０℃～４℃的冰水浴低温中，并且操作要迅速。
3、动物线粒体DNA （mtDNA ）的提取方法
线粒体DNA(mtDNA)是一种封闭的双链环状分子，动物线粒体DNA 为15~19kb。动物线粒体DNA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点，已广泛应用于动物群体
遗传学和进化生物学等领域的研究。
本实验采用SDS 裂解结合蛋白酶K 消化的方法的提取mtDNA 。SDS （十二烷基硫酸钠) 破坏线粒体膜并使蛋白质变性，从而游离出核酸，EDTA 抑制细胞中DNase 活性，蛋白酶K 进一步将蛋白质降解成小肽。之后加入饱和乙酸钠后，绝人部分线性大分子DNA 和蛋白质在SDS 作用下变性形成沉淀，环状mtDNA 仍为自然状态，通过高速离心，即可得到mtDNA 。高盐沉淀法操作简单，易重复，产量多，可依需用量扩大反应体系，使mtDNA 质量得以容易控制。
4、mtDNA 的检测
检测线粒体DNA 浓度和纯度通常有3种方法，即琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶酶切和紫外分光光度计(UV)。琼脂糖凝胶电泳可以通过泳带颜色的深浅来判断其浓度，通过是否有拖带来确定其纯度，还可以通过分子量标记来确定mtDNA 的大小。限制性内切酶酶切可以知道是否为基因组，如果是基因组，则不能酶切出清晰的条带来；如果没有基因组污染，只要该mtDNA 存在此酶切位点，就会酶切出条带来。紫外分光光度计可以测得A260和A260/A280，其中A260越大，其DNA 的浓度也越大，反之越小。A260/A280一般介于1.6~2.0之间，如果A260/A280>2.0，则此DNA 可能有RNA 污染，A260/A280
5、mtDNA 的限制性内切酶分析——RFLP
限制性片段长度多态性（RFLP ）分析技术：每一限制性核酸内切酶在切割DNA 分子时都有固定的切点序列，DNA 分子中核苷酸排列顺序的变化有可能使该切点丢失或增加。由于不同生物群体的DNA 序列千差万别，因而用同一限制性内切酶消化后，所得DNA 片段的长度分布也是千变万化的。这种酶切片段长度分布的多样性就称为限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism ， RFLP) ，RFLP 常用于生物群体的遗传分析。经典的RFLP 方法是将纯化的DNA 用限制性内切酶消化后，琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色直接显示出酶切片段长度的变化。这种变化是因为核甘酸序列变异导致切点的消失或产生，最后使限制性片段长度发生变化。早期使用RFLP 方法实际上就是限制性核酸内切酶酶切图谱分析法，这种方法后来广泛用于动物线粒体DNA 、植物叶绿体DNA 和病原微生物DNA 多态性的检测。根据DNA 酶切后产生的片段数量和大小分析鉴别DNA 间的相似程度。 RFLP 技术也可以用限制性核酸内切酶酶切消化核酸以及标记的DNA 探针能与任何序列相似的片段杂交，通过片段长度的变异检测多态性，如Southern 杂交。
本实验利用差速离心法从体外培养的动物细胞或新鲜动物肝脏组织提取线粒体。培养细胞可用人HL-7702或HeLa 细胞。每个HeLa 细胞中约含200个线粒体。
实验试剂：
[1]. PBS 溶液：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO 4，2mM KH2PO 4。配制：用800ml
水溶解8g NaCl ，0.2g KCl ，3.22g Na 2HPO 4·12H 2O ，0.24g KH 2PO 4；用HCl 将pH 调至7.4；定容至1000 ml。高压灭菌或过滤除菌，室温保存。
[2]. 1%詹纳斯绿B 染液：用0.9%灭菌的生理盐水配制。
[3]. RSB （低渗缓冲液）：10mM NaCl，2.5mM CaCl2，10mM Tris HCl，pH 7.5
[4]. 2.5×MS 缓冲液：525mM 甘露醇，175mM 蔗糖，12.5mM Tris-HCl，pH 7.5, 2.5 mM
EDTA ，pH 7.5
[5]. 裂解缓冲液：0.15M NaCl，10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0
[6]. 蛋白酶K 溶液（20mg/ml）：20mg 蛋白酶K 溶于1ml 灭菌ddH 2O 中，分装-20℃保存。
该储备液在-20℃可稳定保存一年。
[7]. 20% SDS
[8]. 8M NH4Ac
[9]. TE 缓冲液：10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA
[10]. RNase A：无DNase 的RNase A用TE 缓冲液配制成1mg/ml溶液，沸水浴加热15min ，
冷却后分装，-20℃保存。
[11]. λ DNA/BamHI Marker：16841、7233、6770、6527、5256/5505 bp。
实验步骤：
1、培养细胞中分离线粒体
[1]. 培养细胞，使细胞处于平台期，使活跃分裂的细胞数减少。
[2]. 培养细胞匀浆：0.25%胰蛋白酶消化细胞，PBS 洗涤，1500rpm 离心5~10 min收集细
胞，计数。每次提取需要5 × 107 个细胞。获得1~3ml漂洗后的细胞沉淀。
[3]. 用11ml 冰预冷的RSB 重新悬浮细胞，转移到一个15-ml 的Dounce 匀浆器中。
[4]. 让细胞膨胀5~10min。用相差显微镜监测膨胀过程。
[5]. 用研杵B （小间隙型）研磨几下使膨胀细胞破碎。
[6]. 立即加入8ml 2.5×MS 缓冲液至终浓度为1×MS 。 用封口膜封住匀浆器顶端，倒转
数次使溶液混匀（如果要进行标志酶检测，还要留下部分匀浆）。
[7]. 将匀浆转至离心管中进行差速离心。用少量MS 清洗匀浆器并将清洗液加入匀浆中，
用MS 缓冲液将体积加至30ml 。
[8]. 匀浆在1300g 离心5min 以除去细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。
[9]. 将上清倒在一个干净的离心管中。沉淀上层会比较松，因此要注意不要使其进入上清。
[10]. 重复“沉淀细胞核”步骤两次。
[11]. 将上清转移到一干净离心管中，17000g 离心15min ，沉淀线粒体。
[12]. 抛弃上清，用适合后续工作的缓冲液重悬沉淀。
2、组织中分离线粒体
[1]. 取出肝脏，称量后在培养皿中用刀片切碎，用1×MS 冲洗两次除血。
[2]. 转移到匀浆器中，加入足够的1×MS ，制备1：10的匀浆。
[3]. 冰上充分匀浆。
[4]. 将匀浆转至离心管中，用少量MS 清洗匀浆器并将清洗液加入匀浆中（如果要进行标
志酶检测，还要留下部分匀浆）。
[5].
[6].
[7].
[8]. 匀浆在1300g 离心10min 以除去细胞核、未破碎的细胞、细胞质膜和结缔组织纤维。 将上清倒在一个干净的离心管中，置冰上保存。 用起始体积一半的1×MS 重悬沉淀，1300g 离心10min 。 取出上清并加到第6步的上清中。
[9]. 两次的上清一起1300g 离心10min ，收集上清，再次离心。
[10]. 收集上清，17000g 离心15min 。
[11]. 抛弃上清，用1×MS 重悬沉淀以漂洗线粒体，重复17000g 离心步骤。
[12]. 抛弃上清，用适合后续工作的缓冲液重悬沉淀。
3、线粒体的詹纳斯绿B 染色
方式一：取线粒体沉淀1 滴涂片，滴加1%詹纳斯绿B （Janus Green B）染液染20min ，覆上盖玻片，镜检。
方式二：或将1％Janus green B 溶液按1：1比例加入线粒体悬液中，在室温或水浴中染15~20min，用吸管吸取一滴线粒体悬液，滴于载玻片上，加盖玻片后，放显微镜下进行观察。
Janus green B染色时，线粒体为蓝绿色圆形颗粒。线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
4、线粒体DNA （mtDNA ）提取
[1]. 适当的1×MS 悬浮分离的线粒体。常温下静置15min 。12000rpm 离心8min 。
[2]. 线粒体裂解：线粒体沉淀（50μl ）中加入450μl 裂解缓冲液、2.5μl Proteinase K（终浓
度为100μg/ml）和10μl 20% SDS（终浓度为0.4%）。在37℃水浴2h 以上裂解线粒体。
[3]. 线粒体裂解液冷却至室温后加8M NH 4Ac 使终浓度至0.8M ， 加等体积酚:氯仿:异戊
醇（25:24:1）， 缓慢混匀10min 以上，4℃ 10000g 离心15min 抽提DNA 。
[4]. 取上层水相， 加等体积氯仿, 缓慢混匀10min 以上， 4℃ 10000g 离心15min 。
[5]. 取上层水相， 加1/10体积的8M NH4Ac 和2.5倍体积预冷的无水乙醇，缓慢混合， 放
入-20℃冰箱中2h 到过夜。
[6]. 次日取出后在4℃ 13000g 离心15min 收集DNA 沉淀。
[7]. 用70％的乙醇洗涤沉淀3次， 空气干燥沉淀。
[8]. 用适量TE 缓冲液溶解mtDNA 沉淀。
[9]. mtDNA 溶液中加入Rnase 使其终浓度为200μg/ml，37℃消化3h 。
[10]. mtDNA 溶液-20℃保存备用。
5、mtDNA 样品鉴定
[1]. 紫外分光光度法测定样品经适当稀释，用紫外分光光度计定量。
[2]. 琼脂糖凝胶电泳电泳：用0.7%琼脂糖凝胶电泳，6μl溶解液与2μl上样液混匀后上样，
电泳结果与DNA Marker比较，紫外灯下观察并拍照。mtDNA 样品电泳后，应可见约16 kb的单一mtDNA 条带。
6、线粒体DNA （mtDNA ）的RE 酶切图谱
[1]. EcoRI 和HindIII 单酶完全酶切，反应体积20~30μl， 含线粒体DNA 0.5~1μg， 内切
酶2~4Ｕ，37℃水浴1~3ｈ。
[2]. 反应完毕，加入1/10体积的限制性内切酶反应终止液或者65℃加热10min 终止反应。
用0.7%琼脂糖凝胶电泳分析。
注意事项：
[1]. 全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中。
[2]. 操作速度要尽量的快速。 微量制备比大规模制备操作更方便和快速，因而更容易获
得完整的线粒体。
[3]. 在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。与组织块相比，培
养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。在相差显微镜下检查未裂解细胞应在50%左右即可。过度研磨将破坏线粒体，研磨不足将降低得率；
[4]. 当细胞重悬于至少5~10倍细胞体积的溶液中并且悬液体积至少使匀浆器处于半充满
状态时，匀浆效果最好。推匀浆器研杵时要垂直向下，保持稳、有力的压力。Dounce 匀浆器通过压力变化使细胞破裂。研杵向下推进的过程中，细胞周围的压力增加；当细胞从研杵末端滑过时，压力的突然降低使细胞破裂。如果研杵与匀浆器之间非常紧密，也会有一部分机械破碎因素。
[5]. 匀浆组织时，电动玻璃匀浆器的匀浆次数很关键。匀浆器在1500rpm 的条件下，应清
楚上下匀浆的次数，匀浆次数过少时线粒体游离的量少， 影响提取量； 而匀浆次数过多时核膜破裂， 增加了核DNA 污染。为了弄清楚上下匀浆的次数， 可先匀浆5~6次，取样；再匀浆5~6次， 取样；依次增加匀浆次数再分别取样。最后把所取的样品用詹纳斯绿B 染色后分别在显微镜下镜检，以游离线粒体较多、 细胞核未破裂、 完整细胞少为最好，以后匀浆的次数以此为标准。
[6]. 用相差显微镜检查匀浆程度。应该能看到裸露的细胞核（内部有明显核仁的光滑球
体），小的细胞器（黑色颗粒状物）和少量的未破碎的细胞（大的颗粒状球体）。如果裸露细胞核占总细胞数80%~90%，说明效果很好。如果想再提高这一百分比，通常会导致损坏的细胞核数量上升，从而在第一步离心时，使更多的线粒体混进核物质沉淀中。
[7]. 因为在低渗缓冲液中操作，所以匀浆时越快越好，如果为了更充分破碎细胞而使推捣
次数超过10~15次，就需要更紧密吻合的匀浆器。
[8]. 差速离心是提取线粒体的关键。在提取线粒体时，去除细胞碎片及杂质的离心力为
1000~1500rpm（500~1000g），离心时间为10~15min；沉淀线粒体的离心力为10000~12000rpm（12000~20000g），离心时间为20~30min。以离心力g 计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。
[9]. 肝脏组织的mtDNA 得率约为5μg/g组织。
[10]. 核DNA 的去除：可用DNase I（终浓度为100μg/ml）37℃消化30min ，以消除粘附在
线粒体外膜的核DNA ，以防核DNA 的干扰。
[11]. 去除RNA 污染：可在mtDNA 初步提取后，用无DNase I 的RNase A （终浓度为
20~40μg/ml），于37℃消化60min ，再抽提掉蛋白质，即可得到纯净的mtDNA 。
人肺癌组织mtDNA 琼脂糖凝胶电泳图谱[中国肺癌杂志
, 2005, 8(3):186-189]
黄鳝线粒体DNA 的RE 酶切分析：1~2：EcoRI ；3~4：HindIII
[湖北农业科学，2008，47（3）：262-264]
实验25 动物细胞线粒体及线粒体DNA 的制备、酶切图谱分析
实验目的：
了解并掌握细胞线粒体(mitochondria)的提取原理及操作方法；了解线粒体DNA 的限制性片段长度多态性（RFLP ）分析技术的原理及操作方法。
实验原理：
线粒体是真核细胞中产生能量的重要细胞器。细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成A TP ，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
1、 线粒体的获得
细胞器的游离：细胞器的游离需要破碎细胞，破碎细胞常用的方法有化学法和机械法。化学法有渗透压作用、酶水解、自溶、冻融等几种类型。渗透压作用是利用低表面张力使细胞膜破碎，其作用温和。自溶法是利用生物自生的活细胞内含有各种大量的消化酶，它们能将细胞膜溶解掉，同时也可能将线粒体膜溶解而使线粒体DNA 释放出来。冻融法是利用冻结和溶解的双重作用，其作用可能会造成细胞膜和有膜结构的细胞器的破裂，其作用较为剧烈。 机械法有研磨破碎、均质机破碎、超声波破碎和匀浆器破碎。研磨破碎是利用盘磨研磨剪切破碎，作用中等。均质机破碎是用电带动刀片进行剪切组织器官，其作用较剧烈，基本能够将组织器官破碎。超声波破碎是随机地将组织细胞打成各种大小不同的片段，其作用非常剧烈。匀浆器破碎是一种手动的方法，由于匀浆器容器壁较为粗糙，通过相互的摩擦，基本能将细胞膜磨破，其作用温和。要获得较为完整而大量的线粒体，通常用STE 抽提缓冲液浸泡材料并用玻璃匀浆器或研钵研磨破碎。
线粒体的粗提：由于动物细胞的线粒体较小（15~19kb），而真核细胞及其碎片、蛋白质沉淀物都比较大，所以用差速离心的方法可以将它们分离开来。差速离心法又叫分级离心法，是当非均一粒子(大小、密度各不相同) 的悬浮液被离心时，各种粒子将以各自的沉降速率移至离心管底部，逐步在管底形成沉淀。为了分出特定组分，需进行一系列离心。首先选择一个离心速度和离心时间，第一次离心时把大部分不需要的更大粒子沉降去掉。这时所需要的组分大部分还留在上清液中，又选择第二个离心速度和离心时间，使大部分不需要的更小的粒子留在上清液。去掉上清液后，添加相同介质把沉淀悬浮起来，重复上述的差速离心，反复几次，直至达到所需要的粒子纯度为止。一般去细胞碎片及杂质的离心力(500~2000g)和离心时间(5~15min)，沉淀线粒体的离心力(12000~20000g)和离心时间(20~40min)。
2、线粒体的鉴定
JanusGreen B 是对线粒体专一的活体染料，具有脂溶性，能跨过细胞膜，有染色能力的基团带正电，结合在负电性的线粒体内膜上，内膜的细胞色素C 氧化酶使染料保持氧化状态，呈现蓝绿色，而在胞质内，染料被还原成无色。线粒体浸没在JanusGreen B中能维持活性数小时，可直接观察到生活状态线粒体的外形、分布及运动。线粒体制品经JanusGreen B特意染色后，光学显微镜下放大100倍镜检能够发现是否有线粒体存在及它的大小、形状、数量、结构。
必须指出的是，只有具有活性的细胞色素C 氧化酶才能够把詹纳斯绿B 氧化，从而使它显出颜色，因此，在实验过程中务必保持所取的材料的活性。通常，需要把生物材料置于０℃～４℃的冰水浴低温中，并且操作要迅速。
3、动物线粒体DNA （mtDNA ）的提取方法
线粒体DNA(mtDNA)是一种封闭的双链环状分子，动物线粒体DNA 为15~19kb。动物线粒体DNA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点，已广泛应用于动物群体
遗传学和进化生物学等领域的研究。
本实验采用SDS 裂解结合蛋白酶K 消化的方法的提取mtDNA 。SDS （十二烷基硫酸钠) 破坏线粒体膜并使蛋白质变性，从而游离出核酸，EDTA 抑制细胞中DNase 活性，蛋白酶K 进一步将蛋白质降解成小肽。之后加入饱和乙酸钠后，绝人部分线性大分子DNA 和蛋白质在SDS 作用下变性形成沉淀，环状mtDNA 仍为自然状态，通过高速离心，即可得到mtDNA 。高盐沉淀法操作简单，易重复，产量多，可依需用量扩大反应体系，使mtDNA 质量得以容易控制。
4、mtDNA 的检测
检测线粒体DNA 浓度和纯度通常有3种方法，即琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶酶切和紫外分光光度计(UV)。琼脂糖凝胶电泳可以通过泳带颜色的深浅来判断其浓度，通过是否有拖带来确定其纯度，还可以通过分子量标记来确定mtDNA 的大小。限制性内切酶酶切可以知道是否为基因组，如果是基因组，则不能酶切出清晰的条带来；如果没有基因组污染，只要该mtDNA 存在此酶切位点，就会酶切出条带来。紫外分光光度计可以测得A260和A260/A280，其中A260越大，其DNA 的浓度也越大，反之越小。A260/A280一般介于1.6~2.0之间，如果A260/A280>2.0，则此DNA 可能有RNA 污染，A260/A280
5、mtDNA 的限制性内切酶分析——RFLP
限制性片段长度多态性（RFLP ）分析技术：每一限制性核酸内切酶在切割DNA 分子时都有固定的切点序列，DNA 分子中核苷酸排列顺序的变化有可能使该切点丢失或增加。由于不同生物群体的DNA 序列千差万别，因而用同一限制性内切酶消化后，所得DNA 片段的长度分布也是千变万化的。这种酶切片段长度分布的多样性就称为限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism ， RFLP) ，RFLP 常用于生物群体的遗传分析。经典的RFLP 方法是将纯化的DNA 用限制性内切酶消化后，琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色直接显示出酶切片段长度的变化。这种变化是因为核甘酸序列变异导致切点的消失或产生，最后使限制性片段长度发生变化。早期使用RFLP 方法实际上就是限制性核酸内切酶酶切图谱分析法，这种方法后来广泛用于动物线粒体DNA 、植物叶绿体DNA 和病原微生物DNA 多态性的检测。根据DNA 酶切后产生的片段数量和大小分析鉴别DNA 间的相似程度。 RFLP 技术也可以用限制性核酸内切酶酶切消化核酸以及标记的DNA 探针能与任何序列相似的片段杂交，通过片段长度的变异检测多态性，如Southern 杂交。
本实验利用差速离心法从体外培养的动物细胞或新鲜动物肝脏组织提取线粒体。培养细胞可用人HL-7702或HeLa 细胞。每个HeLa 细胞中约含200个线粒体。
实验试剂：
[1]. PBS 溶液：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO 4，2mM KH2PO 4。配制：用800ml
水溶解8g NaCl ，0.2g KCl ，3.22g Na 2HPO 4·12H 2O ，0.24g KH 2PO 4；用HCl 将pH 调至7.4；定容至1000 ml。高压灭菌或过滤除菌，室温保存。
[2]. 1%詹纳斯绿B 染液：用0.9%灭菌的生理盐水配制。
[3]. RSB （低渗缓冲液）：10mM NaCl，2.5mM CaCl2，10mM Tris HCl，pH 7.5
[4]. 2.5×MS 缓冲液：525mM 甘露醇，175mM 蔗糖，12.5mM Tris-HCl，pH 7.5, 2.5 mM
EDTA ，pH 7.5
[5]. 裂解缓冲液：0.15M NaCl，10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0
[6]. 蛋白酶K 溶液（20mg/ml）：20mg 蛋白酶K 溶于1ml 灭菌ddH 2O 中，分装-20℃保存。
该储备液在-20℃可稳定保存一年。
[7]. 20% SDS
[8]. 8M NH4Ac
[9]. TE 缓冲液：10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA
[10]. RNase A：无DNase 的RNase A用TE 缓冲液配制成1mg/ml溶液，沸水浴加热15min ，
冷却后分装，-20℃保存。
[11]. λ DNA/BamHI Marker：16841、7233、6770、6527、5256/5505 bp。
实验步骤：
1、培养细胞中分离线粒体
[1]. 培养细胞，使细胞处于平台期，使活跃分裂的细胞数减少。
[2]. 培养细胞匀浆：0.25%胰蛋白酶消化细胞，PBS 洗涤，1500rpm 离心5~10 min收集细
胞，计数。每次提取需要5 × 107 个细胞。获得1~3ml漂洗后的细胞沉淀。
[3]. 用11ml 冰预冷的RSB 重新悬浮细胞，转移到一个15-ml 的Dounce 匀浆器中。
[4]. 让细胞膨胀5~10min。用相差显微镜监测膨胀过程。
[5]. 用研杵B （小间隙型）研磨几下使膨胀细胞破碎。
[6]. 立即加入8ml 2.5×MS 缓冲液至终浓度为1×MS 。 用封口膜封住匀浆器顶端，倒转
数次使溶液混匀（如果要进行标志酶检测，还要留下部分匀浆）。
[7]. 将匀浆转至离心管中进行差速离心。用少量MS 清洗匀浆器并将清洗液加入匀浆中，
用MS 缓冲液将体积加至30ml 。
[8]. 匀浆在1300g 离心5min 以除去细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。
[9]. 将上清倒在一个干净的离心管中。沉淀上层会比较松，因此要注意不要使其进入上清。
[10]. 重复“沉淀细胞核”步骤两次。
[11]. 将上清转移到一干净离心管中，17000g 离心15min ，沉淀线粒体。
[12]. 抛弃上清，用适合后续工作的缓冲液重悬沉淀。
2、组织中分离线粒体
[1]. 取出肝脏，称量后在培养皿中用刀片切碎，用1×MS 冲洗两次除血。
[2]. 转移到匀浆器中，加入足够的1×MS ，制备1：10的匀浆。
[3]. 冰上充分匀浆。
[4]. 将匀浆转至离心管中，用少量MS 清洗匀浆器并将清洗液加入匀浆中（如果要进行标
志酶检测，还要留下部分匀浆）。
[5].
[6].
[7].
[8]. 匀浆在1300g 离心10min 以除去细胞核、未破碎的细胞、细胞质膜和结缔组织纤维。 将上清倒在一个干净的离心管中，置冰上保存。 用起始体积一半的1×MS 重悬沉淀，1300g 离心10min 。 取出上清并加到第6步的上清中。
[9]. 两次的上清一起1300g 离心10min ，收集上清，再次离心。
[10]. 收集上清，17000g 离心15min 。
[11]. 抛弃上清，用1×MS 重悬沉淀以漂洗线粒体，重复17000g 离心步骤。
[12]. 抛弃上清，用适合后续工作的缓冲液重悬沉淀。
3、线粒体的詹纳斯绿B 染色
方式一：取线粒体沉淀1 滴涂片，滴加1%詹纳斯绿B （Janus Green B）染液染20min ，覆上盖玻片，镜检。
方式二：或将1％Janus green B 溶液按1：1比例加入线粒体悬液中，在室温或水浴中染15~20min，用吸管吸取一滴线粒体悬液，滴于载玻片上，加盖玻片后，放显微镜下进行观察。
Janus green B染色时，线粒体为蓝绿色圆形颗粒。线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
4、线粒体DNA （mtDNA ）提取
[1]. 适当的1×MS 悬浮分离的线粒体。常温下静置15min 。12000rpm 离心8min 。
[2]. 线粒体裂解：线粒体沉淀（50μl ）中加入450μl 裂解缓冲液、2.5μl Proteinase K（终浓
度为100μg/ml）和10μl 20% SDS（终浓度为0.4%）。在37℃水浴2h 以上裂解线粒体。
[3]. 线粒体裂解液冷却至室温后加8M NH 4Ac 使终浓度至0.8M ， 加等体积酚:氯仿:异戊
醇（25:24:1）， 缓慢混匀10min 以上，4℃ 10000g 离心15min 抽提DNA 。
[4]. 取上层水相， 加等体积氯仿, 缓慢混匀10min 以上， 4℃ 10000g 离心15min 。
[5]. 取上层水相， 加1/10体积的8M NH4Ac 和2.5倍体积预冷的无水乙醇，缓慢混合， 放
入-20℃冰箱中2h 到过夜。
[6]. 次日取出后在4℃ 13000g 离心15min 收集DNA 沉淀。
[7]. 用70％的乙醇洗涤沉淀3次， 空气干燥沉淀。
[8]. 用适量TE 缓冲液溶解mtDNA 沉淀。
[9]. mtDNA 溶液中加入Rnase 使其终浓度为200μg/ml，37℃消化3h 。
[10]. mtDNA 溶液-20℃保存备用。
5、mtDNA 样品鉴定
[1]. 紫外分光光度法测定样品经适当稀释，用紫外分光光度计定量。
[2]. 琼脂糖凝胶电泳电泳：用0.7%琼脂糖凝胶电泳，6μl溶解液与2μl上样液混匀后上样，
电泳结果与DNA Marker比较，紫外灯下观察并拍照。mtDNA 样品电泳后，应可见约16 kb的单一mtDNA 条带。
6、线粒体DNA （mtDNA ）的RE 酶切图谱
[1]. EcoRI 和HindIII 单酶完全酶切，反应体积20~30μl， 含线粒体DNA 0.5~1μg， 内切
酶2~4Ｕ，37℃水浴1~3ｈ。
[2]. 反应完毕，加入1/10体积的限制性内切酶反应终止液或者65℃加热10min 终止反应。
用0.7%琼脂糖凝胶电泳分析。
注意事项：
[1]. 全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中。
[2]. 操作速度要尽量的快速。 微量制备比大规模制备操作更方便和快速，因而更容易获
得完整的线粒体。
[3]. 在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。与组织块相比，培
养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。在相差显微镜下检查未裂解细胞应在50%左右即可。过度研磨将破坏线粒体，研磨不足将降低得率；
[4]. 当细胞重悬于至少5~10倍细胞体积的溶液中并且悬液体积至少使匀浆器处于半充满
状态时，匀浆效果最好。推匀浆器研杵时要垂直向下，保持稳、有力的压力。Dounce 匀浆器通过压力变化使细胞破裂。研杵向下推进的过程中，细胞周围的压力增加；当细胞从研杵末端滑过时，压力的突然降低使细胞破裂。如果研杵与匀浆器之间非常紧密，也会有一部分机械破碎因素。
[5]. 匀浆组织时，电动玻璃匀浆器的匀浆次数很关键。匀浆器在1500rpm 的条件下，应清
楚上下匀浆的次数，匀浆次数过少时线粒体游离的量少， 影响提取量； 而匀浆次数过多时核膜破裂， 增加了核DNA 污染。为了弄清楚上下匀浆的次数， 可先匀浆5~6次，取样；再匀浆5~6次， 取样；依次增加匀浆次数再分别取样。最后把所取的样品用詹纳斯绿B 染色后分别在显微镜下镜检，以游离线粒体较多、 细胞核未破裂、 完整细胞少为最好，以后匀浆的次数以此为标准。
[6]. 用相差显微镜检查匀浆程度。应该能看到裸露的细胞核（内部有明显核仁的光滑球
体），小的细胞器（黑色颗粒状物）和少量的未破碎的细胞（大的颗粒状球体）。如果裸露细胞核占总细胞数80%~90%，说明效果很好。如果想再提高这一百分比，通常会导致损坏的细胞核数量上升，从而在第一步离心时，使更多的线粒体混进核物质沉淀中。
[7]. 因为在低渗缓冲液中操作，所以匀浆时越快越好，如果为了更充分破碎细胞而使推捣
次数超过10~15次，就需要更紧密吻合的匀浆器。
[8]. 差速离心是提取线粒体的关键。在提取线粒体时，去除细胞碎片及杂质的离心力为
1000~1500rpm（500~1000g），离心时间为10~15min；沉淀线粒体的离心力为10000~12000rpm（12000~20000g），离心时间为20~30min。以离心力g 计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。
[9]. 肝脏组织的mtDNA 得率约为5μg/g组织。
[10]. 核DNA 的去除：可用DNase I（终浓度为100μg/ml）37℃消化30min ，以消除粘附在
线粒体外膜的核DNA ，以防核DNA 的干扰。
[11]. 去除RNA 污染：可在mtDNA 初步提取后，用无DNase I 的RNase A （终浓度为
20~40μg/ml），于37℃消化60min ，再抽提掉蛋白质，即可得到纯净的mtDNA 。
人肺癌组织mtDNA 琼脂糖凝胶电泳图谱[中国肺癌杂志
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黄鳝线粒体DNA 的RE 酶切分析：1~2：EcoRI ；3~4：HindIII
[湖北农业科学，2008，47（3）：262-264]