doi:10.3969/j.issn.0253-9608.2013.02.004
玉米粉质胚乳突变体的研究进展
姚东升① 宋任涛②
①博士研究生，②教授，上海大学生命科学学院，上海 200444
关键词 玉米；粉质突变体；储藏物质；优质蛋白玉米
摘要 玉米是世界上重要的粮食作物，也是植物分子遗传研究的重要模式。通过对玉米的长期研究积累了大量的遗传突变体，其中有一类籽粒突变体被称为粉质（opaque 或floury ）胚乳突变体，表现为籽粒硬度和透明度下降。同时，这类突变体中的opaque2等，被发现能够显著改善玉米籽粒的蛋白营养水平，使得粉质胚乳突变体受到了很大的关注。早年只有少数的粉质胚乳突变体基因被克隆和研究，如opaque2和floury2等，被发现与玉米主要的储藏蛋白转录和合成有关。近年来，随着科学技术和研究能力的提高，更多的opaque 突变体基因，如opaque1、
opaque5、opaque7等，被克隆和研究，为我们揭示了玉米籽粒中储藏物质的合成、转运等更深入的调控机制，拓展了我们对玉米胚乳发育和代谢的知识。
玉米是世界上也是中国主要的粮食作物和饲料作物，学名为zea mays L.，英文名maize 或corn ，中文名称较多，旧称玉蜀黍、苞谷等，现通称玉米。玉米是一年生草本植物，起源于中美洲地区。1492年哥伦布在古巴发现玉米，随后将其带回西班牙，逐渐传至世界各地，并成为优势作物。
玉米是目前世界上种植最广泛、产量最高的粮食作物，但是玉米作为粮食作物一直有一个被人们所诟病的缺点：储藏蛋白的质量不高。这主要表现在其中某些必需氨基酸，特别是赖氨酸含量较低，营养价值不高[1]，因此科学家一直致力于寻找提高玉米赖氨酸含量的方法。这个难题在20世纪60年代取得了突破。在对一类具有粉质不透明胚乳的籽粒突变体的研究中，发现其中的opaque2突变体具有高赖氨酸含量，可以直接用于高赖氨酸玉米的育种应用[2]。随后还进一步发现了floury2和opaque7等其他的高赖氨酸粉质胚乳突变体[3-4]。
玉米粉质胚乳突变体是玉米遗传学研究中最早被发现的突变体之一，在20世纪初就有多个被发现(如opaque1和opaque2等) [5]，并在早年
被用于玉米不同染色体的遗传标记。粉质胚乳突
变体的高赖氨酸特性吸引了人们对这类突变体的关注，随后又发现了一系列的粉质胚乳的突变体，同时为了弄清楚它们突变的分子机制，对引起这类突变表型的基因的克隆以及相关功能的研究也逐渐开展起来。最早被克隆的粉质胚乳突变体是著名的opaque2(1987年) [6]，随后是另一个高赖氨酸突变体floury2(1995年) [7]。目前已报道被克隆的经典粉质胚乳突变体基因有8个，分别是opaque1(o1) 、o2、o5、o7、floury1(fl1) 、fl2、Mucronate (Mc ) 和Defective endosperm B30 (De- B30) [8-13]。随着opaque 突变体的研究不断获得突破，我们对玉米籽粒中储藏物代谢调控的认识正在不断加深，利用opaque 基因改善蛋白质品质和控制籽粒性状的遗传机理，培育优质蛋白玉米(quality protein maize，QPM) 的工作也取得显著的成绩[14-15]。
1 玉米粉质胚乳突变体的研究意义
作为生物研究中的模式植物，与其他作物相比，玉米具有以下优点：优异的遗传操作性、长期积累的优越的遗传学资源(包括突变体库、内源
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转座子资源等) 、很高的遗传多样性，以及与近缘禾本科物种良好的基因组共线性(synteny)等。因此，玉米已成为遗传学、细胞学和基因组学研究的模式系统[16]。同时，作为光合作用高效的C4植物，玉米也被列为研究生物产量和质量相关机制生物质能源的模式系统[17]。
作为重要的农作物，玉米的总产量已超过小麦和水稻成为全球第一大粮食作物，同时玉米的全球需求和消耗正在急剧增加。预计到2017年，全球玉米和小麦的年产量需要再增加2亿t 才能满足全世界的需求[18]。随着中国以及世界上一些其他新兴国家饮食结构的调整，对动物产品的需求大幅度增加。作为“饲料之王”的玉米对畜牧业和养殖业的发展具有举足轻重的作用，这就对玉米营养成分的改良提出了更高的要求。
籽粒是玉米主要的储藏器官，是玉米产量的直接决定因素。玉米籽粒是典型的胚乳型种子，成熟籽粒中胚乳占据绝大部分。玉米籽粒是双受精的产物，一部分为三倍体的胚乳，一部分为二倍体的胚。其中胚乳是主要的储藏物积累场所[19]。通常，玉米胚乳含有90%的淀粉和10%的蛋白。这些蛋白中70%的成分是醇溶蛋白(zein)，也称作玉米蛋白。然而，这些含量丰富的醇溶蛋白营养成分却很不平衡，它缺乏一些单胃动物所必需的氨基酸，尤其是赖氨酸；仅含有1.5%～2.0%的赖氨酸，而最佳的人类营养比例是5.0%[1]。而大多数玉米粉质胚乳突变体都有一个共同的特征：赖氨酸的含量显著增加，从而改良了籽粒的蛋白品质[20-23]。其中，
以opaque2突变体最为显著，其赖氨酸含量增加接近2倍[24-26]。研究表明，大多数此类玉米突变体蛋白品质的改善得益于籽粒中非醇溶蛋白与醇溶蛋白的比例的增加。由此可见，这些突变体基因对玉米中的储藏物质有着重要的影响，对这些调控机制的研究无疑会为高营养价值的玉米的培育提供重要的理论基础。
2 粉质胚乳突变体系列及其特征
粉质胚乳突变体是一类能引起玉米胚乳粉质、不透明等性状的突变体(图1) 。这类突变体大部分是自发突变形成的，也有部分是通过人工诱变产生的。这些粉质胚乳突变体是由各自不同的基因控制的，现有研究表明，至少有18种不同的基因的突变能够引起玉米粉质胚乳的表型[15]。这些基因都已经被定位在玉米染色体的相
应
区域，其中8个突变体基因已经被克隆[13](图2) 。
图1 (a)为o7突变体籽粒和正常籽粒横切图；
(b)
为在
光下
透明的正常籽粒和不透明的opaque 突变体籽粒[11]
图2 编码玉米醇溶蛋白的基因和粉质胚乳突变基因在玉米染色体上的位置(红色字体显示的基因已经被克隆到) 。1-10为玉
米染色体编号，染色体上的标注为编码玉米醇溶蛋白的基因和突变基因
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这些突变体大致可以分为三类：隐性突变的opaque 系列(o1、o2、o5、o7、o9-o11、o13-o17) 、半显性的floury 突变体(fl1、fl2、fl3) ，以及显性突变体Mucuronate (Mc ) 和De-B30[15]。
这类粉质胚乳突变体开始引起人们关注的原因在于它们能引起一些有重要营养价值的氨基酸含量的改变。表1是部分突变体蛋白成分和氨基酸含量的数据[25]。研究发现o1、o5、o9、o11、fl2、Mc 和DeB30的总蛋白含量和野生型籽粒基本相同，o2突变体的总蛋白含量则比野生型下降了15%。在醇溶蛋白和非醇溶蛋白的比例上，不同的突变体差别较大。o1和o5的非醇溶蛋白含量与野生型一致，而o2、o11、DeB30和fl2的非醇溶蛋白含量与野生型相比增加了70%。非蛋白氮的含量在o2中增加最多，这与o2中游离氨基酸较高相一致，o1的非蛋白氮含量与野生型相
同，其余大部分突变体的非蛋白氮含量则介于野生型和o2之间。在人类所必需的氨基酸——赖氨酸含量方面，o1与野生型相比基本不变，其余突变体则都是增加了，而增加的幅度可以分为三个层次：o2的赖氨酸含量是野生型的2倍多，o11、DeB30和fl2的赖氨酸含量是野生型的1.8倍，o 5、o 9和Mc 的氨基酸含量是野生型的1.4倍。精氨酸、天冬酰胺/天冬氨酸的含量在每个突变体中增加的幅度与赖氨酸相同。与此相对应的是除o1外，醇溶蛋白中含量最多的氨基酸——谷氨酰胺/谷氨酸、亮氨酸和脯氨酸的含量下降。由这些突变体氨基酸含量上的差异可以看出，控制这些突变体的基因在玉米籽粒储藏物质合成中所参与的调控机制不是单一的，而这也为我们研究储藏物质的调控网络提供了丰富的突变体材料。
表1 W64A+和opaque 突变体胚乳中蛋白和氨基酸含量[25] %
蛋白质/氨基酸
总蛋白 醇溶蛋白 非醇溶蛋白 非蛋白氮 半胱氨酸 天冬酰胺/天冬氨酸
甲硫氨酸 苏氨酸 丝氨酸 谷氨酰胺/谷氨酸
脯氨酸 甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 苯丙氨酸 组氨酸 赖氨酸 精氨酸
野生型 12.1 8.2 2.1 0.6 1.8 6.6 2.7 3.4 5.4 23.2 9.4 2.3 8.3 5.1 3.7 15.0 5.4 2.3 1.5 3.8
o1 12.8 8.5 2.1 0.7 1.8 7.2 2.8 3.5 5.6 22.6 9.0 2.5 8.2 5.2 3.7 14.6 5.5 2.3 1.7 4.0
o2 10.1 2.9 3.6 2.3 2.4 13.2 2.5 3.8 5.2 19.5 7.4 3.8 6.4 5.8 3.5 8.7 4.4 2.9 3.8 6.7
o5 11.5 6.4 2.0 1.5 2.0 7.7 3.0 3.7 5.5 21.6 9.1 2.9 7.9 5.3 3.7 13.6 5.2 2.4 2.1 4.3
o9 12.2 7.3 2.8 1.3 1.8 7.5 2.6 3.5 5.6 22.4 9.0 2.7 8.1 5.2 3.6 13.8 5.2 2.2 2.0 4.7
o11 12.0 6.4 3.4 1.4 1.9 8.6 2.9 3.8 5.3 20.5 8.5 3.2 7.7 5.9 3.8 12.5 5.0 2.5 2.8 5.1
Mc 11.7 7.2 2.7 1.4 1.6 8.0 3.1 3.6 5.5 22.0 8.5 2.6 8.1 5.3 3.8 14.1 5.3 2.2 2.1 4.2
DeB30 12.0 4.5 3.8 1.7 2.0 9.8 3.0 3.9 5.4 20.8 8.3 3.1 7.3 5.7 3.6 11.6 4.9 2.4 2.9 5.3
fl2 11.8 5.9 3.7 0.9 1.9 8.4 3.5 3.8 5.4 20.3 8.0 3.1 7.8 5.5 3.8 12.9 5.3 2.3 2.8 5.2
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3 粉质胚乳系列突变体的基因的克隆和
功能分析
在这些粉质胚乳突变体中，研究得最早、功能最清楚的是o2。1964年普渡大学的Mertz 等发现了o2突变体，该突变体可导致玉米胚乳氨基酸构成和蛋白质组成发生改变，使赖氨酸含量大幅增加[2]。研究表明，o2基因编码的O2蛋白含亮氨酸拉链区，隶属碱性亮氨酸拉链(bZIP)家族，是玉米胚乳中一种重要的转录调控因子[6]。作为转录调控因子，O2蛋白可以同源二聚体或异源二聚体的形式，调控22 kD醇溶蛋白和一些其他基因的表达，包括赖氨酸酮戊二酸酯还原酶(lysine ketoglutarate reductase, LKR)[28-29]。o 2突变体能够降低赖氨酸含量很低的α-醇溶蛋白的合成，同时显著增加非醇溶蛋白的含量，从而极大提高籽粒中赖氨酸和色氨酸的含量。此外，LKR 的功能丧失也能导致游离赖氨酸的积聚[30]。
早期认为，造成显性和半显性粉质胚乳突变的基因是一类影响储藏蛋白的结构基因[15]，一些相关基因的克隆和功能分析也验证了这个推论，如fl2、De-B30、Mc 等。fl2是由于单氨基酸的替换导致22 kDα-醇溶蛋白包含未剪切的信号肽，形成一个24 kD α-醇溶蛋白，堆积在内质网膜上，形成小的、畸形的蛋白体[7,31]。与fl2相似，De-B30是由于单个氨基酸的突变导致19 kDα-醇溶蛋白信号肽不能切除，从而形成小的畸形蛋白体[8]。Mc 突变体是由于16 kDγ-醇溶蛋白cDNA 中38个碱基缺失导致最后63个氨基酸的移码突变，形成了畸形的蛋白体[9]。最新报道的半显性突变体fl1却并不符合这个规律，它编码的是一个蛋白体膜蛋白，通过影响22 kD α-醇溶蛋白在蛋白体中的定位参与蛋白体的形成[10]。
随着技术的发展，特别是玉米全基因组的测序的完成，用于克隆基因的图位克隆和转座子标签等技术有了长足的进步。近两年，有3个重要的隐性突变基因被克隆，分别是o5、o7和o1[11-13]。o5是利用转座子标签法克隆的，o7和o1是用图位克隆的方法克隆的。o5编码一个单半乳糖甘油二酯合成酶，它所合成的半乳糖脂是造粉体和叶绿体行使功能所必需的，o5基因突变对玉米叶
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片、籽粒的胚和胚乳的发育都有广泛的影响。在叶片中，总半乳糖脂的含量没有明显的变化，但是其中C18:3/C18:2 半乳糖脂的含量有所降低进而破坏了叶绿体中的类囊体膜的结构，影响叶绿素的生成，造成叶片的白化。在玉米胚乳中，半乳糖脂的减少会破坏造粉体膜的结构，形成被造粉体膜隔开的分裂的淀粉粒[12]。o7是一种通过降低醇溶蛋白含量而显著提高玉米籽粒赖氨酸含量的经典突变体。它编码的是一个酰基活化酶蛋白，通过细胞核心代谢途径，影响氨基酸的生物合成，从而影响储藏蛋白的合成，特别是19 kD 和22 kD醇溶蛋白，造成储藏蛋白的主要储藏细胞器蛋白体变少变小[11]。o1编码一种植物中特有的肌球蛋白(myosin XI-I) ，这种蛋白通过作用于细胞的内膜系统(主要是内质网) ，控制内膜系统的流动性。在o1中，虽然总的醇溶蛋白的含量不变，但是o1基因功能的丧失降低了内质网的运动能力，并且使内质网膨胀变大，导致蛋白体在装配过程中受到影响，造成蛋白体与野生型相比变小、变多，从而影响到胚乳的质地，形成不透明胚乳[13]。
4 粉质胚乳突变体的突变本质的研究
在一系列粉质胚乳突变体的研究中，人们试图解释造成粉质、不透明胚乳表型的本质原因。从细胞学层面上看，正常的籽粒胚乳透明的玻璃状质地是由细胞内大量淀粉粒被其间的蛋白体等填充物紧密编织在一起形成的，而粉质突变体的胚乳主要由松散的淀粉粒组成，淀粉粒之间的填充物质较少(图3) ；所以一般认为粉质胚乳表型与填充物质不能将淀粉粒紧密编织有关[32]。填充物质主要是蛋白体，而在所有突变体中，除o5外，也都看到了蛋白体在形态上的差异；所以对蛋白体合成的相关研究被认为是解释突变本质的关键[33]。众多的粉质突变体以及近年来开展的针对醇溶蛋白基因的RNAi 转基因研究为我们提供了丰富的材料。目前对蛋白体的形成和功能已经有了一定的认识。蛋白体主要由4种醇溶蛋白(α、β、γ、δ) 在内质网上合成，α和δ醇溶蛋白主要分布在蛋白体的中心区域，β和γ醇溶蛋白则分布在外部区域(图4) 。蛋白体在胚乳成
熟脱水的过程中从破裂的内质网腔中释放出来，与细胞质中的其他物质混合在一起直接与淀粉粒相互作用[33-35]。RNAi 干扰实验表明：α醇溶蛋白合成被抑制后蛋白体形态会发生剧烈的改变，δ醇溶蛋白合成被抑制后几乎不会对蛋白体的形态产生影响，而β和γ醇溶蛋白只有同时被抑制时才会对蛋白体的形成产生较大影响[26,33]。α醇溶蛋白与β、γ醇溶蛋白之间的关系可比喻为“砖”和“水泥”的关系，α醇溶蛋白构成了蛋白体的基质，β、γ醇溶蛋白则将众多蛋白体
凝聚在一起，它们共同发挥作用，最终使其与淀粉粒形成紧密的编织，形成透明胚乳[36-37]。在蛋白体形成的过程中，任何一个步骤发生改变都有可能影响到合成的蛋白体的大小和形态以及其在淀粉粒之间的填充结构。如o2、o7、fl2、De-B30等是合成蛋白体基质的α醇溶蛋白不能正常合成造成的[6-8,11]；fl1是通过改变22 kD α醇溶蛋白在
蛋白体
中的
定位来影响蛋白体的合成[10]；而o1是通过影响内质网的运动能
力进
而
造成附着在它上面的蛋白体的非正常合成[13]。
图3 野生型和o1突变体胚乳边缘区域扫描电镜[13]
图4 (a)为蛋白体结构示意图
[15]
；(b)为透射电镜下的蛋白
体，PB 是蛋白体，ER 是内质网[13]
在粉质胚乳突变体的研究中，往往还会发现一些相似的生理生化特征。首先是许多与生理胁迫相关的基因表达产物如过氧化物和抗菌蛋白
在所有含突变基因的玉米中增加。这种胁迫响应可能会导致突变体的产量和萌发率的相对降低，造成细胞质紊乱而导致不透明籽粒的产生[15]。其次是非折叠蛋白反应(UPR)的激活，它主要反应在内质网分子伴侣蛋白增加过程和蛋白降解途径中[38]。醇溶蛋白缺失的突变基因(如fl2、Mc 、De-B30等) 激活UPR ，有可能是这些多肽加工和折叠错误造成的，也可能是没有正确地与其他蛋白相互作用而造成的。其他一些不透明突变基因的玉米中，UPR 被激活的机理还不是很清楚[15]。最后是许多与分泌蛋白运输相关的转录产物增加，如球蛋白类的贮藏蛋白。但在许多含有突变基因的玉米中增加的贮藏蛋白转录产物类型并不相同。例如，在o5中，a 球蛋白大量增加，而在o2、o11、fl2、Mc 和De-B30中则是编码豆球蛋白的转录产物增加[25]。玉米a 球蛋白序列分析表明它与小麦的嘌呤吲哚蛋白相似[25]，而后者可使胚乳变硬[39]。因此，球蛋白可能影响着粉质胚乳突变玉米中的籽粒质地。胁迫效应，UPR 和球
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蛋白的积累对胚乳粉质、不透明性状的影响尚需进一步研究。
5 粉质突变体基因的应用
在玉米粉质胚乳突变体中，o2通过减少醇溶蛋白的合成、增加其他富含赖氨酸的非醇溶蛋白的含量，从而能提高籽粒中赖氨酸的含量。但是，这种类型的突变会导致玉米籽粒密度低、质地柔软，以及硬度下降等。随之带来一些不利的农艺性状，例如籽粒很脆、易受虫害及不易储藏，产量减低，极大地降低了该类型突变体的商业价 值[40]。于是，玉米育种学家开始寻找能够改变胚乳松软、粉质表型的修饰基因，从而获得必需氨基酸含量增加且物理性质不变的籽粒。研究表明：调控o2的修饰基因的位点有好几个，这些位点都能够有效地改善粉质胚乳突变体的不利农艺性状。南非和国际玉米和小麦改良中心的育种学家，通过将o2修饰基因系统渗入o2突变体种子的方法，最终获得了胚乳坚硬的改良o2突变体，目前QPM 玉米已经被广泛种植[14-15]。运用RNAi 技术抑制醇溶蛋白的基因表达的方法，能使育种更加简单和迅速，以及获得更高的营养品质[41-42]。这些种质创新增加了玉米的商业价值，极大地推动了玉米产业的发展。
6 展望
研究玉米粉质胚乳突变体的目的是为了找到它们突变的本质，解释籽粒胚乳中储藏物质合成、装配、转运的调控机理，最终服务于农业生产。在以往的研究中，虽然部分基因已经被克隆，相关的功能也已经阐明，但是还有许多尚未完全解释清楚的问题，如造成粉质胚乳的本质原因是什么？玉米胚乳细胞中的淀粉粒、蛋白体等储藏物质合成的调控机制还有哪些？虽然从已经研究过的突变体来看，粉质胚乳表型与蛋白体的不正常合成有关，但是在育种中用到的修饰基因能使粉质突变体回复为正常表型的现象[15,41-42]，让这一问题更加复杂，目前还没有一种确切的解释。随着更多的粉质胚乳突变体基因的克隆和功能研究，相信会发现更多不同的储藏物质的调控路径，为我们更好地理解粉质胚乳突变本质，更
110
全面地认识玉米籽粒储藏物质的调控网络提供更多的
线索。
(2013年3月10日收稿) ■
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Research progress of maize opaque endosperm mutants YAO Dong-sheng①, SONG Ren-tao②
①Ph. D., Candidate, ②Professor, School of Life Sciences, Shanghai University, Shanghai 200444, China
[28]
Abstract Maize (Zea mays) is one of the world’s most important food crop and also an important model of plant genetics. The
long history of maize studies was accumulated plenty of genetic mutants. A group of seed mutants with opaque or floury endosperm were called opaque mutants, which usually reduced grain hardness and transparency. Mutants like opaque2 were found to be able to significantly improve the nutritional quality of maize seeds, hence attracted lots of attentions on the study of opaque endosperm mutants. In early years, only few opaque endosperm mutant genes, such as opaque2 and floury2 etc ., were cloned and studied, and their functions were found to be related with the transcription and translation of major storage proteins in maize. In recent years, with the advancement of science and technology, more opaque mutant genes, such as opaque1, opaque5 and opaque7, were cloned and studied, which revealed further mechanisms for storage component synthesis and deposition in maize seeds. These studies expanded our knowledge for the development and metabolism of maize endosperm.
Key words zea mays, opaque mutant, reserve substance, quality protein maize
(编辑：段艳芳)
111
doi:10.3969/j.issn.0253-9608.2013.02.004
玉米粉质胚乳突变体的研究进展
姚东升① 宋任涛②
①博士研究生，②教授，上海大学生命科学学院，上海 200444
关键词 玉米；粉质突变体；储藏物质；优质蛋白玉米
摘要 玉米是世界上重要的粮食作物，也是植物分子遗传研究的重要模式。通过对玉米的长期研究积累了大量的遗传突变体，其中有一类籽粒突变体被称为粉质（opaque 或floury ）胚乳突变体，表现为籽粒硬度和透明度下降。同时，这类突变体中的opaque2等，被发现能够显著改善玉米籽粒的蛋白营养水平，使得粉质胚乳突变体受到了很大的关注。早年只有少数的粉质胚乳突变体基因被克隆和研究，如opaque2和floury2等，被发现与玉米主要的储藏蛋白转录和合成有关。近年来，随着科学技术和研究能力的提高，更多的opaque 突变体基因，如opaque1、
opaque5、opaque7等，被克隆和研究，为我们揭示了玉米籽粒中储藏物质的合成、转运等更深入的调控机制，拓展了我们对玉米胚乳发育和代谢的知识。
玉米是世界上也是中国主要的粮食作物和饲料作物，学名为zea mays L.，英文名maize 或corn ，中文名称较多，旧称玉蜀黍、苞谷等，现通称玉米。玉米是一年生草本植物，起源于中美洲地区。1492年哥伦布在古巴发现玉米，随后将其带回西班牙，逐渐传至世界各地，并成为优势作物。
玉米是目前世界上种植最广泛、产量最高的粮食作物，但是玉米作为粮食作物一直有一个被人们所诟病的缺点：储藏蛋白的质量不高。这主要表现在其中某些必需氨基酸，特别是赖氨酸含量较低，营养价值不高[1]，因此科学家一直致力于寻找提高玉米赖氨酸含量的方法。这个难题在20世纪60年代取得了突破。在对一类具有粉质不透明胚乳的籽粒突变体的研究中，发现其中的opaque2突变体具有高赖氨酸含量，可以直接用于高赖氨酸玉米的育种应用[2]。随后还进一步发现了floury2和opaque7等其他的高赖氨酸粉质胚乳突变体[3-4]。
玉米粉质胚乳突变体是玉米遗传学研究中最早被发现的突变体之一，在20世纪初就有多个被发现(如opaque1和opaque2等) [5]，并在早年
被用于玉米不同染色体的遗传标记。粉质胚乳突
变体的高赖氨酸特性吸引了人们对这类突变体的关注，随后又发现了一系列的粉质胚乳的突变体，同时为了弄清楚它们突变的分子机制，对引起这类突变表型的基因的克隆以及相关功能的研究也逐渐开展起来。最早被克隆的粉质胚乳突变体是著名的opaque2(1987年) [6]，随后是另一个高赖氨酸突变体floury2(1995年) [7]。目前已报道被克隆的经典粉质胚乳突变体基因有8个，分别是opaque1(o1) 、o2、o5、o7、floury1(fl1) 、fl2、Mucronate (Mc ) 和Defective endosperm B30 (De- B30) [8-13]。随着opaque 突变体的研究不断获得突破，我们对玉米籽粒中储藏物代谢调控的认识正在不断加深，利用opaque 基因改善蛋白质品质和控制籽粒性状的遗传机理，培育优质蛋白玉米(quality protein maize，QPM) 的工作也取得显著的成绩[14-15]。
1 玉米粉质胚乳突变体的研究意义
作为生物研究中的模式植物，与其他作物相比，玉米具有以下优点：优异的遗传操作性、长期积累的优越的遗传学资源(包括突变体库、内源
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转座子资源等) 、很高的遗传多样性，以及与近缘禾本科物种良好的基因组共线性(synteny)等。因此，玉米已成为遗传学、细胞学和基因组学研究的模式系统[16]。同时，作为光合作用高效的C4植物，玉米也被列为研究生物产量和质量相关机制生物质能源的模式系统[17]。
作为重要的农作物，玉米的总产量已超过小麦和水稻成为全球第一大粮食作物，同时玉米的全球需求和消耗正在急剧增加。预计到2017年，全球玉米和小麦的年产量需要再增加2亿t 才能满足全世界的需求[18]。随着中国以及世界上一些其他新兴国家饮食结构的调整，对动物产品的需求大幅度增加。作为“饲料之王”的玉米对畜牧业和养殖业的发展具有举足轻重的作用，这就对玉米营养成分的改良提出了更高的要求。
籽粒是玉米主要的储藏器官，是玉米产量的直接决定因素。玉米籽粒是典型的胚乳型种子，成熟籽粒中胚乳占据绝大部分。玉米籽粒是双受精的产物，一部分为三倍体的胚乳，一部分为二倍体的胚。其中胚乳是主要的储藏物积累场所[19]。通常，玉米胚乳含有90%的淀粉和10%的蛋白。这些蛋白中70%的成分是醇溶蛋白(zein)，也称作玉米蛋白。然而，这些含量丰富的醇溶蛋白营养成分却很不平衡，它缺乏一些单胃动物所必需的氨基酸，尤其是赖氨酸；仅含有1.5%～2.0%的赖氨酸，而最佳的人类营养比例是5.0%[1]。而大多数玉米粉质胚乳突变体都有一个共同的特征：赖氨酸的含量显著增加，从而改良了籽粒的蛋白品质[20-23]。其中，
以opaque2突变体最为显著，其赖氨酸含量增加接近2倍[24-26]。研究表明，大多数此类玉米突变体蛋白品质的改善得益于籽粒中非醇溶蛋白与醇溶蛋白的比例的增加。由此可见，这些突变体基因对玉米中的储藏物质有着重要的影响，对这些调控机制的研究无疑会为高营养价值的玉米的培育提供重要的理论基础。
2 粉质胚乳突变体系列及其特征
粉质胚乳突变体是一类能引起玉米胚乳粉质、不透明等性状的突变体(图1) 。这类突变体大部分是自发突变形成的，也有部分是通过人工诱变产生的。这些粉质胚乳突变体是由各自不同的基因控制的，现有研究表明，至少有18种不同的基因的突变能够引起玉米粉质胚乳的表型[15]。这些基因都已经被定位在玉米染色体的相
应
区域，其中8个突变体基因已经被克隆[13](图2) 。
图1 (a)为o7突变体籽粒和正常籽粒横切图；
(b)
为在
光下
透明的正常籽粒和不透明的opaque 突变体籽粒[11]
图2 编码玉米醇溶蛋白的基因和粉质胚乳突变基因在玉米染色体上的位置(红色字体显示的基因已经被克隆到) 。1-10为玉
米染色体编号，染色体上的标注为编码玉米醇溶蛋白的基因和突变基因
106
这些突变体大致可以分为三类：隐性突变的opaque 系列(o1、o2、o5、o7、o9-o11、o13-o17) 、半显性的floury 突变体(fl1、fl2、fl3) ，以及显性突变体Mucuronate (Mc ) 和De-B30[15]。
这类粉质胚乳突变体开始引起人们关注的原因在于它们能引起一些有重要营养价值的氨基酸含量的改变。表1是部分突变体蛋白成分和氨基酸含量的数据[25]。研究发现o1、o5、o9、o11、fl2、Mc 和DeB30的总蛋白含量和野生型籽粒基本相同，o2突变体的总蛋白含量则比野生型下降了15%。在醇溶蛋白和非醇溶蛋白的比例上，不同的突变体差别较大。o1和o5的非醇溶蛋白含量与野生型一致，而o2、o11、DeB30和fl2的非醇溶蛋白含量与野生型相比增加了70%。非蛋白氮的含量在o2中增加最多，这与o2中游离氨基酸较高相一致，o1的非蛋白氮含量与野生型相
同，其余大部分突变体的非蛋白氮含量则介于野生型和o2之间。在人类所必需的氨基酸——赖氨酸含量方面，o1与野生型相比基本不变，其余突变体则都是增加了，而增加的幅度可以分为三个层次：o2的赖氨酸含量是野生型的2倍多，o11、DeB30和fl2的赖氨酸含量是野生型的1.8倍，o 5、o 9和Mc 的氨基酸含量是野生型的1.4倍。精氨酸、天冬酰胺/天冬氨酸的含量在每个突变体中增加的幅度与赖氨酸相同。与此相对应的是除o1外，醇溶蛋白中含量最多的氨基酸——谷氨酰胺/谷氨酸、亮氨酸和脯氨酸的含量下降。由这些突变体氨基酸含量上的差异可以看出，控制这些突变体的基因在玉米籽粒储藏物质合成中所参与的调控机制不是单一的，而这也为我们研究储藏物质的调控网络提供了丰富的突变体材料。
表1 W64A+和opaque 突变体胚乳中蛋白和氨基酸含量[25] %
蛋白质/氨基酸
总蛋白 醇溶蛋白 非醇溶蛋白 非蛋白氮 半胱氨酸 天冬酰胺/天冬氨酸
甲硫氨酸 苏氨酸 丝氨酸 谷氨酰胺/谷氨酸
脯氨酸 甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 苯丙氨酸 组氨酸 赖氨酸 精氨酸
野生型 12.1 8.2 2.1 0.6 1.8 6.6 2.7 3.4 5.4 23.2 9.4 2.3 8.3 5.1 3.7 15.0 5.4 2.3 1.5 3.8
o1 12.8 8.5 2.1 0.7 1.8 7.2 2.8 3.5 5.6 22.6 9.0 2.5 8.2 5.2 3.7 14.6 5.5 2.3 1.7 4.0
o2 10.1 2.9 3.6 2.3 2.4 13.2 2.5 3.8 5.2 19.5 7.4 3.8 6.4 5.8 3.5 8.7 4.4 2.9 3.8 6.7
o5 11.5 6.4 2.0 1.5 2.0 7.7 3.0 3.7 5.5 21.6 9.1 2.9 7.9 5.3 3.7 13.6 5.2 2.4 2.1 4.3
o9 12.2 7.3 2.8 1.3 1.8 7.5 2.6 3.5 5.6 22.4 9.0 2.7 8.1 5.2 3.6 13.8 5.2 2.2 2.0 4.7
o11 12.0 6.4 3.4 1.4 1.9 8.6 2.9 3.8 5.3 20.5 8.5 3.2 7.7 5.9 3.8 12.5 5.0 2.5 2.8 5.1
Mc 11.7 7.2 2.7 1.4 1.6 8.0 3.1 3.6 5.5 22.0 8.5 2.6 8.1 5.3 3.8 14.1 5.3 2.2 2.1 4.2
DeB30 12.0 4.5 3.8 1.7 2.0 9.8 3.0 3.9 5.4 20.8 8.3 3.1 7.3 5.7 3.6 11.6 4.9 2.4 2.9 5.3
fl2 11.8 5.9 3.7 0.9 1.9 8.4 3.5 3.8 5.4 20.3 8.0 3.1 7.8 5.5 3.8 12.9 5.3 2.3 2.8 5.2
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3 粉质胚乳系列突变体的基因的克隆和
功能分析
在这些粉质胚乳突变体中，研究得最早、功能最清楚的是o2。1964年普渡大学的Mertz 等发现了o2突变体，该突变体可导致玉米胚乳氨基酸构成和蛋白质组成发生改变，使赖氨酸含量大幅增加[2]。研究表明，o2基因编码的O2蛋白含亮氨酸拉链区，隶属碱性亮氨酸拉链(bZIP)家族，是玉米胚乳中一种重要的转录调控因子[6]。作为转录调控因子，O2蛋白可以同源二聚体或异源二聚体的形式，调控22 kD醇溶蛋白和一些其他基因的表达，包括赖氨酸酮戊二酸酯还原酶(lysine ketoglutarate reductase, LKR)[28-29]。o 2突变体能够降低赖氨酸含量很低的α-醇溶蛋白的合成，同时显著增加非醇溶蛋白的含量，从而极大提高籽粒中赖氨酸和色氨酸的含量。此外，LKR 的功能丧失也能导致游离赖氨酸的积聚[30]。
早期认为，造成显性和半显性粉质胚乳突变的基因是一类影响储藏蛋白的结构基因[15]，一些相关基因的克隆和功能分析也验证了这个推论，如fl2、De-B30、Mc 等。fl2是由于单氨基酸的替换导致22 kDα-醇溶蛋白包含未剪切的信号肽，形成一个24 kD α-醇溶蛋白，堆积在内质网膜上，形成小的、畸形的蛋白体[7,31]。与fl2相似，De-B30是由于单个氨基酸的突变导致19 kDα-醇溶蛋白信号肽不能切除，从而形成小的畸形蛋白体[8]。Mc 突变体是由于16 kDγ-醇溶蛋白cDNA 中38个碱基缺失导致最后63个氨基酸的移码突变，形成了畸形的蛋白体[9]。最新报道的半显性突变体fl1却并不符合这个规律，它编码的是一个蛋白体膜蛋白，通过影响22 kD α-醇溶蛋白在蛋白体中的定位参与蛋白体的形成[10]。
随着技术的发展，特别是玉米全基因组的测序的完成，用于克隆基因的图位克隆和转座子标签等技术有了长足的进步。近两年，有3个重要的隐性突变基因被克隆，分别是o5、o7和o1[11-13]。o5是利用转座子标签法克隆的，o7和o1是用图位克隆的方法克隆的。o5编码一个单半乳糖甘油二酯合成酶，它所合成的半乳糖脂是造粉体和叶绿体行使功能所必需的，o5基因突变对玉米叶
108
片、籽粒的胚和胚乳的发育都有广泛的影响。在叶片中，总半乳糖脂的含量没有明显的变化，但是其中C18:3/C18:2 半乳糖脂的含量有所降低进而破坏了叶绿体中的类囊体膜的结构，影响叶绿素的生成，造成叶片的白化。在玉米胚乳中，半乳糖脂的减少会破坏造粉体膜的结构，形成被造粉体膜隔开的分裂的淀粉粒[12]。o7是一种通过降低醇溶蛋白含量而显著提高玉米籽粒赖氨酸含量的经典突变体。它编码的是一个酰基活化酶蛋白，通过细胞核心代谢途径，影响氨基酸的生物合成，从而影响储藏蛋白的合成，特别是19 kD 和22 kD醇溶蛋白，造成储藏蛋白的主要储藏细胞器蛋白体变少变小[11]。o1编码一种植物中特有的肌球蛋白(myosin XI-I) ，这种蛋白通过作用于细胞的内膜系统(主要是内质网) ，控制内膜系统的流动性。在o1中，虽然总的醇溶蛋白的含量不变，但是o1基因功能的丧失降低了内质网的运动能力，并且使内质网膨胀变大，导致蛋白体在装配过程中受到影响，造成蛋白体与野生型相比变小、变多，从而影响到胚乳的质地，形成不透明胚乳[13]。
4 粉质胚乳突变体的突变本质的研究
在一系列粉质胚乳突变体的研究中，人们试图解释造成粉质、不透明胚乳表型的本质原因。从细胞学层面上看，正常的籽粒胚乳透明的玻璃状质地是由细胞内大量淀粉粒被其间的蛋白体等填充物紧密编织在一起形成的，而粉质突变体的胚乳主要由松散的淀粉粒组成，淀粉粒之间的填充物质较少(图3) ；所以一般认为粉质胚乳表型与填充物质不能将淀粉粒紧密编织有关[32]。填充物质主要是蛋白体，而在所有突变体中，除o5外，也都看到了蛋白体在形态上的差异；所以对蛋白体合成的相关研究被认为是解释突变本质的关键[33]。众多的粉质突变体以及近年来开展的针对醇溶蛋白基因的RNAi 转基因研究为我们提供了丰富的材料。目前对蛋白体的形成和功能已经有了一定的认识。蛋白体主要由4种醇溶蛋白(α、β、γ、δ) 在内质网上合成，α和δ醇溶蛋白主要分布在蛋白体的中心区域，β和γ醇溶蛋白则分布在外部区域(图4) 。蛋白体在胚乳成
熟脱水的过程中从破裂的内质网腔中释放出来，与细胞质中的其他物质混合在一起直接与淀粉粒相互作用[33-35]。RNAi 干扰实验表明：α醇溶蛋白合成被抑制后蛋白体形态会发生剧烈的改变，δ醇溶蛋白合成被抑制后几乎不会对蛋白体的形态产生影响，而β和γ醇溶蛋白只有同时被抑制时才会对蛋白体的形成产生较大影响[26,33]。α醇溶蛋白与β、γ醇溶蛋白之间的关系可比喻为“砖”和“水泥”的关系，α醇溶蛋白构成了蛋白体的基质，β、γ醇溶蛋白则将众多蛋白体
凝聚在一起，它们共同发挥作用，最终使其与淀粉粒形成紧密的编织，形成透明胚乳[36-37]。在蛋白体形成的过程中，任何一个步骤发生改变都有可能影响到合成的蛋白体的大小和形态以及其在淀粉粒之间的填充结构。如o2、o7、fl2、De-B30等是合成蛋白体基质的α醇溶蛋白不能正常合成造成的[6-8,11]；fl1是通过改变22 kD α醇溶蛋白在
蛋白体
中的
定位来影响蛋白体的合成[10]；而o1是通过影响内质网的运动能
力进
而
造成附着在它上面的蛋白体的非正常合成[13]。
图3 野生型和o1突变体胚乳边缘区域扫描电镜[13]
图4 (a)为蛋白体结构示意图
[15]
；(b)为透射电镜下的蛋白
体，PB 是蛋白体，ER 是内质网[13]
在粉质胚乳突变体的研究中，往往还会发现一些相似的生理生化特征。首先是许多与生理胁迫相关的基因表达产物如过氧化物和抗菌蛋白
在所有含突变基因的玉米中增加。这种胁迫响应可能会导致突变体的产量和萌发率的相对降低，造成细胞质紊乱而导致不透明籽粒的产生[15]。其次是非折叠蛋白反应(UPR)的激活，它主要反应在内质网分子伴侣蛋白增加过程和蛋白降解途径中[38]。醇溶蛋白缺失的突变基因(如fl2、Mc 、De-B30等) 激活UPR ，有可能是这些多肽加工和折叠错误造成的，也可能是没有正确地与其他蛋白相互作用而造成的。其他一些不透明突变基因的玉米中，UPR 被激活的机理还不是很清楚[15]。最后是许多与分泌蛋白运输相关的转录产物增加，如球蛋白类的贮藏蛋白。但在许多含有突变基因的玉米中增加的贮藏蛋白转录产物类型并不相同。例如，在o5中，a 球蛋白大量增加，而在o2、o11、fl2、Mc 和De-B30中则是编码豆球蛋白的转录产物增加[25]。玉米a 球蛋白序列分析表明它与小麦的嘌呤吲哚蛋白相似[25]，而后者可使胚乳变硬[39]。因此，球蛋白可能影响着粉质胚乳突变玉米中的籽粒质地。胁迫效应，UPR 和球
109
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蛋白的积累对胚乳粉质、不透明性状的影响尚需进一步研究。
5 粉质突变体基因的应用
在玉米粉质胚乳突变体中，o2通过减少醇溶蛋白的合成、增加其他富含赖氨酸的非醇溶蛋白的含量，从而能提高籽粒中赖氨酸的含量。但是，这种类型的突变会导致玉米籽粒密度低、质地柔软，以及硬度下降等。随之带来一些不利的农艺性状，例如籽粒很脆、易受虫害及不易储藏，产量减低，极大地降低了该类型突变体的商业价 值[40]。于是，玉米育种学家开始寻找能够改变胚乳松软、粉质表型的修饰基因，从而获得必需氨基酸含量增加且物理性质不变的籽粒。研究表明：调控o2的修饰基因的位点有好几个，这些位点都能够有效地改善粉质胚乳突变体的不利农艺性状。南非和国际玉米和小麦改良中心的育种学家，通过将o2修饰基因系统渗入o2突变体种子的方法，最终获得了胚乳坚硬的改良o2突变体，目前QPM 玉米已经被广泛种植[14-15]。运用RNAi 技术抑制醇溶蛋白的基因表达的方法，能使育种更加简单和迅速，以及获得更高的营养品质[41-42]。这些种质创新增加了玉米的商业价值，极大地推动了玉米产业的发展。
6 展望
研究玉米粉质胚乳突变体的目的是为了找到它们突变的本质，解释籽粒胚乳中储藏物质合成、装配、转运的调控机理，最终服务于农业生产。在以往的研究中，虽然部分基因已经被克隆，相关的功能也已经阐明，但是还有许多尚未完全解释清楚的问题，如造成粉质胚乳的本质原因是什么？玉米胚乳细胞中的淀粉粒、蛋白体等储藏物质合成的调控机制还有哪些？虽然从已经研究过的突变体来看，粉质胚乳表型与蛋白体的不正常合成有关，但是在育种中用到的修饰基因能使粉质突变体回复为正常表型的现象[15,41-42]，让这一问题更加复杂，目前还没有一种确切的解释。随着更多的粉质胚乳突变体基因的克隆和功能研究，相信会发现更多不同的储藏物质的调控路径，为我们更好地理解粉质胚乳突变本质，更
110
全面地认识玉米籽粒储藏物质的调控网络提供更多的
线索。
(2013年3月10日收稿) ■
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Research progress of maize opaque endosperm mutants YAO Dong-sheng①, SONG Ren-tao②
①Ph. D., Candidate, ②Professor, School of Life Sciences, Shanghai University, Shanghai 200444, China
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Abstract Maize (Zea mays) is one of the world’s most important food crop and also an important model of plant genetics. The
long history of maize studies was accumulated plenty of genetic mutants. A group of seed mutants with opaque or floury endosperm were called opaque mutants, which usually reduced grain hardness and transparency. Mutants like opaque2 were found to be able to significantly improve the nutritional quality of maize seeds, hence attracted lots of attentions on the study of opaque endosperm mutants. In early years, only few opaque endosperm mutant genes, such as opaque2 and floury2 etc ., were cloned and studied, and their functions were found to be related with the transcription and translation of major storage proteins in maize. In recent years, with the advancement of science and technology, more opaque mutant genes, such as opaque1, opaque5 and opaque7, were cloned and studied, which revealed further mechanisms for storage component synthesis and deposition in maize seeds. These studies expanded our knowledge for the development and metabolism of maize endosperm.
Key words zea mays, opaque mutant, reserve substance, quality protein maize
(编辑：段艳芳)
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