第九章同位素示踪技术

第九章 同位素示踪技术在反刍动物营养研究中的应用

第一节 同位素示踪技术的原理与方法简介

同位素示踪是除能量平衡、物质平衡（C、N）试验及相关的化学分析技术之外的另一类动物营养学的重要研究方法。同位素示踪主要应用于营养物质动态代谢过程的观察，这方面的研究用常规技术无法实现。诸如食糜流通量、营养物质吸收等方面的研究，常规研究手段也可以实现，但应用同位素示踪技术可以提高测定的准确性、减少对动物的外科手术处理、重复利用相同的动物或得到更多的信息。另外，同位素研究还是矿物质代谢研究的重要手段。虽然同位素示踪技术的应用受到对仪器设备条件要求较高的限制，但其独特的优越性已使其得到越来越广泛的应用。

一. 同位素示踪技术的原理

同位素示踪技术在反刍动物营养研究中的用途广泛。如营养物质的消化吸收、食糜的流通量测定、菌体蛋白合成、体组织的合成与分解、器官代谢、矿物质代谢乃至能量代谢和体成分估测等均可应用不同的同位素示踪技术实现。这些同位素示踪技术均利用了同位素原子化学性质相同、物理性质不同的特点，通过示踪原子位置、数量的变化观察物质的代谢。在方法原理上主要有以下三个方面。这些原理的组合运用形成了各种技术方法。 ⒈ 同位素稀释：

如测定某种代谢物在代谢池中的总量，在无法测定代谢池总容量的情况下，向代谢池中注入一定数量的同位素标记代谢物，取得代表性样品后测定同位素富集度（比活度），可以计算出池中代谢物总量。假设使用稳定性同位素标记的代谢物进行示踪。注入代谢物的该同位素富集度（某同位素量/代谢物中该元素总量）为Ei，代谢物注入量为I；代谢池中代谢物中该同位素的富集度为Ec，代谢物总量为M；注入示踪物后代谢池的同位素富集度为Eci。其中Ei、I为已知量，Ec、Eci为可测量，求M。 EciEiIEcM/IM 则：MEiEciI/EciEc

同时测定池中代谢物的浓度C，可以求出代谢池的容积V。 VM/C ⒉ 物质代谢动力学分析：

动物体内代谢池中的代谢物一般处于动态变化之中，向代谢池中注入示踪物，测定池内和流出代谢池的示踪物变化以反映物质的代谢。相关的测定技术及数学计算方法称为动力学分析。代谢动力学分析一般要求代谢池处于恒态或准恒态代谢状态，在反刍动物一般通过连续饲喂和尽可能减少环境对动物的刺激来实现。示踪物的注入方法分一次性注入和恒速连续注入两种，采样方法则分为代谢池内同位素达到稳定后采样和按时间序列采样两种。试验之前，首先需要根据研究目的确定代谢池的数量、之间的关系和各代谢池的含义，即建立房室模型，其次确定示踪物的注入量、注入方法及采样点。试验数据的分析方法的复杂程度随房室数量、示踪物注入方式、采样方式的不同而有很大差别。有关问题将在后续内容讨论。 ⒊ 微量成份代谢：

矿物质元素，尤其是微量元素在饲料及体组织中的含量很小，在样品量较小，化学分析的灵敏度不足的研究中，需要利用放射性测量灵敏度高的特点。 二. 同位素示踪技术的优点和局限性

同位素示踪技术除具有灵敏度高的优点外，应用于动物营养研究的最大优点是可以分别观测代谢物的合成与分解过程，进行动态分析。如利用化学分析方法只能测定血糖的含量，而利用同位素示踪的方法可以测定出血糖产生与消失的速度。其次一些利用传统方法必须进行屠宰测定的研究，利用同位素示踪技术可以在相同的试验动物进行重复试验。同位素示踪技术的局限性主要有以下几个方面：

⒈ 需要经过特殊训练专业人员的协助：

放射性标记物的操作、放射性防护、放射性测量以及稳定性同位素的测量均属专门技术，有关人员需要经过专门的训练。很难要求从事动物营养研究的专业人员同时具备这些方面的专业能力，因此具备同位素示踪研究能力的实验室一般配备专业人员。

⒉ 对设备、设施条件要求较高：

进行放射性操作要求实验室符合安全防护条件。放射性测量及稳定性同位素测量仪器结构复杂、价格较高。在一定程度上限制了同位素示踪技术的应用。 ⒊ 试验费用较高：

放射性、稳定性同位素的价格及样品分析费用较高是造成同位素示踪试验费用较高的主要原因。但同位素标记物的用量较少，同位素示踪的试验费用在一般科研项目的承受范围之内。国内同位素示踪技术应用较少的主要原因是实验室条件不足和对同位素示踪技术的了解不够。 三. 原子核物理的基本概念 ⒈ 原子、原子核、核素：

自然界中的所有物质均是由元素组成的，组成元素的基本单位是原子。原子由原子核和核外电子构成。原子的质量很轻，约为1024～1022g。原子的质量用原子质量单位μ表示，1μ的绝对质量是12C原子质量的十二分之一，即

1.6605651024g。核外电子带负电，每个电子的质量为0.000549μ。原子核由

质子和中子组成，质子带正电，带电量与电子相等，中子不带电。原子核的质子数与核外电子数相等，因此原子呈电中性。质子的质量为1.007276μ，中子的质量为1.008665μ，因此原子的质量主要集中在原子核。质子与中子数的和称为核子数，核子数与质子数决定了原子核的基本特征，通常AZX表示不同元素的原子核，称为核素。其中A为核子数，Z为质子数，X为所属元素的名称。元素在元素周期表中的位置是由核外电子数（亦即质子数）决定的，核子数不同而质子数相同的原子属于同一种元素，由于处于元素周期表的同一位置，习惯上称它们为同位素。

⒉ 放射性同位素、稳定性同位素：

原子核是否稳定完全决定于内在因素。原子核内存在质子之间的静电斥力和核子之间的核力。核力是核子（质子、中子）之间的相互吸引力，与电荷无关，强度为电磁力的103倍，作用距离只有1015cm。作用距离超出这一数量级时，核力很快减小近于零，是一种“短程力”。核力具有饱和性，即一个核子只与附近的几个核子起作用，而不与所有核子起作用。存在核力的任意两个核子之间的核力大小大致相等。质子之间的静电斥力是长程力，斥力的大小与质子间距离的平

方呈反比。原子核的稳定性与核子数和质子与中子的比例有关，不稳定的原子核总是自发地向稳定状态转变，这一过程称为核衰变。发生核衰变时，原子核放射出带电或不带电的粒子，因此核衰变又称为放射性核衰变。不稳定的核素称为放射性核素，稳定的核素称为稳定性核素，相对于其同位素分别称为放射性同位素和稳定性同位素。 ⒊ 放射衰变类型：

放射衰变得类型很多，动物营养研究中常用核素的衰变主要有五种，即α衰变、β衰变、β＋衰变、γ衰变及电子俘获。 3.1 α衰变：

放射性核素放射出α粒子而变成另一种核素的过程称为α衰变。α粒子实际上是氦原子核（4。由一种核素放射出的α粒子的能量是单一的，但伴有γ2He）射线的α衰变核素常常放射出不止一种能量的α粒子。α粒子的能量Ea大都在4－8MeV之间，最大可达10MeV。发生α衰变的天然核素的原子序数一般大于82，人工放射性核素很少有发生α衰变的。 3.2 β衰变：

放射性核素的一个中子转变为一个质子，同时放射出β粒子的过程称为β衰变。β粒子实际上是电子，为了与核外电子区别，也写成β－。β衰变的生成物有三种，比母体核原子序数大1的子体核、β粒子和中微子。核衰变释放出来的能量由三者共同带走，且能量在三者之间的分配方式不固定，因此放射出的β粒子的能量在最大值（接近于衰变能）和最小值（接近于零）间形成连续的能谱。 3.3 β＋衰变：

放射性核素的一个质子变成一个中子并放射出β＋粒子。β＋粒子实质上是正电子，质量、电荷与电子相同，只是带正电。β＋衰变的产物是较母体核原子序数小1的子体核、β＋粒子和中微子。β＋的能量也是一个连续能谱。 3.4 电子俘获（EC）：

不稳定核素俘获一个核外绕行电子，核内的一个质子转变成中子和中微子。电子俘获过程只产生一个中微子，因而具有单一的能量。许多产生电子俘获的放

40射性核素同时也产生β＋衰变，如2211Na；也有一些能同时产生β衰变，如19K；

还有少数核素能同时产生电子俘获、β＋衰变和β衰变。

3.5 γ衰变：

处于激发态的原子核通过放射出γ射线回到基态的衰变方式称为γ衰变。γ射线是一种电磁辐射，不带电荷。γ衰变前后核素的原子序数和核子数不发生变化，仅能量状态不同。原子序数和核子数相同，能量状态不同的核素称为同质异能素。γ射线的能量是不连续的，一个核衰变可能放射出几种不同能量的γ射线。 ⒋ 放射性核衰变的一般规律 4.1 衰变定律：

设放射性原子核的初始数目为N0，经过t时刻后剩余的放射性原子核数目为N，则两者之间符合以下关系：

NN0et„„„ (1)

设初始的放射性强度为A0，t时刻后的放射性强度为A，两者之间存在相同的关系，即：

AA0et„„„ (2)

以上关系称为衰变定律，其中λ是衰变常数。 4.2 半衰期、平均寿命、放射强度单位：

半衰期（T1/2）是指放射性核素的数量减少到初始数量一半所需的时间，此时NN0/2。由（1）式可以推导出：

T1/2ln2/„„„(3)

经过n个半衰期后，放射强度A与初始放射强度A0的关系为：

AA0/2N„„„ (4)

平均寿命（T）是指放射性原子核在衰变前的平均存在时间，由（1）式可以推导出：

T1/„„„ (5)

4.3 放射强度单位：

放射强度是用单位时间内衰变的次数来度量的。1971年第十四届国际计量大会通过的放射强度计量单位是“贝克勒尔”，简写为Bq。1Bq＝1次衰变/秒。由于历史的原因，习惯上还用“居里”（ci）作为放射强度单位。1ci是指1g镭每秒钟的衰变数，即3.71010次。由于居里的单位比较大，常用毫居里（mci）

和微居里（μci），单位大小依次递减1000倍。另外还用衰变数/秒（dps）或衰变数/分（dpm）表示放射强度。

放射强度大小显然与放射性核素的数量和核素的衰变常数λ有关。因此由放射性物质的质量和半衰期可以计算出其放射强度。已知放射性物质的质量m和其原子量M，则放射性核素的数量N为

NmK/M， K为阿佛加德罗常数6.0231023

由（3）式，ln2/T1/2

N/dt（1）式的微分方程为dN/dtN，而d

是单位时间衰变得原子核数，

即放射强度，亦即放射强度AN，因此有：

ANln2/T1/2mK/Mm4.1741022/MT1/2dps„„ (6) 在研究物质代谢的同位素示踪试验中，经常使用比活度（specific activity, SA）的概念。其含义是样品中作为示踪物的放射性同位素原子与被示踪的稳定性同位素原子的数量比。由于放射性同位素的放射强度与与放射性同位素原子数之间是线性关系，且所研究化合物中标记原子数与分子数之间的比例是固定的，因此一般用单位质量标记化合物的放射强度表示其比活度，如dpm/mg等。

表9－1 常用放射性核素半衰期

核素 氢3 碳11 碳14 钠24 硫35 磷32 钾40 钾42 钙45 铁59 钴60 锶89

符号 半衰期

3

放射 强度（μci） 核素 符号 半衰期

90

放射 强度（μci）

H

12.4年 20.5分 5700年 15小时 87.1天 14.3天 1.3×10年 12.4小时 164天 45.1天 5.24年 53天

4

1.173109 8.331014 4.482106 8.7051012 4.2831010 2.8531011

6.88

锶90 碘131 铯134 钡131 铊204 钋210 锰56 铬51 铜64 锌65 钼99 钌103

Sr I

19.9年 8.1天 2.3年 12天 4年

1.997108 1.231011

11

C C

131

14134

Cs Ba Tl

24

Na S P K K

131

8.3041010

35

204

32

210

Po 138.4天

4042

56

Mn 2.8小时

6.0171012 1.7591010

51

Cr

27.7天

45

Ca

64

Cu 12.7小时 Zn 243.8天

59

Fe Co Sr

65

60

1.138109 2.7681010

99

Mo 66.2小时 Ru 39.35天

89103

四. 放射性测量方法

核辐射探测器的种类繁多，从制作原理上大致分为以下几类：

⒈ 利用射线通过物质时产生的电离效应进行探测。包括电离室、正比计数器、G-M计数器、半导体探测器、热释光剂量仪等。

⒉ 利用射线通过物质时激发荧光的效应探测。如闪烁计数器、荧光玻璃剂量仪、契伦科夫计数器等。

⒊ 利用射线作用于物质引起的化学变化探测。如X光底片、核乳胶、胶片剂量仪等。

⒋ 利用射线通过饱和蒸汽或过热液体产生电离，蒸汽或液体在粒子路径上凝结，显示出粒子径迹的方法探测。如云雾室、气泡室等。 ⒌ 利用射线通过物体时产生的热效应探测。

在动物营养研究中常用气体探测器和闪烁探测器。气体探测器是利用射线经过高压电场中气体时引起气体电离，产生电流进行测量。闪烁探测器包括固体闪烁计数器和液体闪烁计数器，均利用射线引起某些物质发出荧光进行测量。其中液体闪烁测量时，放射性样品与闪烁液混合在一起，灵敏度高、样品容量大，特别适合3H、14C等低能β辐射体的测量。 五. 稳定性同位素的测量

一种元素可以有几种不同的稳定性核素，它们的原子序数相同，中子数不同，互称为稳定性同位素。一种稳定性同位素原子数在同位素混合物种所占的比例称为富集度（abundance），用百分数表示。如自然界中1H的富集度是99.985％，表示在自然界中存在的所有氢元素中，99.985％是1H形式的。自然界中某种元素的同位素富集度称为自然富集度（natural abundance）。

表9－2 常用稳定性同位素

元素

稳定性同位素

自然富集度％

氢 碳 氮 氧 硫 硅

1

元素 稳定性同位素 自然富集度％

H H

99.985 0.015 98.89 1.11 99.63 0.37 99.76 0.037 0.204 95.0 0.76 4.22 92.21 4.90 3.09

铁 锌 硒

54

Fe Fe Fe Fe Zn Zn Zn Zn Zn

5.82 91.66 2.19 0.33 48.89 27.81 4.11 18.57 0.62 0.87 9.02 7.58 23.52 49.82 9.19

2

56

12

C C

57

1358

14

N N O O O S S S

64

15

66

16

67

17

68

18

70

3274

Se Se Se Se Se Se

3376

3477

28

Si Si Si

78

2980

3082

稳定性同位素是根据同位素间质量的不同来探测的，相应的分析仪器称为质谱仪。质谱仪的种类很多，大多不是以定量分析为目的设计的。物质代谢的同位素示踪研究中需要对同位素或同位素的比例进行定量测定，使用的测定仪器主要有两种：气相同位素比质谱仪（gas isotope- ratio mass spectrometry, IRMS）

和四极气相色谱－质谱仪（quadrupole gas chromatograph- mass spectrometer, GCMS）。两种仪器均是对同位素的比例进行测定，虽然在测定技术上有明显差别，但基本测定原理相同。样品通过阀门以气体形式引入真空腔（电子发射源），也有以用固体或液体形式引入的，但这种设计一般不用于同位素比例的测定。样品在发射源中被离子化，然后进入质量过滤器（分析器）中。在分析器中，无论样品以何种形式引入发射源，均为气态。有不同形式的分析器，但各种分析器均根据质荷比（m/e）分离各种离子。

分开的离子分别被探测器（detector）收集，在这里离子流打到金属板上脱去电荷，形成可测电流。目前的探测器已达到很高的灵敏度，以至可以探测到单个离子。打到探测器上的离子数与产生信号的幅度直接相关。如质量为44的

12

CO2和质量为45的13CO2可分别形成离子流。测定输出信号的幅度大小，可以

计算出含有两种不同C同位素的CO2比例。

同位素的富集度可由质谱仪测定出的同位素比计算。样品的同位素富集度通常表示为σ。如果测定出的样品同位素比是rsa，参比气体的同位素比是rr，σ由下式计算：

10000/00rsarr/rr„„„ （7）

上式的含义是：样品中的某种同位素的比例相当于向含有1000个该同位素的参比气体中加入σ个同位素原子后达到的比例。

σ用于代谢动力学研究不方便，常用的富集度表示方法是原子百分超 （atom percent atom excess，APE）。APE的定义如下：

APE100%rsarr/rsarr1„„„ (8)

上式的含义是：向元素的同位素混合物中加入一定量的某种同位素，加入的同位素原子数占加入同位素原子数与原同位素混合物中非该同位素的其它同位素原子数之和的百分比。

σ和APE的含义均与放射性同位素示踪中使用的术语比活度（specific activity, SA）不同。SA的含义是放射性标记的示踪分子与被示踪分子的比例，稳定性同位素示踪的富集度与之含义相同的表达是加入示踪物后样品的同位素比与加入示踪物前样品同位素比之差：

标记物/被示踪物（tracer/tracee，R）＝rsa-rbk„„„ （9）

第二节 物质代谢动力学分析

在动物营养研究中，出于不同的研究目的，有时需要测定某种代谢物产生和（或）消失的速度，以及转变为不同产物的比例。如测定瘤胃中VFA的产生与消失速度、体内氨基酸在合成蛋白质与分解之间的分配等。这类问题需要对代谢的动态过程进行观察，通称为物质代谢动力学研究。

根据研究对象的不同，首先建立问题的房室模型。根据房室的数量，模型可分为单室模型和多室模型；根据物质代谢是否处于恒态（产生与消失速度相等，浓度不变），又分为恒态和非恒态模型。最简单的模型是恒态单室模型。如在连续饲喂条件下测定瘤胃中某种VFA的产生、消失速度，测定血液葡萄糖的合成、分解速度等均可采用恒态单室模型。 一．单室模型分析

⒈ 连续注入（constant infusion）示踪物时的恒态单室模型

以测定恒态代谢下瘤胃乙酸的产生速度为例说明连续注入示踪物时恒态单室模型的有关计算问题。为了测定瘤胃乙酸的产量，建立以下模型：

图9－1 测定瘤胃乙酸合成速度的恒态单室模型

M为瘤胃液中乙酸分子总量；V是瘤胃液体积；Ra、Rd分别是乙酸合成和消失

的速度，单位是个分子/min.。定义速度常数k=Rd/M。恒态代谢条件下，Ra=Rd，

M、V可认为不变，此时Ra、Rd用质量/时间单位（如mg/min.、摩尔数/min.），

M用质量单位（如mg）表示不改变k值。而M用浓度单位（如mg/ml）时速度常

数变为k/V。

向瘤胃液中以稳定的速度Ia注入放射性标记的乙酸，如乙酸的产生速度，注入

14

14

C－乙酸。相对于

C－乙酸很小，一般不致影响Ra和k值，可以认为这两

个参数未因注入标记物而改变。经过t时刻的14C－乙酸注入后，瘤胃液中14C－乙酸的分子数量为*Mt，14C－乙酸从瘤胃液中消失的速度为Idt。14C－乙酸与瘤胃中合成乙酸的化学性质、吸收性质相同，具有相同的值k。则Idt与*Mt之间存在以下关系：

Idt=k*Mt„„„ (10)

刚开始注入标记乙酸，Idt

对于注入的标记乙酸 Ia=Id=k*M„„„(11) 对于合成的乙酸 Ra=Rd=kM„„„„„(12)

(11)与(12)式两端分别相除，得：

Ia/Ra=*M/M„„„„„„„„„„„„„(13)

*

M/M是同位素平衡后瘤胃液中注入的标记乙酸与合成乙酸的比例，即比活

度SA。由(13)式，乙酸的合成速度由下式计算：

Ra=Ia/SA„„„„„„„„„„„„„„ (14)

试验中，标记乙酸的注入速度通常以dpm/min.为单位，达到同位素平衡后取数个瘤胃液样品，测定样品的比活度SA样，试验前取瘤胃液样品测定背景的比活度SA背景，（14）式中的SA由SA＝SA样－SA背景得出。样品比活度的测定一般是测定待测样品中乙酸的浓度和一定数量样品的放射强度，计算出每毫克乙酸的

放射强度（dpm/mg）。由此得出的比活度与SA的定义有差别，放射强度与

14

C－

乙酸分子数的数量关系是固定的，因此dpm可视为14C－乙酸分子数的单位，但由浓度与体积成绩得出的测定样品中乙酸的含量包括了

14

C－乙酸，因此实际得

出的应是14C－乙酸与样品中乙酸分子总数的比例P，在14C－乙酸的比例很小的情况下与比活度值的差别可忽略。从以下的推导可以看出，用注入前后样品的P之差计算的SA较之用比活度差计算更接近真实的SA。

对于某一样品，其P值与比活度SA的关系如下：

P=SA/1+SA„„„„„„„„„„„ (15)

设:

注入14C－乙酸之前瘤胃液中乙酸的比活度为SAbk，14C－乙酸在乙酸中的分子数比为Pbk；

达到同位素平衡后瘤胃液中乙酸的比活度和

Psa；

14

C－乙酸的比例分别为SAsa和

注入瘤胃的乙酸的比活度和14C－乙酸的比例分别为SAi和Pi；如注入的乙酸中只有14C－乙酸，则SAi为，Pi为1。

用于分析的样品中含有m个乙酸分子，其中来自注入和瘤胃发酵产生的乙酸分子数分别为mr和ms。可以建立以下方程：

mrmsm mrPimsPbkmPsa

解以上联立方程，求出mr和ms：

mrmPsaPbk/PiPbk msmPiPsa/PiPbk

14

mr中C－乙酸的分子数*mr为：

*

mrmPrimPiPsaPbk/PiPbk

按照（13）中的含义，SA*mr/ms，即：

SAmPiPsaPbk/PiPbk/mPiPsa/PiPbk

PiPsaPbk/PiPsa

PsaPbk/1Psa/Pi

注入乙酸中主要是14C－乙酸，Pi大大高于Psa，因此： SAPsaPbk„„„（16） 按（15）式，P将换为SA：

SASAsa/1SAsaSAbk/1SAbk

将分母中SAsa、SAbk忽略后才有SASAsaSAbk。因此使用（16）式更为准确。

下面给出描述开始注入学公式。

14

C－乙酸后，瘤胃液中乙酸比活度随时间变化的数

图9－2 推导乙酸比活度随时间变化的模型

其中：Ra、Rd为瘤胃中乙酸的合成速度，K为速度常数，M为瘤胃液中合成的乙酸量，

C为瘤胃液中乙酸的浓度，V为瘤胃液的表观体积，*Mt为时刻t瘤胃液中注入的14C－乙

酸量

瘤胃液中14C－乙酸的数量随时间变化的微分方程为：

d*Mt/dtIak*Mt，属一阶非齐线性方程，通式为dy/dxQxPxy，

通解

ye

Pxdx

QxePxdxdxc。微分方程的解为： 

*

Mte

kdt

Iaekdtdtc 

ktIa/kec ekt

当t=0时，*Mt＝0，带入上式得cIa/k。因此：

*

MtIa/k1ekt„„„ (17)

DhD0

由定义：V0D0/Ch0

NV0/1.01Vh/1.04/2

rCO2N/2f3k0kh10.008x/10.059x

SAt*Mt/M，且MCV，代入（17）式得： SAtb1ekt„„„„ (18)；其中bIa/kCV。

⒉ 一次注入（bolus injection）示踪物时的恒态单室模型

仍以瘤胃乙酸产生速度的测定为例，向瘤胃中一次性注入一定量的

14

C－乙

酸，瘤胃液中注入14C－乙酸的存留量*Mt随时间t而减少两者之间的关系为：

d*Mt/dtk*Mt，该微分方程的解为：

ln*Mtktc，当t＝0时，*Mt等于注入的14C－乙酸量*M0，因此有：

ln*Mt－ln*M0＝－kt，变形得：

*

Mt*M0ekt„„„ (19)，

SAt与时间t的关系为： SAt＝SA0 e-kt„„„ (20)，

SA0为零时刻乙酸的比活度，等于*M0/CV。

一次注入总量为*M0的14C－乙酸后，时刻t的14C－乙酸从瘤胃中消失的速度v为：

vk*Mtk*M0ektkCVSA0ekt„„„ (21)

14

C－乙酸瞬间消失的数量d*Mt为：

d*MtvdtkCVSA0ektdt„„„ (22)

经过0～∞的时间后，注入的14C－乙酸全部从瘤胃中消失，即：

*

M0kCVSA0ektdt„„„ (23)



瘤胃中乙酸产生的速度RakCV，代入（23）式并变形得：

RaM0/SA0ektdt„„„ (24)

*



由上述推导，一次注入14C－乙酸时瘤胃乙酸合成速度Ra的测定方法是：在注入后的不同时刻点采集瘤胃液样品，测定乙酸的比活度SAt并记录准确的采样时刻t，得到的两组数据按（20）式进行数据拟和，求出方程中的系数项，按（24）式求出Ra。一次注入方法的采样次数较连续注入多，且需要记录采样时间，Ra的计算方法也较为复杂。但该方法可以得出更多的信息。连续注入方法只能计算出Ra，一次注入方法可以同时计算出V和k。拟和出的（20）式的常数项即是SA0，而SA0*M0/CV，*M0已知，因而可求出CV，测定瘤胃液乙酸浓度C，得到瘤胃液的表观体积V。k值是（20）式中e-kt项的常数，可直接由拟和结果得出。在代谢动力学研究中，观测示踪物的动态变化过程较之在同位素达到平衡后观测可以得到更多关于系统特性的信息，相应的测定方法也较复杂，这在后面系统辨识方法的讨论中可以更清楚地了解到。 ⒊ 非恒态单室模型

1959年Steele用连续注入示踪物的方法测定了注射胰岛素对葡萄糖合成的影响，这是测定非恒态代谢合成速度的第一个试验。Steele按单室模型推导了有关计算公式，并且假定室中葡萄糖是均匀分布的，注入的标记葡萄糖能即刻与室中的葡萄糖混匀，从室中消失的葡萄糖（或标记原子）不再回到代谢室中。前面关于恒态代谢时计算公式的推导实际上也假定了同样的条件，因此Steele推导的公式适合于可用单室模型描述的所有底物代谢动力学的研究。图9－3是理想单室模型及使用符号的含义。其中Gb是室中注入的标记葡萄糖量、Gt是室中的葡萄糖总量、E是室中标记葡萄糖与非标记葡萄糖的比例。

Rd（消失速度） 图9－3 理想单室模型

由定义，Gb＝E×Gt，微分该式即得到室中标记葡萄糖量随时间变化的微分方

程：

dGb/dt＝Et dGt/dt＋Gt dEt/dt„„„ (27)

室中合成葡萄糖量的增减决定于葡萄糖的合成和消失速度： dGt/dt＝Ra－Rd„„„„„„„„„ (28)

室中标记葡萄糖的增减决定于标记葡萄糖的注入速度和消失速度，其消失速度为Rd×E：

dGb/dt＝I－RdEt„„„„„„„„„(29) 将（28）、（29）式代入（27）式： I－RdEt＝Et (Ra－Rd)＋Gt dEt/dt I＝RaEt＋Gt dEt/dt RaEt＝I－Gt dEt/dt

Ra＝(I－Gt dEt/dt)/ Et„„„„„„(30) Rd＝Ra－dGt/dt„„„„„„„„„ (31)

用（30）、（31）式估测Ra、Rd时，在不同的时刻点采样测定Et、葡萄糖浓度Ct，葡萄糖的总量Gt是浓度Ct与分布体积V的成绩。Steele在研究过程中认识到体液中的葡萄糖不是均匀分布的，引入了因子p校正体积V，使用下式建立方程：

Ra＝{F－pV[（C2＋C1）/2][（E2－E1）/(t2－t1)]}/[（E2＋E1）/2]„„„ (32) Rd＝Ra－pV(C2－C1)/ (t2－t1)„„„ (33)

其中C2、C1，E2、E1、t2、t1分别是在时刻t2、t1采得样品的葡萄糖浓度和标记葡萄糖与葡萄糖总量的比。

用单室模型是否能客观地描述真实的代谢情况主要决定于代谢物的分布是否符合理想单室模型的假设。体内水的代谢最接近理想单室模型。仅存在于血清中的底物，如游离脂肪酸（FFA）的代谢也接近理想情况，但研究表明，即使FFA的代谢，由于采样位点和示踪物注入位点的不同，样品富集度也有20－30％的差异。葡萄糖是研究最多的代谢物，多年来一直认为葡萄糖是适宜于用单室模型描述的代谢物。一次注入标记葡萄糖的研究表明，用2或3室模型方程拟和得到的富集度-时间曲线优于用一室模型方程拟和。这表明体液中的葡萄糖是在多个容易混匀的代谢室中分布的。已经证实，血清和组织液中葡萄糖的代谢动态特性

不同，应将其区别为两个不同的代谢室。对于存在于血清和组织液中的代谢物至少应视为存在于两个不同的代谢室中，而对于能由多种组织产生的代谢物，其情况可能更复杂。 二. 多室模型分析 ⒈ 房室个数的确定：

由于单室模型的局限性，对于一些代谢过程需要采用多室模型来描述。室的个数和室与室之间的关系可根据示踪试验数据的拟和结果和对代谢过程的分析确定。一般情况下室的个数与推导出的富集度-时间函数中的幂函数个数相同，因此用含有不同个幂函数的方程拟和示踪试验数据有助于确定室的个数。由代谢过程考虑室的个数主要考虑两个方面，一是室与室之间存在物理间隔，比如血清和组织液被毛细血管壁所分隔，两种体液中的代谢物可以发生交换，但交换的速度与代谢物的性质有关。二是代谢物之间发生相互转变，如研究丙酮酸的代谢时，标记的丙酮酸能很快地转变为标记乳酸，经过不同途径代谢，需要将丙酮酸和乳酸作为不同的代谢室对待。室与室之间根据代谢物的流动方向连接，两个室之间有相互的代谢物流动时用一对逆向的箭头连接，在某个室中有代谢物的不回流消失时用向外的箭头表示。箭头上的kij表示代谢物流动的速度常数，其中i是代谢物流入的室，j是代谢物流出的室，代谢物不回流消失的方向用0表示。图9－4是两个房室模型举例。

k12 k31

k21 k32 k42

01 04

图9－4 房室模型举例

上图的模型称为分支模型，外周的三个室均与中央室连接，相互之间不连接。下图的

模型称为链接模型，各室之间依次连接

⒉ 描述房室模型同位素富集度变化的函数

房室模型确定后，描述注入示踪物后代谢物同位素富集度-时间变化曲线的函数关系随之确定，按函数关系拟和测定出的富集度-

时间值，可以计算出所需的代谢物的动态代谢参数。推导函数关系的一般步骤是：列出富集度随时间变化的微分方程；拉普拉斯变换微分方程为线性代数方程；逆拉普拉斯变换得出微分方程的原函数。如对图9－5的二室模型，原函数的推导过程如下：

f1002

图9－5 二室模型

Mi、Ci、Vi分别代表室中代谢物的数量、浓度和分布体积，标记物的数量

用*Mi表示，富集度用Ei表示，且Ei*Mi/Mi。f10是描述标记物注入的函数，当一次注入Z0剂量的标记物时，用冲量函数描述标记物的注入，即f10＝Z0σ（t），

且t＝0时，σ（t）＝∞，t≠0时σ（t）＝0，并有tdt1；连续注入标





记物时，f10用单位阶跃函数描述，即f10＝Z0[u(t)－u(t－T)]/T，且当t

注入示踪物后，各室内标记物数量Mi(t)随时间变化的微分方程为：

*

M1t/dtk21*M1tk12*M2tf10

M1t/dtk12k02M2tk21*M1t

*

*

一次注入标记物时以上方程组的拉普拉斯变换形式为：

s*M1sk21*M1sk12*M2sZ0

s*M2sk12k02M2sk21*M1s

*

移项后得：

sk21

*

M1sk12*M2sZ0

*

k21*M1ssk12k02M2s0

将*M1s、*M2s视为未知数，其它为常数，用线性代数的方法解以上方程组得：

*

M1sZ0sk12k02/sk21sk12k02k21k12„„„ (34) M2sk21Z0//sk21sk12k02k21k12„„„„„„„„ (35)

*

用待定系数法，令(s＋k21)(s＋k12＋k02)－k21k12＝(s＋α)(s＋β),则有： α＋β＝k21＋k12＋k02„„„ (36) αβ＝k21k12„„„„„„„ (37) 令：

1sA1/sB1/s

„„„ (38)

*M2sA2/sB2/s„„„ (39) 则有：

A1＝Z0(k12＋k02－α)/( β-α)„„„ (40) B1＝Z0(k12＋k02－β)/( α-β)„„„ (41) A2＝Z0k21/( β-α)„„„„„„„„ (42) B2＝Z0k21/(α-β)„„„„„„„„„(43)

形如a/(s＋α)的逆拉普拉斯变换为aet，因此各室中标记物数量随时间变化的原函数为：

*

M1tA1etB1et„„„ (44) M2tA2etB2et„„„ (45)

*

定义室中代谢物的富集度Ei为*Mi/Mi，而MiCiVi，则各室代谢物富集度随时间变化的函数关系为

E1tA1etB1et/C1V1„„„ (46) E2tA2etB2et/C2V2„„„(47)

连续注入示踪物时，f10用单位阶跃函数描述，此时（34）、（35）式中的Z0

变为Z0（1－e－Ts）/Ts，其中T为注入持续的时间。（38）、（39）式相应变为：

*M1sA11eTs/TssB11eTs/Tss

*

M2sA21eTs/TssB21eTs/Tss

变形得：

*

TsM1sA1/T1eTs1/s1/sB1/T1e1/s1/s

„„„ (48)

*

TsM2sA2/T1eTs1/s1/sB2/T1e1/s1/s

„„„ (49)

1/s的逆拉普拉斯变换为1；1/ (s＋a)的逆拉普拉斯变换为eat；e－Ts /s的逆拉普拉斯变换为u(t－T)；e－Ts / (s＋a)的逆拉普拉斯变换为eatTutT，当t

(A1/ Tα)( 1－e－Ts)[1/s－1/ (s＋α)]＝(A1/ Tα)（1/s－1/ (s＋α)－e

－Ts

tTt

1eutTeutT /s＋e－Ts / (s＋



A1/T

当t>T时：

tTt

A1/T1eT 1eutTeutTA1/T

当t≥T时，令ttT：

tTt

A1/T1eTet 1eutTeutTA1/T

(46)、(47)式的其它各项形式相同，因此连续注入示踪物时，各室代谢物富集度随时间变化的函数为：

当t

E1tA1/C1V1T1etB1/C1V1T1et„„„ (50) E2tA2/C2V2T1etB2/C2V2T1et„„„ (51)

当t≥T，亦即停止注入示踪物后：

E1tA1/C1V1T1eTetB1/C1V1T1eTet„„(52) E2tA2/C2V2T1eTetB2/C2V2T1eTet„(53)

在以上二室模型中，如果室一可测而室二不可测，即可以从室一取得样品测定代谢物富集度随时间变化的曲线但不能从室二取得样品。由对室一的测定结果可以估计模型中的各个参数。一次注入示踪物时的估计方法如下：

首先，在注入示踪物后的不同时刻点采样，测定室一的代谢物富集度-时间曲线，对测定结果按（46）式进行数据拟和，由拟和结果估计出A1、B1、α、β。由（36）、（37）、（40）、（41）式可估计出各kij。将（46）式外推至t＝0，此时

E10Z0/C1V1，即C1V1Z0/E10。C2V2只有当室二可测，并向室二注入标记物

时才可估计。连续注入示踪物时，一般在注入示踪物的同时采样，按（52）式拟和测定结果，由拟和结果估计kij。C1V1在将拟和出的A1、B1、α、β代入（46）式后按一次注入标记物的方法估计。

一般地，不同模型代谢物富集度-时间函数的形式与以上二室模型相同，幂函数的个数与模型中室的个数相同，函数式中的系数项是各速度常数、室容量、

注入剂量、注入持续时间的代数表达式。参数是否可以估计与模型及模型中各室的可测情况有关。这种通过测定富集度-时间曲线，按推导出的函数关系拟和测定数据估计参数的方法称为系统辨识。 三. 启动注入(priming the pool）剂量的确定

相对于示踪物连续注入的速度，如果代谢室中底物的数量很大，往往需要持续数小时甚至更长的时间才能达到同位素平衡。时间越长，维持动物安静和生理状态不发生变化的难度越大。因此一般希望能尽快达到同位素的平衡。1954年，Searle首先采用了启动注入与连续注入相结合的方法，即首先向动物体内一次注入一定量的示踪物，使代谢室的SA接近平衡时的SA，接着进行连续注入，缩短了达到同位素平衡所需的时间。之后用这一方法研究了包括乳酸、甘油、脂肪酸、氨基酸、尿素在内的多种物质的代谢，证实启动注入不影响最终同位素平衡的SA。

启动注入的示踪物剂量为*M0，连续注入的速度为Ia，开始注入后时刻t代谢物的比活度为SAt，由（18）和（20）式：

SAtb1ektSA0ekt„„„ (25)，

其中bIa/kCV，SA0*M0/CV；

当t∞时，SAt＝b，即启动注入结合以速度Ia连续注入达到同位素平衡后的SA与单纯以速度Ia连续注入达到同位素平衡后的SA相同。

理想的启动注入剂量是即刻达到同位素平衡，亦即将t＝0代入（25）式得到SAt＝b。t＝0时，e-kt＝1，代入（25）式：

b＝b×（1－1）＋SA0 ×1＝SA0，由b和SA0的含义：

Ia/kCV*M0/CV，变形：

*

M0/Ia1/k„„„ （26）

上式说明理想的启动注入剂量应是：启动注入剂量与连续注入速度的比是代谢物消失速度常数的倒数。注入启动剂量的示踪物后，代谢物的即刻SA是连续注入达到同位素平衡后的SA。启动注入剂量高于或低于理想剂量均能延长到达同位素平衡的时间，一般注入的启动剂量越接近理想剂量、速度常数k越小，启动注入的效果越好。估计理想启动剂量的方法有两种，一是估计代谢物的总量

（CV）和消失速度，由RakCV估计k值；二是通过预试估计。第一种方法虽然不需要试验，但有可能产生较大的误差。原因是在以上的推导中由一次注入的示踪物可以与代谢室中的代谢物即使混匀的假设，这只是理想的情况，实际是不存在的。图9－6是启动注入剂量等于、低于、高于理想剂量时SA随时间变化情况。

0 图9－6不同启动注入情况下的SA曲线

第三节 同位素示踪技术应用举例

本节重点介绍了同位素示踪技术在反刍动物营养研究中几个方面的应用方法。

一. 蛋白质代谢

测定蛋白质合成、分解速度的同位素示踪方法可分为三种。终端产物法是在同位素平衡后测定氨基酸室的周转速度，通过测定氨基酸分解代谢的某种终产物的产生速度确定氨基酸合成到蛋白质中的速度和蛋白质的分解速度，一般用于机体水平蛋白质代谢速度的测定。前体底物法通过测定一段时间内标记氨基酸合成到组织蛋白中引起的富集度变化测定组织蛋白的合成速度，此时得到的合成速度一般用每天合成的蛋白质量占该组织蛋白总量的百分比表示（ %/天），称为蛋白质合成比速度（fractional protein synthesis rate, FSR）。动静脉差法适用于有独立的回流静脉，并可做插管的组织，通过流入和流出组织的标记氨基酸数量差别测定蛋白质的合成速度。3—甲基组胺酸法是利用肌肉蛋白分解代谢产生的3—甲基组胺酸测定肌肉蛋白的分解速度，该方法是一种非同位素示踪方法。

⒈ 终端产物法

根据示踪氨基酸的性质，终端产物法分为非必需氨基酸示踪法和必需氨基酸示踪法。非必需氨基酸示踪法是向体内注入某种15N标记的非必需氨基酸，通常用15N—甘氨酸。由于转氨基作用，由此引入体内的15N对其它氨基酸进行了标记，从而对体液氨基酸的代谢进行示踪，以由尿排除的尿素或氨N作为测定氨基酸分解速度的终产物。必需氨基酸示踪法是向体内引入某种标记的必需氨基酸，标记原子可以是C或N，但必需能够反映该必需氨基酸的代谢情况，用于测定氨基酸分解速度的终产物是标记CO2或尿素（氨N）。 1.1 15N—甘氨酸连续注入方法（终端产物法）：

该方法由Picou和Taylor Roberts于1969年提出，测定条件是同位素平衡和恒态代谢，测定指标是氨基酸的吸收速度和尿中排除尿素（或氨N）的速度及富集度（15N/N）。

（1）原理：该方法的原理见图9—7。

15

图9－7 连续注入N－甘氨酸活体测定蛋白质的合成与分解速度原理

图中C为蛋白质的合成速度(mgN/h)；S为蛋白质的合成速度(mgN/h)；E为由尿排出氨基酸N的速度(mgN/h)，由测定平均每天由尿排出的尿素及氨N数量除24小时得出；I为由消化道吸收氨基酸N的速度(mgN/h)，由每天平均吸收量除24小时得出；F为N－甘氨酸N的注入速度(mgN/h)，为已知量。试验条件是恒态代谢，即测定过程中图中的各速度不变，一般可通过连续饲喂和减少环境刺激使动物接近恒态代谢。

15

恒态代谢时，体液氨基酸N的室容量不变，即有：

C＋I＝S＋E＝Q„„„ (1) 其中Q为蛋白质的周转速度。

连续注入15N—甘氨酸达到同位素平衡后，体液氨基酸N的15N/N比与由尿排出氨基酸N的15N/N比相等，因此可以通过测定尿中尿素或氨N的15N/N比得出体液氨基酸N的15N/N。令R＝15N/N，达到同位素平衡后，15N的注入量等于排出量，即有：

F＝(S＋E)R，即：

Q＝S＋E＝C＋I =F/R，室中E、F、R、I均为已知或可测量，因此蛋白质的合成和分解速度可由下式求出：

S＝F/R－E„„„ (2) C＝F/R－I„„„ (3)

上式的单位为mgN/h，若要转换为蛋白质的mg数，将上式计算结果乘以6.25即可。

（2）方法的假设：在以上推导过程中，暗含以下假设，这些假设与实际情况不完全相符，影响了测定的准确性。

a、严格的恒态代谢，测定过程中体液氨基酸N的室容量不变； b、合成到体蛋白的15N不再分解成氨基酸重新回到体液氨基酸室中； c、同位素的化学性质完全相同；

d、吸收的氨基酸与蛋白质分解产生的氨基酸在代谢上没有差别； e、15N—甘氨酸是有效的示踪物。

试验持续的时间越长，维持恒态代谢的难度越大，室容量有可能发生较大变化。同时随连续注入的延长，再循环15N对结果的影响增加。注入15N—甘氨酸，达到同位素平衡约需30—40小时，缩短平衡时间需要对体液氨基酸和尿素室进行启动注入。N—甘氨酸的注入速度为0.2μmol/kg/min.时，启动注入12μmol/kg的15N—甘氨酸可使体液氨基酸室达到平衡。目前生产的15N标记尿素的两个N原子均被标记，而注入15N—甘氨酸后体内合成的标记尿素只有一个N原子被标记，因此缺少直接启动注入尿素室的标记物。替代的方法是用

15

15

N—甘氨酸

进行间接启动注入，此时15N—甘氨酸的启动计量需达到720μmol/kg，虽可有效地缩短尿素室达到同位素平衡需要的时间，但使用剂量大大超出示踪剂量，注入

的15N—甘氨酸可能影响体液氨基酸的恒态代谢。另外的方法是测定由尿排除氨N的15N/N比，由于氨N的室容量小且周转速度快，达到同位素平衡所需时间少，不需要启动注入。但尿中的氨N主要来自谷氨酰胺的酰胺N，作为反映体液氨基酸N同位素富集度的终端产物不理想。 1.2 标记必需氨基酸连续注入方法：

可利用的标记氨基酸有多种。一些氨基酸在分解代谢过程中产生唯一来源的酮酸，可通过测定这些酮酸的富集度反映细胞内（直接用于蛋白质合成）该氨基酸的富集度，这类必需氨基酸有亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等。另一些必需氨基酸不产生唯一来源的酮酸，只能由血浆中该氨基酸的富集度反映细胞内该氨基酸的富集度。与非必需氨基酸不同的是，必需氨基酸的标记原子必须不能转移到其它氨基酸分子上，具有唯一性。符合这一条件的C、N原子均可。对C原子进行标记时，测定的终产物是CO2，对N原子标记时，测定的终产物是尿素或氨N。 (1) 13C—亮氨酸连续注入：该方法的测定原理见图9－8。

细胞内 血浆

图9－8 连续注入C－亮氨酸测定蛋白质的合成和分解

测定条件为恒态代谢和同位素平衡。图中I为亮氨酸吸收速度，F为C－亮氨酸注入速度，

C为蛋白质分解速度，S为蛋白质合成速度，E为亮氨酸分解速度

13

13

亮氨酸来自吸收和蛋白质的分解，其代谢途径或者用于蛋白质合成，或者氧化分解。亮氨酸分解的第一步是脱氨基产生α－异己酮酸（KIC），亮氨酸脱氨是KIC的唯一来源，因此达到同位素平衡后KIC的富集度即是细胞内亮氨酸的富集度。假设血浆和细胞内亮氨酸的富集度相同，按（2）、（3）式可以计算出蛋白质

的合成和分解速度，此时E由收集呼出的CO2，测定单位时间13CO2的排出数量得出。以蛋白质的数量表示合成与分解速度，计算公式改为：

S＝(F/R－E)/590„„„ (4) C＝(F/R－I)/590„„„ (5)

其中S、C 的单位是g蛋白质/h，F、E、I的单位是μmol亮氨酸/h，每g蛋白质中平均含有590μmol亮氨酸。

亮氨酸的分解速度E由下式计算：

E（μmol/h）=RaC（μmol/h）×RC/Rleu„„„ (6)

其中RaC是二氧化碳的产生速度，RC是二氧化碳的同位素富集度，Rleu是亮氨酸的同位素富集度。

该方法的主要问题是：血浆和细胞内亮氨酸的富集度并不相同，由于亮氨酸是在细胞内代谢的，用细胞内亮氨酸的富集度优于用血浆内亮氨酸的富集度。KIC的唯一来源是亮氨酸的分解代谢，应能反映细胞内亮氨酸的富集度，且KIC可由细胞内排出到血浆内，是可测的。但有研究表明血浆KIC的富集度高于细胞内亮氨酸的富集度。另一个问题是吸收的亮氨酸在肝脏中被代谢，未能与注入的－亮氨酸混合，实际的I值小于由亮氨酸吸收测出的I值。

(2) 连续注入α－15N－赖氨酸或1－13C－赖氨酸：赖氨酸的α氨基极少发生氨基酸间的转氨基作用，而其1位碳原子一旦丢失，剩余残基也不能在合成赖氨酸，因此标记α氨基N或1位碳原子可以示踪赖氨酸的代谢。赖氨酸的分解代谢不产生唯一来源的中间产物，因此只能用血浆赖氨酸的富集度用于计算。计算公式为：

S＝(F/R－E)/544„„„ (7) C＝(F/R－I)/544„„„ (8)

13

13

C

C标记赖氨酸时E的计算公式为：

E（μmol/h）=RaC（μmol/h）×RC/Rly„„„ (9)

15

N标记赖氨酸时E的计算公式为：

E（μmol/h）=Raurea（μmol/h）×2μmol N/μmol 尿素×Rurea/Rly„„„ (10) 其中RaC是二氧化碳的产生速度，RC是二氧化碳的同位素富集度，Rly是赖氨酸的同位素富集度，Raurea是尿素的产生速度，Raurea是尿素的同位素富集度。 ⒉ 前体底物法

前体底物法是通过测定蛋白质合成前体—氨基酸合成到蛋白质中的速度，测定蛋白质的合成速度。根据标记氨基酸的注入数量和方法，又分为启动-连续注入法和大剂量法（Flooding dose）。 2.1启动-连续注入法：

注入启动剂量的标记氨基酸，使蛋白质合成前体氨基酸室迅速达到同位素平衡，通过连续注入维持平衡状态。蛋白质合成比速度FSR按下式计算：

FSREbtEb0/Eptt0„„„ (11)

其中Ebt为开始注入标记氨基酸后时刻t的蛋白质中标记氨基酸的同位素富集度，Eb0为蛋白质中标记氨基酸的背景富集度，Ep为蛋白质合成前体标记氨基酸室的平衡同位素富集度，(t—t0)为从开始注入标记氨基酸到采集组织蛋白样品的时间间隔。

（11）式的推导过程假定在试验期间合成到蛋白质中的标记氨基酸未从蛋白质分子上解离下来，并且前体氨基酸的同位素平衡是即时达到的。设蛋白质中标记氨基酸的比例为P，蛋白质的总量为M，蛋白质合成比速度为FSR，则同位素标记氨基酸合成到蛋白质中的速度为EpFSRMP，经过t时刻后蛋白质中标记氨基酸的同位素富集度增加量为：

EbtEb0EpFSRMPtt0/MP，整理后即得（11）式。

可选择血浆、组织液或氨基酸—tRNA中的标记氨基酸作为前体氨基酸室。以氨基酸—tRNA最为合理，但测定难度较大，因此一般选择血浆或组织液中的标记氨基酸作为前体氨基酸。有试验结果表明，血浆氨基酸的平衡富集度高于组织液中的富集度，而tRNA中的富集度介于两者之间。以血浆氨基酸作为前体时，可在开始注入标记氨基酸后的不同时刻点采集血浆样品，测定富集度-时间曲线下的面积作为（11）式的分母，此时（11）式应写为：

tFSREbtEb0/0Eptdt„„„ (12)

以组织液或AA—tRNA作为前体氨基酸室需要采集组织样品，匀浆后离心分离组织液。多数情况下不能对组织连续活体采样，只能屠宰后采样，FSR的计算按（11）式。

以血浆氨基酸作为前体氨基酸室的优点是可以连续采样，即使不能迅速达到

同位素平衡 (12)式仍然是有效的。由于蛋白质合成是在细胞内进行的，因此细胞内的氨基酸是蛋白质合成的真正前体。一些氨基酸代谢过程产生特有的代谢物，其同位素富集度应与细胞内氨基酸的同位素富集度相同。对于这些氨基酸，可以通过采集血浆样品，测定其代谢物的同位素富集度，实现对细胞内氨基酸富集度在不同时刻点的测定。属于这类情况的氨基酸有：

（1）甘氨酸：安息香酸（benzoic acid）在肝脏中与甘氨酸结合形成马尿酸（hippuric acid），因此可以用马尿酸的同位素富集度作为肝脏中作为蛋白质合成前体的甘氨酸的富集度。

（2）亮氨酸：亮氨酸脱氨基产生α－异己酮酸（KIC），因此可用KIC的富集度作为细胞内亮氨酸的富集度。但血浆中的KIC来自不同的组织，而不同组织中作为蛋白质合成前体的亮氨酸的富集度是不同的。并且有研究表明血浆KIC的富集度高于细胞内亮氨酸的富集度。

（3）精氨酸：由尿素合成途径，瓜氨酸既是精氨酸合成的前体，也是尿素的合成前体，因此尿素C原子的富集度（标记C可由H14CO3引入）或尿素N原子的富集度（标记N原子由15NH3或15N－甘氨酸引入）反映了蛋白质合成前体精氨酸的富集度。

2.2 大剂量注入：

由于启动-连续注入方法在确定蛋白质合成前体氨基酸富集度方面的困难，因此提出了大剂量注入方法。该方法的原理是一次注入大剂量的标记和非标记氨基酸，以至大大超出体内游离氨基酸的总量，使各处氨基酸的富集度相等。注入氨基酸的总量一般超出体内游离氨基酸总量的11倍。如绵羊体内游离苯丙氨酸的浓度约为0.0479mmol/kg体重，标记和非标记苯丙氨酸的注入量应超过0.55mmol/kg活重。试验时，注入标记和非标记氨基酸后，间隔5min。采集血样，共采4－5个样品。之后迅速屠宰动物，采集不同组织的样品迅速在液氮中冷冻，完成注入至采集完最后一个组织样品间的时间间隔越短越好，一般不超过1小时。测定血浆和组织蛋白中的苯丙氨酸富集度，按（11）或（12）式计算FSR。 ⒊ 动静脉差法：

对于有独立的回流静脉并可在回流静脉上安装血管插管的组织器官（如门静脉回流内脏组织、后肢肌肉组织等），可以测定流经该组织器官的血流量和进出

组织器官的氨基酸数量，通过测定进出的标记和非标记氨基酸数量可估测该组织器官的蛋白质合成与分解速度。

设组织器官的血流量为F，动脉中某氨基酸的浓度为CA，静脉中的浓度为CV。经启动和连续注入同位素标记的该氨基酸，血样中的氨基酸迅速达到同位素平衡，只要注入标记氨基酸至采样时间足够短，合成到组织蛋白中的标记氨基酸极少解离下来，可以认为静脉中少于动脉的标记氨基酸被用于了组织蛋白的合成。设动脉中氨基酸的同位素富集度为EA，静脉中的富集度为EV，组织液中的富集度为EM。

氨基酸的动静脉差为： AAT＝（CA－CV）F

同位素标记氨基酸的动静脉差为： AAB＝（CAEA－CVEV）F

氨基酸合成到组织蛋白质中的速度为：

UAAB/EMCAEACVEVF/EM„„„„„(13)

氨基酸的动静脉差应为组织中氨基酸合成到蛋白质中的速度U与由蛋白质解离下来的速度P之差，亦即AAT＝U－P，因此氨基酸由蛋白质中解离下来的速度为：

PUAATAAB/EMCACVF

CAEACVEVFB/EMCACVF„„„ (14)

其中CA、CV、EA、EV可由采得的动静脉血样测定，F可由上下游稀释或电磁血流量计测定，EM可由采得的组织样品测定。在已知某氨基酸在组织蛋白中的含量时，可将U、P换算为蛋白质合成和分解的速度。

动静脉差法的主要问题是，有时动静脉中氨基酸流量的差别很小，甚至在误差范围之内，而且U实际上包括合成到蛋白质中的氨基酸和被氧化分解的氨基酸，若能同时测定氨基酸的氧化产物，则可以得到用于合成到蛋白质中的氨基酸数量。另外对是否有从蛋白质上解离下来的标记氨基酸及其对结果的影响程度不清楚。

⒋ 肌肉蛋白分解速度的活体测定

3－甲基组氨酸（3－MeH）肌原纤维中肌动蛋白、肌球蛋白的部分组胺酸甲酰化的产物。3－MeH不能与tRNA结合，因此不会再合成到蛋白质分子上去。合成之后3－MeH大约有5％转变为N－乙酰－3－MeH，不再发生其它代谢，并全部由尿排出。产生的3－MeH大约91％来自骨骼肌，3.1％来自消化道蛋白，3.3％来自皮肤和结缔组织蛋白。测定由尿排出的3－MeH数量，按下式计算肌肉蛋白的分解速度：

B（mg蛋白/kg体重/天）＝每天、每kg体组织排出的3－MeH(μmole)/3.63 其中3.63是肌肉蛋白中3－MeH的浓度。 二. 测定能量代谢的双标记水方法

通过注入分别对氧或氢原子进行标记的同位素标记水分子测定体内氧化代谢的CO2产量的方法由Lifson于1975年提出。该方法为在正常生活状态下动物能量代谢的研究提供了可能。 ⒈ 基本原理

存在于体内多种组织、尤其是红细胞中的碳酸脱水酶（carbonic anhydrase）催化二氧化碳与水的结合，使二氧化碳与水分子结合的速度高于无催化结合13000倍。该酶的存在加快了二氧化碳与水分子间氧原子的交换，使体内CO2和H2O的氧原子之间可以很快地达到同位素平衡。向体内注入标记氧原子的水分子（如H218O）时，标记氧原子随排出体外的水和二氧化碳排出；而向体内注入标记氢原子的水（如2H2O）时，标记氢原子只随水排出。由注入两种不同标记水测定的水的周转速度差别可以测定出二氧化碳的产生速度。

双标记水方法操作简单、对动物无损伤。该方法只需通过口服给动物注入同位素标记的水，并准确称量动物的体重和每天（或数天）采集一次分析样品。采集的样品可以是血液、尿或唾液。 ⒉ 标记水的注入剂量 2.1 H218O的注入剂量：

H218O的价格较高，应基于减少试验费用和取得有效的试验数据确定H218O的注入剂量。一般最后一次采样距注入标记水的时间应为1.5－2个体内水的半滞留期，且最后样品的原子百分超（AP）应为尿样背景AP的100倍。水的半滞留期可由每天的排尿量和体内水分含量及体重估计，若体重为W、水分约占体重的

60％、每天排尿量为M，则估计的半滞留期为0.6W/2M。

注入H218O后，时刻t采得样品中H218O的浓度可由一室模型计算，即： C（t）＝C（0）e－kt

其中C（t）为时刻t样品中H218O的浓度（亦即18O的富集度），C（0）为注入H218O后水中18O的初始浓度。若H218O的注入剂量为Z0，则C（0）可由Z0/0.6W估计。k值则可由每天排尿量除以体内水分总量，即M/0.6W估计。由C（t）=0.25C(0)估计出最后一次采样的时间，最后一次尿样的富集度一般应高于0.0001gH218O/gH2O。若水在体内的半滞留期为7天，两个半滞留期为14天；k为0.09，H218O的注入剂量估计如下： C（t）＝C（0）e－kt C（0）＝C（t）ekt

CO0.0001e0.09140.000352gH218O/gH2O

注入剂量＝0.000352×0.6×1000＝0.2112g H218O/kg体重 2.2 2H2O的注入剂量：

2

H2O的价格较低，可适当加大用量。用IRMS分析样品富集度时，注入剂量

应在0.3g/kg体重以上；而用红外分光光度法测定富集度时，因其灵敏度较低，注入剂量应达到0.9g/kg以上。 ⒊ 试验方法

唾液、尿及血液均可作为分析样品，但唾液样品中存在2H的轻微分馏现象，因此以采集尿或血液样品较好。同位素标记水可通过口服注入，尤其是单胃动物。反刍动物瘤胃中有大量的水，因此对反刍动物以静脉注入较好。

在Haggarty等以马鹿为试验动物的研究中，动物的平均体重为103±2kg，H218O的注入剂量为0.12g/kg体重，2H2O的注入剂量为0.16g/kg体重。标记水制成生理盐水，通过颈静脉插管注入，体积约60ml。动物饲养在围栏草地内，5只注入标记水，2只作为对照以测定标记动物排出环境中的标记水被动物重新摄入的数量。在试验当天的10：00安装颈静脉插管，采集空白血样（10ml）后，注入标记水。在当天15：00由另一侧颈静脉真空采血管采集血样10ml，之后每天采一次血样。血样制成血清，血清用超滤膜过滤掉大分子后保存待测。 ⒋ 计算方法

4.1 计算方法推导的一般依据

将体内的水视为单室模型，水的排出速度rH2O是速度常数k与室容量的乘积。设水中2H2O的消失速度常数为kh，H218O的消失速度常数为ko，CO2的排出速度为rCO2。由于2H只随水排出体外，而18O随水和二氧化碳排出体外，因此有：

rH2OkhN

rH2O＋2rCO2＝koN 即：

rCO2k0khN/2 4.2 k值的计算

按照一室模型，标记水的富集度（以高于背景的标记水浓度表示）与时间t和速度常数k的关系为：

C(t)＝C(0)e-kt„„„ (15)，取对数得： lnC(t)= lnC(0)－kt„„„ (16)

对于任意两个时刻点t1、t2测得的C(ti)，有: k= [lnC(t1)－lnC(t2)]/(t2－t1)„„„ (17)

k值的计算方法相应有三种，一是测定标记水的富集度随时间变化曲线，按(15)式进行最小二乘数据拟和，二是按(16)式进行最小二乘数据拟和，三是测定两个时刻点的富集度，由（17）式计算。 4.3 方法的假设

(1) 体内的水可看作是一室模型，标记水在其中分布并由此排出； (2) 2H只以水的形式排出体外；

(3) 18O以水和和二氧化碳的形式排出体外，并且水和二氧化碳间的碳原子交换相当迅速；

(4)水和二氧化碳的排出速度稳定；

(5)排出体外的水和二氧化碳与体内水的富集度相同（没有分馏现象）； (6)背景同位素摄入速度稳定。 4.4分馏现象

上述假设中，一般认为（5）是不成立的，分子量较大的水分子蒸发损失的速度较慢，而在水分子中的氧原子转移到二氧化碳分子上时，18O快于16O。因

此蒸发水与液态水、二氧化碳与液态水中的同位素富集度不同，对人的测定得到如下结果：

f1＝0.9412H2O(汽态)/ 2H2O(液态) f2＝0.992H218O(汽态)/ H218O(液态) f3＝1.039C18O2(气态)/ H218O(液态) Lifson提出了考虑分馏现象的计算公式：

rCO2k0khN/2f3f2f1khNx/2f3„„„ (18) 其中x是发生分馏的水的比例，代入fi的数值后得： rCO2Nk0kh10.51x/2.078„„„„„„(19)

在计算过程中考虑分馏现象的影响需要估计x的大小，下面介绍报道过的几种方法。

水的周转量减去同时间内由尿排出水的数量给出了发生分馏的最大可能的水的数量，水的周转量按下式计算：

rH2O1.02khN„„„ (20)

该公式的来源在下面水周转速度计算部分介绍，体内水的总量N由拟和出的（1）式外推到t＝0得出，排尿量可以实测。该方法的问题是过高地估计了发生分馏的水的数量，因为由汗腺分泌和部分唾液中的水不发生分馏。

Schoeller等（1986）用rCO2估计分馏水的数量，损失的分馏水数量为2.3 rCO2，而rCO2约为k0khN/2f3的95％，将2.30.95k0khN/2f3代入（4）式代替发生分馏水的数量khNx得：

tTt

A1/T1eT1eutTeutTA1/T

ttT

rCO2k0khN/2f32.30.95f2f1k0khN/2f3

2

k0khN/2f312.30.95f2f1/2f3 k0khN/2.07812.30.950.0512.078 0.455Nk0kh„„„ (21)

Haggarty等（1998）对马鹿的研究中采用的估计方法是先估计蒸发水的损失，

之后计算蒸发水与水周转量的比例，在下面对Haggarty试验的介绍中将做详细介绍。

4.5 计算rCO2的其它公式

Coward等（1986）提出了与Lifson略有不同的rCO2计算公式：

rCO2N/2f3k0khf2x1x/f1x1x„„„ (22)，代入fi的数值得：

rCO2N/2f3k0kh10.008x/10.059x„„„(23)。 4.6 同位素的分布体积

2H2O和H218O的分布体积不同，H218O的分布体积平均较体内水的总量（TBW）高1％，2H2O则高4％。有两种校正方法，至于哪种方法更好则有不同意见。方法一是计算平均分布体积，若按（21）式计算rCO2，校正后的公式为： rCO20.455N1.01k01.04kh„„„ （24）

拟和出标记水的富集度随时间变化曲线，外推至t＝0求出2H2O和H218O的初始富集度Ch0和C00，按下式计算出标记水的分布体积：

V0D0/C00；VhDh/C00；其中D0、Dh分别为H2O和H2O的注入剂量。

18

2

TBW（即N）按下式计算：

NV0/1.01Vh/1.04/2„„„ (25) 校正方法二是将Vo和Vh直接用于rCO2的计算： rCO20.455NV0k0Vhkh„„„ (26) 4.7 采样期间Vo、Vh发生变化的处理

一般情况下，采样期间Vo、Vh的微小变化可不予考虑，但若用发生肾脏疾病的动物进行试验，或使用利尿剂等，以及研究生长期动物的能量代谢，则需考虑Vo、Vh的变化，此时计算过程中的Vo、Vh值由下式得出： Vo或Vh＝（V1－V2）/ln(V1/V2)„„„ (27)

其中V1、V2是试验开始和结束时的Vo或Vh，为测定V2需在试验结束时再次注入标记水。

4.8 耗能量（产热量，TEE）的计算

若已知动物的每天耗氧量rO2（升/天）、二氧化碳产量rCO2（升/天）和尿氮量（克/天），对于单胃动物可按下式计算TEE：

TEE（KJ/天）＝16.18 rO2＋5.02 rCO2－9.079UN„„„ (28)

对反刍动物还需要知道每天的甲烷产量rCH4（升/天），按下式计算TEE： TEE（KJ/天）＝19.489 rO2＋4.628 rCO2－5.99UN－2.17rCH4.

与呼吸测热不同，双标记水法不能测定耗氧量和甲烷产量，需要通过其它方法估计。对于成年动物，可由消化吸收的饲料成份估计呼吸熵RQ，耗氧量rO2＝rCO2/RQ。若饲料可消化蛋白质、脂肪、碳水化合物的百分含量分别为P、F、C，则RQ可由下式估计：

RQ＝0.81P＋0.71F＋1C„„„ （29）

在人的能量代谢研究中，若摄入酒精，其相应的系数为0.67。

甲烷产量rCH4可由rCO2，在下面对Haggarty试验的介绍中将做详细介绍。 4.9 水周转速度的计算

若不存在分馏现象，水的周转速度可按rH2OkhN计算，但以蒸发方式损失的水分存在分馏现象，考虑这一因素，水的周转速度可按下式计算：

rH2OkhVh1f1khVhx khVh1f1x 代入f1的数值0.94，则：

rH2OkhVh10.06x

Vh1.04N，对于单胃动物，约有30％的损失水发生分馏，则有： rH2O1.02Nkh„„„ (30)

4.10 Haggarty试验中的计算公式 （1）计算公式：

rH2O＝2H flux/(f1x+1-x)－(rH2O甲烷＋rH2O粪便)„„„„„„(31) rCO2＝{ 2O flux－[f2 x rH2O＋(1－x) rH2O]}/2f3„„„„ (32) rCH4＝rCO2×CH4：CO2„„„„„„„„„„„„„„„„ (33) rO2＝(rCO2＋rCO2(甲烷))/RQ－rO2(甲烷)„„„„„„„„„„„(34) TEE＝19.489 rO2＋4.628 rCO2－5.99UN－2.17rCH4„„„„(35)

蒸发水损失（EWL）＝（TEE×蒸发散失热量所占比例PHLE）/蒸发热„„„ (36)

x＝EWL/rH2O„„„ (37)

rH2O甲烷＝rCH4×甲烷的水损失当量„„„ (38)

粪中干物质含量＝(TEE÷饲料干物质的代谢能含量)×（1－消化率）„„„ (39)

rH2O粪便＝粪中干物质含量×粪中干物质的水损失当量„„„ (40)

使用的参数：f1＝0.941；f2＝0.99；f3＝1.039；x＝0.1；RQ＝0.94。（31）、（32）式中的2H flux、2O flux分别为khN和koN。在该试验中N＝Vo/1.01，有关详细说明见Haggarty(1994a，American Journal of Physiology, 267: R1574-－R1588)。

（2）EWL的计算： 18℃下马鹿的产热量约有50％经过蒸发散失（Brockway， 1967），33℃下水的蒸发热是2418J/kg（Blaxter, 1989），用这两个参数和TEE可以计算EWL。但TEE的计算公式中含有rCO2， rCO2的计算公式中又含有x，而x的计算公式中含有EWL。解决这一问题可采用循环计算的方法，首先不对rCO2的计算进行x校正，得到的结果用于EWL的计算，将得到的EWL在用于rCO2的计算，如此循环重复计算，直到重复计算的结果不再变化为止。该试验得到的x是0.42±0.02。rH2O和rCO2等的计算也用到循环计算方法。

（3）粪中干物质含量（FDM）计算： 动物体重基本不变化的情况下，摄入与消耗的能量相等，因此FDM可由产热量、日粮消化率计算。该试验日粮的能量含量为10.22MJ代谢能/kgDM，用绵羊测得的干物质消化率为0.41，FDM的损失水当量为0.12g（Midwood，1993），因此由上述参数和TEE可以计算FDM。但TEE和FDM的计算过程同样存在相互引用的问题，需进行循环计算。

（4）rCH4的计算： 甲烷分子中的H原子部分来自体内水分，因此甲烷是2H损失的途径之一。甲烷的产量可用rCO2估计，rCO2：rCH4在通常日粮条件下的变化范围是10－20，甲烷的损失水当量为1.052g（Midwood，1989）。该试验日粮条件下用绵羊测得的rCO2∶rCH4为13，以此为初始值经过循环计算得到的rCH4为93±5L/d。

（5）尿N损失的计算： 在体重不增加的情况下，尿N损失量等于N的吸收量。由干物质采食量、消化率、日粮的N含量计算。

（6）关于循环计算： 试验过程中只有2H flux和18O flux是可测的，rH2O甲烷、

rH2O粪便、rCO2(甲烷)、rO2(甲烷)、UN的初始值均设置为0，通过整套公式的循环计算得出。关于循环计算的方法见Haggarty发表的文章（1994b，British Journal of Nutrition, 72:799-813）。

三. 糜流通量的同位素双标记物测定

无论瘤胃内容物还是消化道食糜，均由不均匀的固相和液相组成，采集的样品有可能液相或固相偏多，与瘤胃内容物或食糜的真正组成不同，因此测定瘤胃内容物的成份、十二指肠和回肠的食糜流通量及食糜的成份时，最大的问题是如何采集到有代表性的样品。使用十二指肠和回肠过桥瘘管进行全食糜采集在一定程度上解决了样品的代表性问题，但安装过桥瘘管的动物维持时间较短，不能进行持续时间长的试验，而且采集代表性瘤胃内容物的问题没有得到解决。为此，Faichney于1975年提出了双标记物方法测定消化道的食糜流通量，使得食糜流通量的测定可以在安装T型瘘管的动物上进行。1980年他又将该方法推广到瘤胃代表性内容物样品的采集上。 ⒈ 测定原理

1.1 瘤胃代表性内容物样品的采集

通过连续饲喂使瘤胃内容物总量保持不变，以稳定的速度向瘤胃中同时注入两种标记物。两种标记物在固相和液相中有不同的分配比例，在固相中相对较多的标记物称为固相标记物，在液相中相对较多的标记物称为液相标记物。将瘤胃内容物视为一室模型，标记物在瘤胃内容物的浓度与注入时间的关系为：

CtB1ekt，Bf/Mk„„„ (41)

其中C(t)为经过时间t的标记物注入后，标记物在瘤胃内容物中的浓度，f为标记物的注入速度，M为瘤胃内容物的总量，k为标记物从瘤胃消失的速度常数。经过足够长时间的注入之后，瘤胃内容物中标记物的浓度达到稳定，标记物的稳定浓度为：

C(∞)＝B＝f/Mk„„„„„(42)

若两种标记物的注入速度分别为f1、f2，速度常数分别为k1、k2，稳定浓度分别为C1、C2，将Z值定义如下：

Z＝C1/C2＝f1 k2/f2k1„„„ (43)

f1、f2为已知量，求Z的关键是求出k1、k2。先假定已求出Z值，我们采集

的瘤胃内容中两种标记物的浓度之比等于Z时说明采集的样品具有代表性，这样就给出了判断采集样品是否有代表性的标准。

在实际操作中，我们采集的瘤胃内容物一般是没有代表性的，假定所采集瘤胃内容物中两种标记物的浓度分别为CP1、CP2。为了调整所采集瘤胃内容物中标

记物的浓度，可以采用增加或减少瘤胃内容物中液相部分的方法，使调整后瘤胃内容物中两种标记物的浓度比等于Z。为了确定液相部分的增减数量，将一部分采得的瘤胃内容物离心，测定得到液体中的标记物浓度，假定分别为CF1、CF2。如果在总量为x的瘤胃内容物中加入总量为y的液体后，重组的瘤胃内容物中标记物的浓度比为Z，则通过内容物的重组得到了代表性的瘤胃内容物样品（注意：y可以是正值或负值，负值表示需要从瘤胃内容物中减少总量为y的液体）。重组样品的标记物浓度分别为：

C1＝（x CP1＋y CF1）/（x＋y）

C2＝（x CP2＋y CF2）/（x＋y），而且有：

Z＝C1/C2＝（x CP1＋y CF1）/（x CP2＋y CF2）

整理后得：

R＝y/x＝（CP1－Z CP2）/（Z CF2－CF1）„„„(44)

R称为重组因子，含义是从每份瘤胃内容物中增减液体的数量。

重组后样品中的标记物浓度为：

C1＝（CP1＋RCF1）/（1＋R）„„„„„„„„(45)

C2＝（CP2＋R CF2）/（1＋R）„„„„„„„ (46)

至此，我们还有一个关键问题没有解决，即如何求出Z值。由（43）式，只要求出k1、k2即可求出Z值。停止注入标记物，测定标记物在有代表性瘤胃内容

物中的浓度衰减曲线，两种标记物的浓度衰减均符合下式（一室模型衰减方程）：

kit，Bif/Mki„„„ (47) CitBei

其中t是停止注入后的采样时刻。代表性样品中两种标记物的浓度比变化符合以下方程：

ZtB1/B2ek1k2„„„ (48)

在测定标记物浓度衰减曲线时，同样无法得到代表性样品，也就无从通过对

（45）式的数据拟和求出ki。解决的方法有几种，一是测定不同时刻点采集样品

（无代表性）的标记物浓度，按（47）式进行数据拟和，得到的ki值代入（48）

式计算Z(t)，然后由（44）、（45）、（46）式重新计算C(t)，并重新进行数据拟和，通过循环计算逼近真实的Z值（一般经过两次循环计算即可）。方法二是一次投入标记物，用安装十二指肠过桥瘘管的动物测定代表性十二指肠食糜中的浓度衰减。方法三是一次投入标记物，定时采集粪样，将粪样中出现标记物的时刻定位t＝0。方法二、三均需使用不同的动物，拟和公式与（47）的形式相同，此时Bi＝一次投入剂量/M。

1.2 消化道代表性食糜的采集及食糜流通量的测定

测定消化道某一点（通常是十二指肠和回肠安装T型瘘管处）的食糜流通量和在此点采集代表性食糜样品，不存在食糜滞留问题。在标记物浓度达到平衡后，标记物流入该点的速度等于流出的速度，而流入速度等于标记物的注入速度，即有：

fi＝FCi

其中fi为标记物的注入速度，F为该点的食糜流通量，Ci为代表性样品中标

记物的浓度。对于代表性样品，两种标记物按上式计算出的F应相等，因此判断代表性样品的标准是：

f1/C1＝f2/C2，即Z＝C1/C2＝f1/f2

此时Z值可以直接由注入速度求出。重组代表性样品的方法同瘤胃内容物的重组。由重组代表性样品中的标记物浓度，食糜流通量F为：

F＝f1/C1＝f2/C2„„„ (49)

⒉ 试验操作

2.1 标记物：常用固相标记物为钌放射性同位素的邻二氮杂菲络合物（103Ru－phenanthroline，简写为103Ruphe）或镱的放射性同位素169Yb。液相标记物常用51CrEDTA。

2.2 103Ruphe贮备液的制备

⑴ 秤取0.18g KCl，0.25g RuCl3置于250ml圆形烧瓶内，加入5ml蒸馏水溶解。

⑵ 量筒量取36ml 0.2M HCl和40ml乙醇（分析纯）；

⑶ 在有防护设施的实验室中将2mCi的103RuCl3（盐酸溶液）转移到圆形烧瓶中，用量取的HCl冲洗盛103RuCl3的试管，冲洗液转移到烧瓶中。将剩余的0.2M HCl和40ml乙醇转移到烧瓶中。

⑷ 将烧瓶与冷凝器连接，置于沸水浴中回流20min.。

⑸ 取下烧瓶，安装蒸馏装置，将烧瓶与蒸馏装置连接，蒸发烧瓶内的乙醇和部分水分，共计约80ml。该过程约需3－4小时。

⑹ 取下烧瓶，冷却后加盖瓶塞，置于铅板防护的通风厨内静置2天。

⑺ 秤取0.175g 次磷酸钠，溶于2ml水中。秤取0.75g 1,10－邻二氮杂菲备用。 ⑻ 将次磷酸钠溶液和邻二氮杂菲加到烧瓶中，用5M NaOH调整溶液pH值至3－4，回流4小时。回流后的溶液应为橙红色，并有金属Ru的斑点析出。

⑼ 冷却烧瓶，过滤溶液，冲洗滤渣，定容至100ml，铅板防护的通风厨内保存。 ⑽ 操作过程使用的滤纸等固体同位素污染物应在铅制容器内存放数月，使放射强度降至安全水平后再处理。

2.3 51CrEDTA贮备液的制备

⑴ 非标记CrEDTA的制备：秤取14.2gCrCl3.6H2O（含有2.77g Cr），置于烧杯中，用200ml蒸馏水溶解。秤取20g EDTA，用300ml蒸馏水溶解。将两种溶液在圆形烧瓶内混合，沸水浴回流1小时。回流过程中溶液逐渐变为深紫色。

冷却后，用1M CaCl2中和剩余的少量EDTA。1M NaOH调整pH至6－7，定容

至1000ml。2.77g Cr全部与EDTA络合后相当于18.23gCrEDTA。 ⑵ 非标记CrEDTA用于稀释51CrEDTA。稀释后每1mmolCrEDTA中含有1mCi的51CrEDTA。稀释3mCi51CrEDTA需60ml非标记CrEDTA溶液。

2.4 灌注液的制备：灌注液稀释1000倍后测定放射强度。对于绵羊，每天每种标记物的注入剂量约为3106cpm，计算两种的贮备液每天用量，根据注入速度计算每天注入液体总量，将一定量的贮备稀释成灌注液。

2.5 标记物的灌注及采样：动物安装瘤胃、十二指肠、回肠瘘管，自动喂料器饲喂，每小时饲喂一次。蠕动泵连续瘤胃灌注标记物混合溶液，开始灌注前，先启动灌注相当于一天灌注量的两种标记物的贮备溶液。在灌注的第四天开始采集样

品，每天等间隔采集两次，共计约250ml。边搅拌边取一部分样品于离心管中，离心分离样品的液相。取混匀样品及样品的液相各4ml，3个重复测定放射强度。

同位素示踪在脂肪、葡萄糖、矿物质及其它营养物质的代谢研究中均有广泛的应用，在瘤胃微生物蛋白合成研究中也有应用。方法原理大都涉及到室分析、同位素平衡下的周转速度测定等，在此不一一介绍。

(王中华 编著)

参考文献

Wolfe、Robert R，1992, Radioactive and Stable Isotope Tracers in Biomedicine，Principles and Practice of Kinetic Analysis, Wiley-Liss, Inc. Press.

第九章 同位素示踪技术在反刍动物营养研究中的应用

第一节 同位素示踪技术的原理与方法简介

同位素示踪是除能量平衡、物质平衡（C、N）试验及相关的化学分析技术之外的另一类动物营养学的重要研究方法。同位素示踪主要应用于营养物质动态代谢过程的观察，这方面的研究用常规技术无法实现。诸如食糜流通量、营养物质吸收等方面的研究，常规研究手段也可以实现，但应用同位素示踪技术可以提高测定的准确性、减少对动物的外科手术处理、重复利用相同的动物或得到更多的信息。另外，同位素研究还是矿物质代谢研究的重要手段。虽然同位素示踪技术的应用受到对仪器设备条件要求较高的限制，但其独特的优越性已使其得到越来越广泛的应用。

一. 同位素示踪技术的原理

同位素示踪技术在反刍动物营养研究中的用途广泛。如营养物质的消化吸收、食糜的流通量测定、菌体蛋白合成、体组织的合成与分解、器官代谢、矿物质代谢乃至能量代谢和体成分估测等均可应用不同的同位素示踪技术实现。这些同位素示踪技术均利用了同位素原子化学性质相同、物理性质不同的特点，通过示踪原子位置、数量的变化观察物质的代谢。在方法原理上主要有以下三个方面。这些原理的组合运用形成了各种技术方法。 ⒈ 同位素稀释：

如测定某种代谢物在代谢池中的总量，在无法测定代谢池总容量的情况下，向代谢池中注入一定数量的同位素标记代谢物，取得代表性样品后测定同位素富集度（比活度），可以计算出池中代谢物总量。假设使用稳定性同位素标记的代谢物进行示踪。注入代谢物的该同位素富集度（某同位素量/代谢物中该元素总量）为Ei，代谢物注入量为I；代谢池中代谢物中该同位素的富集度为Ec，代谢物总量为M；注入示踪物后代谢池的同位素富集度为Eci。其中Ei、I为已知量，Ec、Eci为可测量，求M。 EciEiIEcM/IM 则：MEiEciI/EciEc

同时测定池中代谢物的浓度C，可以求出代谢池的容积V。 VM/C ⒉ 物质代谢动力学分析：

动物体内代谢池中的代谢物一般处于动态变化之中，向代谢池中注入示踪物，测定池内和流出代谢池的示踪物变化以反映物质的代谢。相关的测定技术及数学计算方法称为动力学分析。代谢动力学分析一般要求代谢池处于恒态或准恒态代谢状态，在反刍动物一般通过连续饲喂和尽可能减少环境对动物的刺激来实现。示踪物的注入方法分一次性注入和恒速连续注入两种，采样方法则分为代谢池内同位素达到稳定后采样和按时间序列采样两种。试验之前，首先需要根据研究目的确定代谢池的数量、之间的关系和各代谢池的含义，即建立房室模型，其次确定示踪物的注入量、注入方法及采样点。试验数据的分析方法的复杂程度随房室数量、示踪物注入方式、采样方式的不同而有很大差别。有关问题将在后续内容讨论。 ⒊ 微量成份代谢：

矿物质元素，尤其是微量元素在饲料及体组织中的含量很小，在样品量较小，化学分析的灵敏度不足的研究中，需要利用放射性测量灵敏度高的特点。 二. 同位素示踪技术的优点和局限性

同位素示踪技术除具有灵敏度高的优点外，应用于动物营养研究的最大优点是可以分别观测代谢物的合成与分解过程，进行动态分析。如利用化学分析方法只能测定血糖的含量，而利用同位素示踪的方法可以测定出血糖产生与消失的速度。其次一些利用传统方法必须进行屠宰测定的研究，利用同位素示踪技术可以在相同的试验动物进行重复试验。同位素示踪技术的局限性主要有以下几个方面：

⒈ 需要经过特殊训练专业人员的协助：

放射性标记物的操作、放射性防护、放射性测量以及稳定性同位素的测量均属专门技术，有关人员需要经过专门的训练。很难要求从事动物营养研究的专业人员同时具备这些方面的专业能力，因此具备同位素示踪研究能力的实验室一般配备专业人员。

⒉ 对设备、设施条件要求较高：

进行放射性操作要求实验室符合安全防护条件。放射性测量及稳定性同位素测量仪器结构复杂、价格较高。在一定程度上限制了同位素示踪技术的应用。 ⒊ 试验费用较高：

放射性、稳定性同位素的价格及样品分析费用较高是造成同位素示踪试验费用较高的主要原因。但同位素标记物的用量较少，同位素示踪的试验费用在一般科研项目的承受范围之内。国内同位素示踪技术应用较少的主要原因是实验室条件不足和对同位素示踪技术的了解不够。 三. 原子核物理的基本概念 ⒈ 原子、原子核、核素：

自然界中的所有物质均是由元素组成的，组成元素的基本单位是原子。原子由原子核和核外电子构成。原子的质量很轻，约为1024～1022g。原子的质量用原子质量单位μ表示，1μ的绝对质量是12C原子质量的十二分之一，即

1.6605651024g。核外电子带负电，每个电子的质量为0.000549μ。原子核由

质子和中子组成，质子带正电，带电量与电子相等，中子不带电。原子核的质子数与核外电子数相等，因此原子呈电中性。质子的质量为1.007276μ，中子的质量为1.008665μ，因此原子的质量主要集中在原子核。质子与中子数的和称为核子数，核子数与质子数决定了原子核的基本特征，通常AZX表示不同元素的原子核，称为核素。其中A为核子数，Z为质子数，X为所属元素的名称。元素在元素周期表中的位置是由核外电子数（亦即质子数）决定的，核子数不同而质子数相同的原子属于同一种元素，由于处于元素周期表的同一位置，习惯上称它们为同位素。

⒉ 放射性同位素、稳定性同位素：

原子核是否稳定完全决定于内在因素。原子核内存在质子之间的静电斥力和核子之间的核力。核力是核子（质子、中子）之间的相互吸引力，与电荷无关，强度为电磁力的103倍，作用距离只有1015cm。作用距离超出这一数量级时，核力很快减小近于零，是一种“短程力”。核力具有饱和性，即一个核子只与附近的几个核子起作用，而不与所有核子起作用。存在核力的任意两个核子之间的核力大小大致相等。质子之间的静电斥力是长程力，斥力的大小与质子间距离的平

方呈反比。原子核的稳定性与核子数和质子与中子的比例有关，不稳定的原子核总是自发地向稳定状态转变，这一过程称为核衰变。发生核衰变时，原子核放射出带电或不带电的粒子，因此核衰变又称为放射性核衰变。不稳定的核素称为放射性核素，稳定的核素称为稳定性核素，相对于其同位素分别称为放射性同位素和稳定性同位素。 ⒊ 放射衰变类型：

放射衰变得类型很多，动物营养研究中常用核素的衰变主要有五种，即α衰变、β衰变、β＋衰变、γ衰变及电子俘获。 3.1 α衰变：

放射性核素放射出α粒子而变成另一种核素的过程称为α衰变。α粒子实际上是氦原子核（4。由一种核素放射出的α粒子的能量是单一的，但伴有γ2He）射线的α衰变核素常常放射出不止一种能量的α粒子。α粒子的能量Ea大都在4－8MeV之间，最大可达10MeV。发生α衰变的天然核素的原子序数一般大于82，人工放射性核素很少有发生α衰变的。 3.2 β衰变：

放射性核素的一个中子转变为一个质子，同时放射出β粒子的过程称为β衰变。β粒子实际上是电子，为了与核外电子区别，也写成β－。β衰变的生成物有三种，比母体核原子序数大1的子体核、β粒子和中微子。核衰变释放出来的能量由三者共同带走，且能量在三者之间的分配方式不固定，因此放射出的β粒子的能量在最大值（接近于衰变能）和最小值（接近于零）间形成连续的能谱。 3.3 β＋衰变：

放射性核素的一个质子变成一个中子并放射出β＋粒子。β＋粒子实质上是正电子，质量、电荷与电子相同，只是带正电。β＋衰变的产物是较母体核原子序数小1的子体核、β＋粒子和中微子。β＋的能量也是一个连续能谱。 3.4 电子俘获（EC）：

不稳定核素俘获一个核外绕行电子，核内的一个质子转变成中子和中微子。电子俘获过程只产生一个中微子，因而具有单一的能量。许多产生电子俘获的放

40射性核素同时也产生β＋衰变，如2211Na；也有一些能同时产生β衰变，如19K；

还有少数核素能同时产生电子俘获、β＋衰变和β衰变。

3.5 γ衰变：

处于激发态的原子核通过放射出γ射线回到基态的衰变方式称为γ衰变。γ射线是一种电磁辐射，不带电荷。γ衰变前后核素的原子序数和核子数不发生变化，仅能量状态不同。原子序数和核子数相同，能量状态不同的核素称为同质异能素。γ射线的能量是不连续的，一个核衰变可能放射出几种不同能量的γ射线。 ⒋ 放射性核衰变的一般规律 4.1 衰变定律：

设放射性原子核的初始数目为N0，经过t时刻后剩余的放射性原子核数目为N，则两者之间符合以下关系：

NN0et„„„ (1)

设初始的放射性强度为A0，t时刻后的放射性强度为A，两者之间存在相同的关系，即：

AA0et„„„ (2)

以上关系称为衰变定律，其中λ是衰变常数。 4.2 半衰期、平均寿命、放射强度单位：

半衰期（T1/2）是指放射性核素的数量减少到初始数量一半所需的时间，此时NN0/2。由（1）式可以推导出：

T1/2ln2/„„„(3)

经过n个半衰期后，放射强度A与初始放射强度A0的关系为：

AA0/2N„„„ (4)

平均寿命（T）是指放射性原子核在衰变前的平均存在时间，由（1）式可以推导出：

T1/„„„ (5)

4.3 放射强度单位：

放射强度是用单位时间内衰变的次数来度量的。1971年第十四届国际计量大会通过的放射强度计量单位是“贝克勒尔”，简写为Bq。1Bq＝1次衰变/秒。由于历史的原因，习惯上还用“居里”（ci）作为放射强度单位。1ci是指1g镭每秒钟的衰变数，即3.71010次。由于居里的单位比较大，常用毫居里（mci）

和微居里（μci），单位大小依次递减1000倍。另外还用衰变数/秒（dps）或衰变数/分（dpm）表示放射强度。

放射强度大小显然与放射性核素的数量和核素的衰变常数λ有关。因此由放射性物质的质量和半衰期可以计算出其放射强度。已知放射性物质的质量m和其原子量M，则放射性核素的数量N为

NmK/M， K为阿佛加德罗常数6.0231023

由（3）式，ln2/T1/2

N/dt（1）式的微分方程为dN/dtN，而d

是单位时间衰变得原子核数，

即放射强度，亦即放射强度AN，因此有：

ANln2/T1/2mK/Mm4.1741022/MT1/2dps„„ (6) 在研究物质代谢的同位素示踪试验中，经常使用比活度（specific activity, SA）的概念。其含义是样品中作为示踪物的放射性同位素原子与被示踪的稳定性同位素原子的数量比。由于放射性同位素的放射强度与与放射性同位素原子数之间是线性关系，且所研究化合物中标记原子数与分子数之间的比例是固定的，因此一般用单位质量标记化合物的放射强度表示其比活度，如dpm/mg等。

表9－1 常用放射性核素半衰期

核素 氢3 碳11 碳14 钠24 硫35 磷32 钾40 钾42 钙45 铁59 钴60 锶89

符号 半衰期

3

放射 强度（μci） 核素 符号 半衰期

90

放射 强度（μci）

H

12.4年 20.5分 5700年 15小时 87.1天 14.3天 1.3×10年 12.4小时 164天 45.1天 5.24年 53天

4

1.173109 8.331014 4.482106 8.7051012 4.2831010 2.8531011

6.88

锶90 碘131 铯134 钡131 铊204 钋210 锰56 铬51 铜64 锌65 钼99 钌103

Sr I

19.9年 8.1天 2.3年 12天 4年

1.997108 1.231011

11

C C

131

14134

Cs Ba Tl

24

Na S P K K

131

8.3041010

35

204

32

210

Po 138.4天

4042

56

Mn 2.8小时

6.0171012 1.7591010

51

Cr

27.7天

45

Ca

64

Cu 12.7小时 Zn 243.8天

59

Fe Co Sr

65

60

1.138109 2.7681010

99

Mo 66.2小时 Ru 39.35天

89103

四. 放射性测量方法

核辐射探测器的种类繁多，从制作原理上大致分为以下几类：

⒈ 利用射线通过物质时产生的电离效应进行探测。包括电离室、正比计数器、G-M计数器、半导体探测器、热释光剂量仪等。

⒉ 利用射线通过物质时激发荧光的效应探测。如闪烁计数器、荧光玻璃剂量仪、契伦科夫计数器等。

⒊ 利用射线作用于物质引起的化学变化探测。如X光底片、核乳胶、胶片剂量仪等。

⒋ 利用射线通过饱和蒸汽或过热液体产生电离，蒸汽或液体在粒子路径上凝结，显示出粒子径迹的方法探测。如云雾室、气泡室等。 ⒌ 利用射线通过物体时产生的热效应探测。

在动物营养研究中常用气体探测器和闪烁探测器。气体探测器是利用射线经过高压电场中气体时引起气体电离，产生电流进行测量。闪烁探测器包括固体闪烁计数器和液体闪烁计数器，均利用射线引起某些物质发出荧光进行测量。其中液体闪烁测量时，放射性样品与闪烁液混合在一起，灵敏度高、样品容量大，特别适合3H、14C等低能β辐射体的测量。 五. 稳定性同位素的测量

一种元素可以有几种不同的稳定性核素，它们的原子序数相同，中子数不同，互称为稳定性同位素。一种稳定性同位素原子数在同位素混合物种所占的比例称为富集度（abundance），用百分数表示。如自然界中1H的富集度是99.985％，表示在自然界中存在的所有氢元素中，99.985％是1H形式的。自然界中某种元素的同位素富集度称为自然富集度（natural abundance）。

表9－2 常用稳定性同位素

元素

稳定性同位素

自然富集度％

氢 碳 氮 氧 硫 硅

1

元素 稳定性同位素 自然富集度％

H H

99.985 0.015 98.89 1.11 99.63 0.37 99.76 0.037 0.204 95.0 0.76 4.22 92.21 4.90 3.09

铁 锌 硒

54

Fe Fe Fe Fe Zn Zn Zn Zn Zn

5.82 91.66 2.19 0.33 48.89 27.81 4.11 18.57 0.62 0.87 9.02 7.58 23.52 49.82 9.19

2

56

12

C C

57

1358

14

N N O O O S S S

64

15

66

16

67

17

68

18

70

3274

Se Se Se Se Se Se

3376

3477

28

Si Si Si

78

2980

3082

稳定性同位素是根据同位素间质量的不同来探测的，相应的分析仪器称为质谱仪。质谱仪的种类很多，大多不是以定量分析为目的设计的。物质代谢的同位素示踪研究中需要对同位素或同位素的比例进行定量测定，使用的测定仪器主要有两种：气相同位素比质谱仪（gas isotope- ratio mass spectrometry, IRMS）

和四极气相色谱－质谱仪（quadrupole gas chromatograph- mass spectrometer, GCMS）。两种仪器均是对同位素的比例进行测定，虽然在测定技术上有明显差别，但基本测定原理相同。样品通过阀门以气体形式引入真空腔（电子发射源），也有以用固体或液体形式引入的，但这种设计一般不用于同位素比例的测定。样品在发射源中被离子化，然后进入质量过滤器（分析器）中。在分析器中，无论样品以何种形式引入发射源，均为气态。有不同形式的分析器，但各种分析器均根据质荷比（m/e）分离各种离子。

分开的离子分别被探测器（detector）收集，在这里离子流打到金属板上脱去电荷，形成可测电流。目前的探测器已达到很高的灵敏度，以至可以探测到单个离子。打到探测器上的离子数与产生信号的幅度直接相关。如质量为44的

12

CO2和质量为45的13CO2可分别形成离子流。测定输出信号的幅度大小，可以

计算出含有两种不同C同位素的CO2比例。

同位素的富集度可由质谱仪测定出的同位素比计算。样品的同位素富集度通常表示为σ。如果测定出的样品同位素比是rsa，参比气体的同位素比是rr，σ由下式计算：

10000/00rsarr/rr„„„ （7）

上式的含义是：样品中的某种同位素的比例相当于向含有1000个该同位素的参比气体中加入σ个同位素原子后达到的比例。

σ用于代谢动力学研究不方便，常用的富集度表示方法是原子百分超 （atom percent atom excess，APE）。APE的定义如下：

APE100%rsarr/rsarr1„„„ (8)

上式的含义是：向元素的同位素混合物中加入一定量的某种同位素，加入的同位素原子数占加入同位素原子数与原同位素混合物中非该同位素的其它同位素原子数之和的百分比。

σ和APE的含义均与放射性同位素示踪中使用的术语比活度（specific activity, SA）不同。SA的含义是放射性标记的示踪分子与被示踪分子的比例，稳定性同位素示踪的富集度与之含义相同的表达是加入示踪物后样品的同位素比与加入示踪物前样品同位素比之差：

标记物/被示踪物（tracer/tracee，R）＝rsa-rbk„„„ （9）

第二节 物质代谢动力学分析

在动物营养研究中，出于不同的研究目的，有时需要测定某种代谢物产生和（或）消失的速度，以及转变为不同产物的比例。如测定瘤胃中VFA的产生与消失速度、体内氨基酸在合成蛋白质与分解之间的分配等。这类问题需要对代谢的动态过程进行观察，通称为物质代谢动力学研究。

根据研究对象的不同，首先建立问题的房室模型。根据房室的数量，模型可分为单室模型和多室模型；根据物质代谢是否处于恒态（产生与消失速度相等，浓度不变），又分为恒态和非恒态模型。最简单的模型是恒态单室模型。如在连续饲喂条件下测定瘤胃中某种VFA的产生、消失速度，测定血液葡萄糖的合成、分解速度等均可采用恒态单室模型。 一．单室模型分析

⒈ 连续注入（constant infusion）示踪物时的恒态单室模型

以测定恒态代谢下瘤胃乙酸的产生速度为例说明连续注入示踪物时恒态单室模型的有关计算问题。为了测定瘤胃乙酸的产量，建立以下模型：

图9－1 测定瘤胃乙酸合成速度的恒态单室模型

M为瘤胃液中乙酸分子总量；V是瘤胃液体积；Ra、Rd分别是乙酸合成和消失

的速度，单位是个分子/min.。定义速度常数k=Rd/M。恒态代谢条件下，Ra=Rd，

M、V可认为不变，此时Ra、Rd用质量/时间单位（如mg/min.、摩尔数/min.），

M用质量单位（如mg）表示不改变k值。而M用浓度单位（如mg/ml）时速度常

数变为k/V。

向瘤胃液中以稳定的速度Ia注入放射性标记的乙酸，如乙酸的产生速度，注入

14

14

C－乙酸。相对于

C－乙酸很小，一般不致影响Ra和k值，可以认为这两

个参数未因注入标记物而改变。经过t时刻的14C－乙酸注入后，瘤胃液中14C－乙酸的分子数量为*Mt，14C－乙酸从瘤胃液中消失的速度为Idt。14C－乙酸与瘤胃中合成乙酸的化学性质、吸收性质相同，具有相同的值k。则Idt与*Mt之间存在以下关系：

Idt=k*Mt„„„ (10)

刚开始注入标记乙酸，Idt

对于注入的标记乙酸 Ia=Id=k*M„„„(11) 对于合成的乙酸 Ra=Rd=kM„„„„„(12)

(11)与(12)式两端分别相除，得：

Ia/Ra=*M/M„„„„„„„„„„„„„(13)

*

M/M是同位素平衡后瘤胃液中注入的标记乙酸与合成乙酸的比例，即比活

度SA。由(13)式，乙酸的合成速度由下式计算：

Ra=Ia/SA„„„„„„„„„„„„„„ (14)

试验中，标记乙酸的注入速度通常以dpm/min.为单位，达到同位素平衡后取数个瘤胃液样品，测定样品的比活度SA样，试验前取瘤胃液样品测定背景的比活度SA背景，（14）式中的SA由SA＝SA样－SA背景得出。样品比活度的测定一般是测定待测样品中乙酸的浓度和一定数量样品的放射强度，计算出每毫克乙酸的

放射强度（dpm/mg）。由此得出的比活度与SA的定义有差别，放射强度与

14

C－

乙酸分子数的数量关系是固定的，因此dpm可视为14C－乙酸分子数的单位，但由浓度与体积成绩得出的测定样品中乙酸的含量包括了

14

C－乙酸，因此实际得

出的应是14C－乙酸与样品中乙酸分子总数的比例P，在14C－乙酸的比例很小的情况下与比活度值的差别可忽略。从以下的推导可以看出，用注入前后样品的P之差计算的SA较之用比活度差计算更接近真实的SA。

对于某一样品，其P值与比活度SA的关系如下：

P=SA/1+SA„„„„„„„„„„„ (15)

设:

注入14C－乙酸之前瘤胃液中乙酸的比活度为SAbk，14C－乙酸在乙酸中的分子数比为Pbk；

达到同位素平衡后瘤胃液中乙酸的比活度和

Psa；

14

C－乙酸的比例分别为SAsa和

注入瘤胃的乙酸的比活度和14C－乙酸的比例分别为SAi和Pi；如注入的乙酸中只有14C－乙酸，则SAi为，Pi为1。

用于分析的样品中含有m个乙酸分子，其中来自注入和瘤胃发酵产生的乙酸分子数分别为mr和ms。可以建立以下方程：

mrmsm mrPimsPbkmPsa

解以上联立方程，求出mr和ms：

mrmPsaPbk/PiPbk msmPiPsa/PiPbk

14

mr中C－乙酸的分子数*mr为：

*

mrmPrimPiPsaPbk/PiPbk

按照（13）中的含义，SA*mr/ms，即：

SAmPiPsaPbk/PiPbk/mPiPsa/PiPbk

PiPsaPbk/PiPsa

PsaPbk/1Psa/Pi

注入乙酸中主要是14C－乙酸，Pi大大高于Psa，因此： SAPsaPbk„„„（16） 按（15）式，P将换为SA：

SASAsa/1SAsaSAbk/1SAbk

将分母中SAsa、SAbk忽略后才有SASAsaSAbk。因此使用（16）式更为准确。

下面给出描述开始注入学公式。

14

C－乙酸后，瘤胃液中乙酸比活度随时间变化的数

图9－2 推导乙酸比活度随时间变化的模型

其中：Ra、Rd为瘤胃中乙酸的合成速度，K为速度常数，M为瘤胃液中合成的乙酸量，

C为瘤胃液中乙酸的浓度，V为瘤胃液的表观体积，*Mt为时刻t瘤胃液中注入的14C－乙

酸量

瘤胃液中14C－乙酸的数量随时间变化的微分方程为：

d*Mt/dtIak*Mt，属一阶非齐线性方程，通式为dy/dxQxPxy，

通解

ye

Pxdx

QxePxdxdxc。微分方程的解为： 

*

Mte

kdt

Iaekdtdtc 

ktIa/kec ekt

当t=0时，*Mt＝0，带入上式得cIa/k。因此：

*

MtIa/k1ekt„„„ (17)

DhD0

由定义：V0D0/Ch0

NV0/1.01Vh/1.04/2

rCO2N/2f3k0kh10.008x/10.059x

SAt*Mt/M，且MCV，代入（17）式得： SAtb1ekt„„„„ (18)；其中bIa/kCV。

⒉ 一次注入（bolus injection）示踪物时的恒态单室模型

仍以瘤胃乙酸产生速度的测定为例，向瘤胃中一次性注入一定量的

14

C－乙

酸，瘤胃液中注入14C－乙酸的存留量*Mt随时间t而减少两者之间的关系为：

d*Mt/dtk*Mt，该微分方程的解为：

ln*Mtktc，当t＝0时，*Mt等于注入的14C－乙酸量*M0，因此有：

ln*Mt－ln*M0＝－kt，变形得：

*

Mt*M0ekt„„„ (19)，

SAt与时间t的关系为： SAt＝SA0 e-kt„„„ (20)，

SA0为零时刻乙酸的比活度，等于*M0/CV。

一次注入总量为*M0的14C－乙酸后，时刻t的14C－乙酸从瘤胃中消失的速度v为：

vk*Mtk*M0ektkCVSA0ekt„„„ (21)

14

C－乙酸瞬间消失的数量d*Mt为：

d*MtvdtkCVSA0ektdt„„„ (22)

经过0～∞的时间后，注入的14C－乙酸全部从瘤胃中消失，即：

*

M0kCVSA0ektdt„„„ (23)



瘤胃中乙酸产生的速度RakCV，代入（23）式并变形得：

RaM0/SA0ektdt„„„ (24)

*



由上述推导，一次注入14C－乙酸时瘤胃乙酸合成速度Ra的测定方法是：在注入后的不同时刻点采集瘤胃液样品，测定乙酸的比活度SAt并记录准确的采样时刻t，得到的两组数据按（20）式进行数据拟和，求出方程中的系数项，按（24）式求出Ra。一次注入方法的采样次数较连续注入多，且需要记录采样时间，Ra的计算方法也较为复杂。但该方法可以得出更多的信息。连续注入方法只能计算出Ra，一次注入方法可以同时计算出V和k。拟和出的（20）式的常数项即是SA0，而SA0*M0/CV，*M0已知，因而可求出CV，测定瘤胃液乙酸浓度C，得到瘤胃液的表观体积V。k值是（20）式中e-kt项的常数，可直接由拟和结果得出。在代谢动力学研究中，观测示踪物的动态变化过程较之在同位素达到平衡后观测可以得到更多关于系统特性的信息，相应的测定方法也较复杂，这在后面系统辨识方法的讨论中可以更清楚地了解到。 ⒊ 非恒态单室模型

1959年Steele用连续注入示踪物的方法测定了注射胰岛素对葡萄糖合成的影响，这是测定非恒态代谢合成速度的第一个试验。Steele按单室模型推导了有关计算公式，并且假定室中葡萄糖是均匀分布的，注入的标记葡萄糖能即刻与室中的葡萄糖混匀，从室中消失的葡萄糖（或标记原子）不再回到代谢室中。前面关于恒态代谢时计算公式的推导实际上也假定了同样的条件，因此Steele推导的公式适合于可用单室模型描述的所有底物代谢动力学的研究。图9－3是理想单室模型及使用符号的含义。其中Gb是室中注入的标记葡萄糖量、Gt是室中的葡萄糖总量、E是室中标记葡萄糖与非标记葡萄糖的比例。

Rd（消失速度） 图9－3 理想单室模型

由定义，Gb＝E×Gt，微分该式即得到室中标记葡萄糖量随时间变化的微分方

程：

dGb/dt＝Et dGt/dt＋Gt dEt/dt„„„ (27)

室中合成葡萄糖量的增减决定于葡萄糖的合成和消失速度： dGt/dt＝Ra－Rd„„„„„„„„„ (28)

室中标记葡萄糖的增减决定于标记葡萄糖的注入速度和消失速度，其消失速度为Rd×E：

dGb/dt＝I－RdEt„„„„„„„„„(29) 将（28）、（29）式代入（27）式： I－RdEt＝Et (Ra－Rd)＋Gt dEt/dt I＝RaEt＋Gt dEt/dt RaEt＝I－Gt dEt/dt

Ra＝(I－Gt dEt/dt)/ Et„„„„„„(30) Rd＝Ra－dGt/dt„„„„„„„„„ (31)

用（30）、（31）式估测Ra、Rd时，在不同的时刻点采样测定Et、葡萄糖浓度Ct，葡萄糖的总量Gt是浓度Ct与分布体积V的成绩。Steele在研究过程中认识到体液中的葡萄糖不是均匀分布的，引入了因子p校正体积V，使用下式建立方程：

Ra＝{F－pV[（C2＋C1）/2][（E2－E1）/(t2－t1)]}/[（E2＋E1）/2]„„„ (32) Rd＝Ra－pV(C2－C1)/ (t2－t1)„„„ (33)

其中C2、C1，E2、E1、t2、t1分别是在时刻t2、t1采得样品的葡萄糖浓度和标记葡萄糖与葡萄糖总量的比。

用单室模型是否能客观地描述真实的代谢情况主要决定于代谢物的分布是否符合理想单室模型的假设。体内水的代谢最接近理想单室模型。仅存在于血清中的底物，如游离脂肪酸（FFA）的代谢也接近理想情况，但研究表明，即使FFA的代谢，由于采样位点和示踪物注入位点的不同，样品富集度也有20－30％的差异。葡萄糖是研究最多的代谢物，多年来一直认为葡萄糖是适宜于用单室模型描述的代谢物。一次注入标记葡萄糖的研究表明，用2或3室模型方程拟和得到的富集度-时间曲线优于用一室模型方程拟和。这表明体液中的葡萄糖是在多个容易混匀的代谢室中分布的。已经证实，血清和组织液中葡萄糖的代谢动态特性

不同，应将其区别为两个不同的代谢室。对于存在于血清和组织液中的代谢物至少应视为存在于两个不同的代谢室中，而对于能由多种组织产生的代谢物，其情况可能更复杂。 二. 多室模型分析 ⒈ 房室个数的确定：

由于单室模型的局限性，对于一些代谢过程需要采用多室模型来描述。室的个数和室与室之间的关系可根据示踪试验数据的拟和结果和对代谢过程的分析确定。一般情况下室的个数与推导出的富集度-时间函数中的幂函数个数相同，因此用含有不同个幂函数的方程拟和示踪试验数据有助于确定室的个数。由代谢过程考虑室的个数主要考虑两个方面，一是室与室之间存在物理间隔，比如血清和组织液被毛细血管壁所分隔，两种体液中的代谢物可以发生交换，但交换的速度与代谢物的性质有关。二是代谢物之间发生相互转变，如研究丙酮酸的代谢时，标记的丙酮酸能很快地转变为标记乳酸，经过不同途径代谢，需要将丙酮酸和乳酸作为不同的代谢室对待。室与室之间根据代谢物的流动方向连接，两个室之间有相互的代谢物流动时用一对逆向的箭头连接，在某个室中有代谢物的不回流消失时用向外的箭头表示。箭头上的kij表示代谢物流动的速度常数，其中i是代谢物流入的室，j是代谢物流出的室，代谢物不回流消失的方向用0表示。图9－4是两个房室模型举例。

k12 k31

k21 k32 k42

01 04

图9－4 房室模型举例

上图的模型称为分支模型，外周的三个室均与中央室连接，相互之间不连接。下图的

模型称为链接模型，各室之间依次连接

⒉ 描述房室模型同位素富集度变化的函数

房室模型确定后，描述注入示踪物后代谢物同位素富集度-时间变化曲线的函数关系随之确定，按函数关系拟和测定出的富集度-

时间值，可以计算出所需的代谢物的动态代谢参数。推导函数关系的一般步骤是：列出富集度随时间变化的微分方程；拉普拉斯变换微分方程为线性代数方程；逆拉普拉斯变换得出微分方程的原函数。如对图9－5的二室模型，原函数的推导过程如下：

f1002

图9－5 二室模型

Mi、Ci、Vi分别代表室中代谢物的数量、浓度和分布体积，标记物的数量

用*Mi表示，富集度用Ei表示，且Ei*Mi/Mi。f10是描述标记物注入的函数，当一次注入Z0剂量的标记物时，用冲量函数描述标记物的注入，即f10＝Z0σ（t），

且t＝0时，σ（t）＝∞，t≠0时σ（t）＝0，并有tdt1；连续注入标





记物时，f10用单位阶跃函数描述，即f10＝Z0[u(t)－u(t－T)]/T，且当t

注入示踪物后，各室内标记物数量Mi(t)随时间变化的微分方程为：

*

M1t/dtk21*M1tk12*M2tf10

M1t/dtk12k02M2tk21*M1t

*

*

一次注入标记物时以上方程组的拉普拉斯变换形式为：

s*M1sk21*M1sk12*M2sZ0

s*M2sk12k02M2sk21*M1s

*

移项后得：

sk21

*

M1sk12*M2sZ0

*

k21*M1ssk12k02M2s0

将*M1s、*M2s视为未知数，其它为常数，用线性代数的方法解以上方程组得：

*

M1sZ0sk12k02/sk21sk12k02k21k12„„„ (34) M2sk21Z0//sk21sk12k02k21k12„„„„„„„„ (35)

*

用待定系数法，令(s＋k21)(s＋k12＋k02)－k21k12＝(s＋α)(s＋β),则有： α＋β＝k21＋k12＋k02„„„ (36) αβ＝k21k12„„„„„„„ (37) 令：

1sA1/sB1/s

„„„ (38)

*M2sA2/sB2/s„„„ (39) 则有：

A1＝Z0(k12＋k02－α)/( β-α)„„„ (40) B1＝Z0(k12＋k02－β)/( α-β)„„„ (41) A2＝Z0k21/( β-α)„„„„„„„„ (42) B2＝Z0k21/(α-β)„„„„„„„„„(43)

形如a/(s＋α)的逆拉普拉斯变换为aet，因此各室中标记物数量随时间变化的原函数为：

*

M1tA1etB1et„„„ (44) M2tA2etB2et„„„ (45)

*

定义室中代谢物的富集度Ei为*Mi/Mi，而MiCiVi，则各室代谢物富集度随时间变化的函数关系为

E1tA1etB1et/C1V1„„„ (46) E2tA2etB2et/C2V2„„„(47)

连续注入示踪物时，f10用单位阶跃函数描述，此时（34）、（35）式中的Z0

变为Z0（1－e－Ts）/Ts，其中T为注入持续的时间。（38）、（39）式相应变为：

*M1sA11eTs/TssB11eTs/Tss

*

M2sA21eTs/TssB21eTs/Tss

变形得：

*

TsM1sA1/T1eTs1/s1/sB1/T1e1/s1/s

„„„ (48)

*

TsM2sA2/T1eTs1/s1/sB2/T1e1/s1/s

„„„ (49)

1/s的逆拉普拉斯变换为1；1/ (s＋a)的逆拉普拉斯变换为eat；e－Ts /s的逆拉普拉斯变换为u(t－T)；e－Ts / (s＋a)的逆拉普拉斯变换为eatTutT，当t

(A1/ Tα)( 1－e－Ts)[1/s－1/ (s＋α)]＝(A1/ Tα)（1/s－1/ (s＋α)－e

－Ts

tTt

1eutTeutT /s＋e－Ts / (s＋



A1/T

当t>T时：

tTt

A1/T1eT 1eutTeutTA1/T

当t≥T时，令ttT：

tTt

A1/T1eTet 1eutTeutTA1/T

(46)、(47)式的其它各项形式相同，因此连续注入示踪物时，各室代谢物富集度随时间变化的函数为：

当t

E1tA1/C1V1T1etB1/C1V1T1et„„„ (50) E2tA2/C2V2T1etB2/C2V2T1et„„„ (51)

当t≥T，亦即停止注入示踪物后：

E1tA1/C1V1T1eTetB1/C1V1T1eTet„„(52) E2tA2/C2V2T1eTetB2/C2V2T1eTet„(53)

在以上二室模型中，如果室一可测而室二不可测，即可以从室一取得样品测定代谢物富集度随时间变化的曲线但不能从室二取得样品。由对室一的测定结果可以估计模型中的各个参数。一次注入示踪物时的估计方法如下：

首先，在注入示踪物后的不同时刻点采样，测定室一的代谢物富集度-时间曲线，对测定结果按（46）式进行数据拟和，由拟和结果估计出A1、B1、α、β。由（36）、（37）、（40）、（41）式可估计出各kij。将（46）式外推至t＝0，此时

E10Z0/C1V1，即C1V1Z0/E10。C2V2只有当室二可测，并向室二注入标记物

时才可估计。连续注入示踪物时，一般在注入示踪物的同时采样，按（52）式拟和测定结果，由拟和结果估计kij。C1V1在将拟和出的A1、B1、α、β代入（46）式后按一次注入标记物的方法估计。

一般地，不同模型代谢物富集度-时间函数的形式与以上二室模型相同，幂函数的个数与模型中室的个数相同，函数式中的系数项是各速度常数、室容量、

注入剂量、注入持续时间的代数表达式。参数是否可以估计与模型及模型中各室的可测情况有关。这种通过测定富集度-时间曲线，按推导出的函数关系拟和测定数据估计参数的方法称为系统辨识。 三. 启动注入(priming the pool）剂量的确定

相对于示踪物连续注入的速度，如果代谢室中底物的数量很大，往往需要持续数小时甚至更长的时间才能达到同位素平衡。时间越长，维持动物安静和生理状态不发生变化的难度越大。因此一般希望能尽快达到同位素的平衡。1954年，Searle首先采用了启动注入与连续注入相结合的方法，即首先向动物体内一次注入一定量的示踪物，使代谢室的SA接近平衡时的SA，接着进行连续注入，缩短了达到同位素平衡所需的时间。之后用这一方法研究了包括乳酸、甘油、脂肪酸、氨基酸、尿素在内的多种物质的代谢，证实启动注入不影响最终同位素平衡的SA。

启动注入的示踪物剂量为*M0，连续注入的速度为Ia，开始注入后时刻t代谢物的比活度为SAt，由（18）和（20）式：

SAtb1ektSA0ekt„„„ (25)，

其中bIa/kCV，SA0*M0/CV；

当t∞时，SAt＝b，即启动注入结合以速度Ia连续注入达到同位素平衡后的SA与单纯以速度Ia连续注入达到同位素平衡后的SA相同。

理想的启动注入剂量是即刻达到同位素平衡，亦即将t＝0代入（25）式得到SAt＝b。t＝0时，e-kt＝1，代入（25）式：

b＝b×（1－1）＋SA0 ×1＝SA0，由b和SA0的含义：

Ia/kCV*M0/CV，变形：

*

M0/Ia1/k„„„ （26）

上式说明理想的启动注入剂量应是：启动注入剂量与连续注入速度的比是代谢物消失速度常数的倒数。注入启动剂量的示踪物后，代谢物的即刻SA是连续注入达到同位素平衡后的SA。启动注入剂量高于或低于理想剂量均能延长到达同位素平衡的时间，一般注入的启动剂量越接近理想剂量、速度常数k越小，启动注入的效果越好。估计理想启动剂量的方法有两种，一是估计代谢物的总量

（CV）和消失速度，由RakCV估计k值；二是通过预试估计。第一种方法虽然不需要试验，但有可能产生较大的误差。原因是在以上的推导中由一次注入的示踪物可以与代谢室中的代谢物即使混匀的假设，这只是理想的情况，实际是不存在的。图9－6是启动注入剂量等于、低于、高于理想剂量时SA随时间变化情况。

0 图9－6不同启动注入情况下的SA曲线

第三节 同位素示踪技术应用举例

本节重点介绍了同位素示踪技术在反刍动物营养研究中几个方面的应用方法。

一. 蛋白质代谢

测定蛋白质合成、分解速度的同位素示踪方法可分为三种。终端产物法是在同位素平衡后测定氨基酸室的周转速度，通过测定氨基酸分解代谢的某种终产物的产生速度确定氨基酸合成到蛋白质中的速度和蛋白质的分解速度，一般用于机体水平蛋白质代谢速度的测定。前体底物法通过测定一段时间内标记氨基酸合成到组织蛋白中引起的富集度变化测定组织蛋白的合成速度，此时得到的合成速度一般用每天合成的蛋白质量占该组织蛋白总量的百分比表示（ %/天），称为蛋白质合成比速度（fractional protein synthesis rate, FSR）。动静脉差法适用于有独立的回流静脉，并可做插管的组织，通过流入和流出组织的标记氨基酸数量差别测定蛋白质的合成速度。3—甲基组胺酸法是利用肌肉蛋白分解代谢产生的3—甲基组胺酸测定肌肉蛋白的分解速度，该方法是一种非同位素示踪方法。

⒈ 终端产物法

根据示踪氨基酸的性质，终端产物法分为非必需氨基酸示踪法和必需氨基酸示踪法。非必需氨基酸示踪法是向体内注入某种15N标记的非必需氨基酸，通常用15N—甘氨酸。由于转氨基作用，由此引入体内的15N对其它氨基酸进行了标记，从而对体液氨基酸的代谢进行示踪，以由尿排除的尿素或氨N作为测定氨基酸分解速度的终产物。必需氨基酸示踪法是向体内引入某种标记的必需氨基酸，标记原子可以是C或N，但必需能够反映该必需氨基酸的代谢情况，用于测定氨基酸分解速度的终产物是标记CO2或尿素（氨N）。 1.1 15N—甘氨酸连续注入方法（终端产物法）：

该方法由Picou和Taylor Roberts于1969年提出，测定条件是同位素平衡和恒态代谢，测定指标是氨基酸的吸收速度和尿中排除尿素（或氨N）的速度及富集度（15N/N）。

（1）原理：该方法的原理见图9—7。

15

图9－7 连续注入N－甘氨酸活体测定蛋白质的合成与分解速度原理

图中C为蛋白质的合成速度(mgN/h)；S为蛋白质的合成速度(mgN/h)；E为由尿排出氨基酸N的速度(mgN/h)，由测定平均每天由尿排出的尿素及氨N数量除24小时得出；I为由消化道吸收氨基酸N的速度(mgN/h)，由每天平均吸收量除24小时得出；F为N－甘氨酸N的注入速度(mgN/h)，为已知量。试验条件是恒态代谢，即测定过程中图中的各速度不变，一般可通过连续饲喂和减少环境刺激使动物接近恒态代谢。

15

恒态代谢时，体液氨基酸N的室容量不变，即有：

C＋I＝S＋E＝Q„„„ (1) 其中Q为蛋白质的周转速度。

连续注入15N—甘氨酸达到同位素平衡后，体液氨基酸N的15N/N比与由尿排出氨基酸N的15N/N比相等，因此可以通过测定尿中尿素或氨N的15N/N比得出体液氨基酸N的15N/N。令R＝15N/N，达到同位素平衡后，15N的注入量等于排出量，即有：

F＝(S＋E)R，即：

Q＝S＋E＝C＋I =F/R，室中E、F、R、I均为已知或可测量，因此蛋白质的合成和分解速度可由下式求出：

S＝F/R－E„„„ (2) C＝F/R－I„„„ (3)

上式的单位为mgN/h，若要转换为蛋白质的mg数，将上式计算结果乘以6.25即可。

（2）方法的假设：在以上推导过程中，暗含以下假设，这些假设与实际情况不完全相符，影响了测定的准确性。

a、严格的恒态代谢，测定过程中体液氨基酸N的室容量不变； b、合成到体蛋白的15N不再分解成氨基酸重新回到体液氨基酸室中； c、同位素的化学性质完全相同；

d、吸收的氨基酸与蛋白质分解产生的氨基酸在代谢上没有差别； e、15N—甘氨酸是有效的示踪物。

试验持续的时间越长，维持恒态代谢的难度越大，室容量有可能发生较大变化。同时随连续注入的延长，再循环15N对结果的影响增加。注入15N—甘氨酸，达到同位素平衡约需30—40小时，缩短平衡时间需要对体液氨基酸和尿素室进行启动注入。N—甘氨酸的注入速度为0.2μmol/kg/min.时，启动注入12μmol/kg的15N—甘氨酸可使体液氨基酸室达到平衡。目前生产的15N标记尿素的两个N原子均被标记，而注入15N—甘氨酸后体内合成的标记尿素只有一个N原子被标记，因此缺少直接启动注入尿素室的标记物。替代的方法是用

15

15

N—甘氨酸

进行间接启动注入，此时15N—甘氨酸的启动计量需达到720μmol/kg，虽可有效地缩短尿素室达到同位素平衡需要的时间，但使用剂量大大超出示踪剂量，注入

的15N—甘氨酸可能影响体液氨基酸的恒态代谢。另外的方法是测定由尿排除氨N的15N/N比，由于氨N的室容量小且周转速度快，达到同位素平衡所需时间少，不需要启动注入。但尿中的氨N主要来自谷氨酰胺的酰胺N，作为反映体液氨基酸N同位素富集度的终端产物不理想。 1.2 标记必需氨基酸连续注入方法：

可利用的标记氨基酸有多种。一些氨基酸在分解代谢过程中产生唯一来源的酮酸，可通过测定这些酮酸的富集度反映细胞内（直接用于蛋白质合成）该氨基酸的富集度，这类必需氨基酸有亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等。另一些必需氨基酸不产生唯一来源的酮酸，只能由血浆中该氨基酸的富集度反映细胞内该氨基酸的富集度。与非必需氨基酸不同的是，必需氨基酸的标记原子必须不能转移到其它氨基酸分子上，具有唯一性。符合这一条件的C、N原子均可。对C原子进行标记时，测定的终产物是CO2，对N原子标记时，测定的终产物是尿素或氨N。 (1) 13C—亮氨酸连续注入：该方法的测定原理见图9－8。

细胞内 血浆

图9－8 连续注入C－亮氨酸测定蛋白质的合成和分解

测定条件为恒态代谢和同位素平衡。图中I为亮氨酸吸收速度，F为C－亮氨酸注入速度，

C为蛋白质分解速度，S为蛋白质合成速度，E为亮氨酸分解速度

13

13

亮氨酸来自吸收和蛋白质的分解，其代谢途径或者用于蛋白质合成，或者氧化分解。亮氨酸分解的第一步是脱氨基产生α－异己酮酸（KIC），亮氨酸脱氨是KIC的唯一来源，因此达到同位素平衡后KIC的富集度即是细胞内亮氨酸的富集度。假设血浆和细胞内亮氨酸的富集度相同，按（2）、（3）式可以计算出蛋白质

的合成和分解速度，此时E由收集呼出的CO2，测定单位时间13CO2的排出数量得出。以蛋白质的数量表示合成与分解速度，计算公式改为：

S＝(F/R－E)/590„„„ (4) C＝(F/R－I)/590„„„ (5)

其中S、C 的单位是g蛋白质/h，F、E、I的单位是μmol亮氨酸/h，每g蛋白质中平均含有590μmol亮氨酸。

亮氨酸的分解速度E由下式计算：

E（μmol/h）=RaC（μmol/h）×RC/Rleu„„„ (6)

其中RaC是二氧化碳的产生速度，RC是二氧化碳的同位素富集度，Rleu是亮氨酸的同位素富集度。

该方法的主要问题是：血浆和细胞内亮氨酸的富集度并不相同，由于亮氨酸是在细胞内代谢的，用细胞内亮氨酸的富集度优于用血浆内亮氨酸的富集度。KIC的唯一来源是亮氨酸的分解代谢，应能反映细胞内亮氨酸的富集度，且KIC可由细胞内排出到血浆内，是可测的。但有研究表明血浆KIC的富集度高于细胞内亮氨酸的富集度。另一个问题是吸收的亮氨酸在肝脏中被代谢，未能与注入的－亮氨酸混合，实际的I值小于由亮氨酸吸收测出的I值。

(2) 连续注入α－15N－赖氨酸或1－13C－赖氨酸：赖氨酸的α氨基极少发生氨基酸间的转氨基作用，而其1位碳原子一旦丢失，剩余残基也不能在合成赖氨酸，因此标记α氨基N或1位碳原子可以示踪赖氨酸的代谢。赖氨酸的分解代谢不产生唯一来源的中间产物，因此只能用血浆赖氨酸的富集度用于计算。计算公式为：

S＝(F/R－E)/544„„„ (7) C＝(F/R－I)/544„„„ (8)

13

13

C

C标记赖氨酸时E的计算公式为：

E（μmol/h）=RaC（μmol/h）×RC/Rly„„„ (9)

15

N标记赖氨酸时E的计算公式为：

E（μmol/h）=Raurea（μmol/h）×2μmol N/μmol 尿素×Rurea/Rly„„„ (10) 其中RaC是二氧化碳的产生速度，RC是二氧化碳的同位素富集度，Rly是赖氨酸的同位素富集度，Raurea是尿素的产生速度，Raurea是尿素的同位素富集度。 ⒉ 前体底物法

前体底物法是通过测定蛋白质合成前体—氨基酸合成到蛋白质中的速度，测定蛋白质的合成速度。根据标记氨基酸的注入数量和方法，又分为启动-连续注入法和大剂量法（Flooding dose）。 2.1启动-连续注入法：

注入启动剂量的标记氨基酸，使蛋白质合成前体氨基酸室迅速达到同位素平衡，通过连续注入维持平衡状态。蛋白质合成比速度FSR按下式计算：

FSREbtEb0/Eptt0„„„ (11)

其中Ebt为开始注入标记氨基酸后时刻t的蛋白质中标记氨基酸的同位素富集度，Eb0为蛋白质中标记氨基酸的背景富集度，Ep为蛋白质合成前体标记氨基酸室的平衡同位素富集度，(t—t0)为从开始注入标记氨基酸到采集组织蛋白样品的时间间隔。

（11）式的推导过程假定在试验期间合成到蛋白质中的标记氨基酸未从蛋白质分子上解离下来，并且前体氨基酸的同位素平衡是即时达到的。设蛋白质中标记氨基酸的比例为P，蛋白质的总量为M，蛋白质合成比速度为FSR，则同位素标记氨基酸合成到蛋白质中的速度为EpFSRMP，经过t时刻后蛋白质中标记氨基酸的同位素富集度增加量为：

EbtEb0EpFSRMPtt0/MP，整理后即得（11）式。

可选择血浆、组织液或氨基酸—tRNA中的标记氨基酸作为前体氨基酸室。以氨基酸—tRNA最为合理，但测定难度较大，因此一般选择血浆或组织液中的标记氨基酸作为前体氨基酸。有试验结果表明，血浆氨基酸的平衡富集度高于组织液中的富集度，而tRNA中的富集度介于两者之间。以血浆氨基酸作为前体时，可在开始注入标记氨基酸后的不同时刻点采集血浆样品，测定富集度-时间曲线下的面积作为（11）式的分母，此时（11）式应写为：

tFSREbtEb0/0Eptdt„„„ (12)

以组织液或AA—tRNA作为前体氨基酸室需要采集组织样品，匀浆后离心分离组织液。多数情况下不能对组织连续活体采样，只能屠宰后采样，FSR的计算按（11）式。

以血浆氨基酸作为前体氨基酸室的优点是可以连续采样，即使不能迅速达到

同位素平衡 (12)式仍然是有效的。由于蛋白质合成是在细胞内进行的，因此细胞内的氨基酸是蛋白质合成的真正前体。一些氨基酸代谢过程产生特有的代谢物，其同位素富集度应与细胞内氨基酸的同位素富集度相同。对于这些氨基酸，可以通过采集血浆样品，测定其代谢物的同位素富集度，实现对细胞内氨基酸富集度在不同时刻点的测定。属于这类情况的氨基酸有：

（1）甘氨酸：安息香酸（benzoic acid）在肝脏中与甘氨酸结合形成马尿酸（hippuric acid），因此可以用马尿酸的同位素富集度作为肝脏中作为蛋白质合成前体的甘氨酸的富集度。

（2）亮氨酸：亮氨酸脱氨基产生α－异己酮酸（KIC），因此可用KIC的富集度作为细胞内亮氨酸的富集度。但血浆中的KIC来自不同的组织，而不同组织中作为蛋白质合成前体的亮氨酸的富集度是不同的。并且有研究表明血浆KIC的富集度高于细胞内亮氨酸的富集度。

（3）精氨酸：由尿素合成途径，瓜氨酸既是精氨酸合成的前体，也是尿素的合成前体，因此尿素C原子的富集度（标记C可由H14CO3引入）或尿素N原子的富集度（标记N原子由15NH3或15N－甘氨酸引入）反映了蛋白质合成前体精氨酸的富集度。

2.2 大剂量注入：

由于启动-连续注入方法在确定蛋白质合成前体氨基酸富集度方面的困难，因此提出了大剂量注入方法。该方法的原理是一次注入大剂量的标记和非标记氨基酸，以至大大超出体内游离氨基酸的总量，使各处氨基酸的富集度相等。注入氨基酸的总量一般超出体内游离氨基酸总量的11倍。如绵羊体内游离苯丙氨酸的浓度约为0.0479mmol/kg体重，标记和非标记苯丙氨酸的注入量应超过0.55mmol/kg活重。试验时，注入标记和非标记氨基酸后，间隔5min。采集血样，共采4－5个样品。之后迅速屠宰动物，采集不同组织的样品迅速在液氮中冷冻，完成注入至采集完最后一个组织样品间的时间间隔越短越好，一般不超过1小时。测定血浆和组织蛋白中的苯丙氨酸富集度，按（11）或（12）式计算FSR。 ⒊ 动静脉差法：

对于有独立的回流静脉并可在回流静脉上安装血管插管的组织器官（如门静脉回流内脏组织、后肢肌肉组织等），可以测定流经该组织器官的血流量和进出

组织器官的氨基酸数量，通过测定进出的标记和非标记氨基酸数量可估测该组织器官的蛋白质合成与分解速度。

设组织器官的血流量为F，动脉中某氨基酸的浓度为CA，静脉中的浓度为CV。经启动和连续注入同位素标记的该氨基酸，血样中的氨基酸迅速达到同位素平衡，只要注入标记氨基酸至采样时间足够短，合成到组织蛋白中的标记氨基酸极少解离下来，可以认为静脉中少于动脉的标记氨基酸被用于了组织蛋白的合成。设动脉中氨基酸的同位素富集度为EA，静脉中的富集度为EV，组织液中的富集度为EM。

氨基酸的动静脉差为： AAT＝（CA－CV）F

同位素标记氨基酸的动静脉差为： AAB＝（CAEA－CVEV）F

氨基酸合成到组织蛋白质中的速度为：

UAAB/EMCAEACVEVF/EM„„„„„(13)

氨基酸的动静脉差应为组织中氨基酸合成到蛋白质中的速度U与由蛋白质解离下来的速度P之差，亦即AAT＝U－P，因此氨基酸由蛋白质中解离下来的速度为：

PUAATAAB/EMCACVF

CAEACVEVFB/EMCACVF„„„ (14)

其中CA、CV、EA、EV可由采得的动静脉血样测定，F可由上下游稀释或电磁血流量计测定，EM可由采得的组织样品测定。在已知某氨基酸在组织蛋白中的含量时，可将U、P换算为蛋白质合成和分解的速度。

动静脉差法的主要问题是，有时动静脉中氨基酸流量的差别很小，甚至在误差范围之内，而且U实际上包括合成到蛋白质中的氨基酸和被氧化分解的氨基酸，若能同时测定氨基酸的氧化产物，则可以得到用于合成到蛋白质中的氨基酸数量。另外对是否有从蛋白质上解离下来的标记氨基酸及其对结果的影响程度不清楚。

⒋ 肌肉蛋白分解速度的活体测定

3－甲基组氨酸（3－MeH）肌原纤维中肌动蛋白、肌球蛋白的部分组胺酸甲酰化的产物。3－MeH不能与tRNA结合，因此不会再合成到蛋白质分子上去。合成之后3－MeH大约有5％转变为N－乙酰－3－MeH，不再发生其它代谢，并全部由尿排出。产生的3－MeH大约91％来自骨骼肌，3.1％来自消化道蛋白，3.3％来自皮肤和结缔组织蛋白。测定由尿排出的3－MeH数量，按下式计算肌肉蛋白的分解速度：

B（mg蛋白/kg体重/天）＝每天、每kg体组织排出的3－MeH(μmole)/3.63 其中3.63是肌肉蛋白中3－MeH的浓度。 二. 测定能量代谢的双标记水方法

通过注入分别对氧或氢原子进行标记的同位素标记水分子测定体内氧化代谢的CO2产量的方法由Lifson于1975年提出。该方法为在正常生活状态下动物能量代谢的研究提供了可能。 ⒈ 基本原理

存在于体内多种组织、尤其是红细胞中的碳酸脱水酶（carbonic anhydrase）催化二氧化碳与水的结合，使二氧化碳与水分子结合的速度高于无催化结合13000倍。该酶的存在加快了二氧化碳与水分子间氧原子的交换，使体内CO2和H2O的氧原子之间可以很快地达到同位素平衡。向体内注入标记氧原子的水分子（如H218O）时，标记氧原子随排出体外的水和二氧化碳排出；而向体内注入标记氢原子的水（如2H2O）时，标记氢原子只随水排出。由注入两种不同标记水测定的水的周转速度差别可以测定出二氧化碳的产生速度。

双标记水方法操作简单、对动物无损伤。该方法只需通过口服给动物注入同位素标记的水，并准确称量动物的体重和每天（或数天）采集一次分析样品。采集的样品可以是血液、尿或唾液。 ⒉ 标记水的注入剂量 2.1 H218O的注入剂量：

H218O的价格较高，应基于减少试验费用和取得有效的试验数据确定H218O的注入剂量。一般最后一次采样距注入标记水的时间应为1.5－2个体内水的半滞留期，且最后样品的原子百分超（AP）应为尿样背景AP的100倍。水的半滞留期可由每天的排尿量和体内水分含量及体重估计，若体重为W、水分约占体重的

60％、每天排尿量为M，则估计的半滞留期为0.6W/2M。

注入H218O后，时刻t采得样品中H218O的浓度可由一室模型计算，即： C（t）＝C（0）e－kt

其中C（t）为时刻t样品中H218O的浓度（亦即18O的富集度），C（0）为注入H218O后水中18O的初始浓度。若H218O的注入剂量为Z0，则C（0）可由Z0/0.6W估计。k值则可由每天排尿量除以体内水分总量，即M/0.6W估计。由C（t）=0.25C(0)估计出最后一次采样的时间，最后一次尿样的富集度一般应高于0.0001gH218O/gH2O。若水在体内的半滞留期为7天，两个半滞留期为14天；k为0.09，H218O的注入剂量估计如下： C（t）＝C（0）e－kt C（0）＝C（t）ekt

CO0.0001e0.09140.000352gH218O/gH2O

注入剂量＝0.000352×0.6×1000＝0.2112g H218O/kg体重 2.2 2H2O的注入剂量：

2

H2O的价格较低，可适当加大用量。用IRMS分析样品富集度时，注入剂量

应在0.3g/kg体重以上；而用红外分光光度法测定富集度时，因其灵敏度较低，注入剂量应达到0.9g/kg以上。 ⒊ 试验方法

唾液、尿及血液均可作为分析样品，但唾液样品中存在2H的轻微分馏现象，因此以采集尿或血液样品较好。同位素标记水可通过口服注入，尤其是单胃动物。反刍动物瘤胃中有大量的水，因此对反刍动物以静脉注入较好。

在Haggarty等以马鹿为试验动物的研究中，动物的平均体重为103±2kg，H218O的注入剂量为0.12g/kg体重，2H2O的注入剂量为0.16g/kg体重。标记水制成生理盐水，通过颈静脉插管注入，体积约60ml。动物饲养在围栏草地内，5只注入标记水，2只作为对照以测定标记动物排出环境中的标记水被动物重新摄入的数量。在试验当天的10：00安装颈静脉插管，采集空白血样（10ml）后，注入标记水。在当天15：00由另一侧颈静脉真空采血管采集血样10ml，之后每天采一次血样。血样制成血清，血清用超滤膜过滤掉大分子后保存待测。 ⒋ 计算方法

4.1 计算方法推导的一般依据

将体内的水视为单室模型，水的排出速度rH2O是速度常数k与室容量的乘积。设水中2H2O的消失速度常数为kh，H218O的消失速度常数为ko，CO2的排出速度为rCO2。由于2H只随水排出体外，而18O随水和二氧化碳排出体外，因此有：

rH2OkhN

rH2O＋2rCO2＝koN 即：

rCO2k0khN/2 4.2 k值的计算

按照一室模型，标记水的富集度（以高于背景的标记水浓度表示）与时间t和速度常数k的关系为：

C(t)＝C(0)e-kt„„„ (15)，取对数得： lnC(t)= lnC(0)－kt„„„ (16)

对于任意两个时刻点t1、t2测得的C(ti)，有: k= [lnC(t1)－lnC(t2)]/(t2－t1)„„„ (17)

k值的计算方法相应有三种，一是测定标记水的富集度随时间变化曲线，按(15)式进行最小二乘数据拟和，二是按(16)式进行最小二乘数据拟和，三是测定两个时刻点的富集度，由（17）式计算。 4.3 方法的假设

(1) 体内的水可看作是一室模型，标记水在其中分布并由此排出； (2) 2H只以水的形式排出体外；

(3) 18O以水和和二氧化碳的形式排出体外，并且水和二氧化碳间的碳原子交换相当迅速；

(4)水和二氧化碳的排出速度稳定；

(5)排出体外的水和二氧化碳与体内水的富集度相同（没有分馏现象）； (6)背景同位素摄入速度稳定。 4.4分馏现象

上述假设中，一般认为（5）是不成立的，分子量较大的水分子蒸发损失的速度较慢，而在水分子中的氧原子转移到二氧化碳分子上时，18O快于16O。因

此蒸发水与液态水、二氧化碳与液态水中的同位素富集度不同，对人的测定得到如下结果：

f1＝0.9412H2O(汽态)/ 2H2O(液态) f2＝0.992H218O(汽态)/ H218O(液态) f3＝1.039C18O2(气态)/ H218O(液态) Lifson提出了考虑分馏现象的计算公式：

rCO2k0khN/2f3f2f1khNx/2f3„„„ (18) 其中x是发生分馏的水的比例，代入fi的数值后得： rCO2Nk0kh10.51x/2.078„„„„„„(19)

在计算过程中考虑分馏现象的影响需要估计x的大小，下面介绍报道过的几种方法。

水的周转量减去同时间内由尿排出水的数量给出了发生分馏的最大可能的水的数量，水的周转量按下式计算：

rH2O1.02khN„„„ (20)

该公式的来源在下面水周转速度计算部分介绍，体内水的总量N由拟和出的（1）式外推到t＝0得出，排尿量可以实测。该方法的问题是过高地估计了发生分馏的水的数量，因为由汗腺分泌和部分唾液中的水不发生分馏。

Schoeller等（1986）用rCO2估计分馏水的数量，损失的分馏水数量为2.3 rCO2，而rCO2约为k0khN/2f3的95％，将2.30.95k0khN/2f3代入（4）式代替发生分馏水的数量khNx得：

tTt

A1/T1eT1eutTeutTA1/T

ttT

rCO2k0khN/2f32.30.95f2f1k0khN/2f3

2

k0khN/2f312.30.95f2f1/2f3 k0khN/2.07812.30.950.0512.078 0.455Nk0kh„„„ (21)

Haggarty等（1998）对马鹿的研究中采用的估计方法是先估计蒸发水的损失，

之后计算蒸发水与水周转量的比例，在下面对Haggarty试验的介绍中将做详细介绍。

4.5 计算rCO2的其它公式

Coward等（1986）提出了与Lifson略有不同的rCO2计算公式：

rCO2N/2f3k0khf2x1x/f1x1x„„„ (22)，代入fi的数值得：

rCO2N/2f3k0kh10.008x/10.059x„„„(23)。 4.6 同位素的分布体积

2H2O和H218O的分布体积不同，H218O的分布体积平均较体内水的总量（TBW）高1％，2H2O则高4％。有两种校正方法，至于哪种方法更好则有不同意见。方法一是计算平均分布体积，若按（21）式计算rCO2，校正后的公式为： rCO20.455N1.01k01.04kh„„„ （24）

拟和出标记水的富集度随时间变化曲线，外推至t＝0求出2H2O和H218O的初始富集度Ch0和C00，按下式计算出标记水的分布体积：

V0D0/C00；VhDh/C00；其中D0、Dh分别为H2O和H2O的注入剂量。

18

2

TBW（即N）按下式计算：

NV0/1.01Vh/1.04/2„„„ (25) 校正方法二是将Vo和Vh直接用于rCO2的计算： rCO20.455NV0k0Vhkh„„„ (26) 4.7 采样期间Vo、Vh发生变化的处理

一般情况下，采样期间Vo、Vh的微小变化可不予考虑，但若用发生肾脏疾病的动物进行试验，或使用利尿剂等，以及研究生长期动物的能量代谢，则需考虑Vo、Vh的变化，此时计算过程中的Vo、Vh值由下式得出： Vo或Vh＝（V1－V2）/ln(V1/V2)„„„ (27)

其中V1、V2是试验开始和结束时的Vo或Vh，为测定V2需在试验结束时再次注入标记水。

4.8 耗能量（产热量，TEE）的计算

若已知动物的每天耗氧量rO2（升/天）、二氧化碳产量rCO2（升/天）和尿氮量（克/天），对于单胃动物可按下式计算TEE：

TEE（KJ/天）＝16.18 rO2＋5.02 rCO2－9.079UN„„„ (28)

对反刍动物还需要知道每天的甲烷产量rCH4（升/天），按下式计算TEE： TEE（KJ/天）＝19.489 rO2＋4.628 rCO2－5.99UN－2.17rCH4.

与呼吸测热不同，双标记水法不能测定耗氧量和甲烷产量，需要通过其它方法估计。对于成年动物，可由消化吸收的饲料成份估计呼吸熵RQ，耗氧量rO2＝rCO2/RQ。若饲料可消化蛋白质、脂肪、碳水化合物的百分含量分别为P、F、C，则RQ可由下式估计：

RQ＝0.81P＋0.71F＋1C„„„ （29）

在人的能量代谢研究中，若摄入酒精，其相应的系数为0.67。

甲烷产量rCH4可由rCO2，在下面对Haggarty试验的介绍中将做详细介绍。 4.9 水周转速度的计算

若不存在分馏现象，水的周转速度可按rH2OkhN计算，但以蒸发方式损失的水分存在分馏现象，考虑这一因素，水的周转速度可按下式计算：

rH2OkhVh1f1khVhx khVh1f1x 代入f1的数值0.94，则：

rH2OkhVh10.06x

Vh1.04N，对于单胃动物，约有30％的损失水发生分馏，则有： rH2O1.02Nkh„„„ (30)

4.10 Haggarty试验中的计算公式 （1）计算公式：

rH2O＝2H flux/(f1x+1-x)－(rH2O甲烷＋rH2O粪便)„„„„„„(31) rCO2＝{ 2O flux－[f2 x rH2O＋(1－x) rH2O]}/2f3„„„„ (32) rCH4＝rCO2×CH4：CO2„„„„„„„„„„„„„„„„ (33) rO2＝(rCO2＋rCO2(甲烷))/RQ－rO2(甲烷)„„„„„„„„„„„(34) TEE＝19.489 rO2＋4.628 rCO2－5.99UN－2.17rCH4„„„„(35)

蒸发水损失（EWL）＝（TEE×蒸发散失热量所占比例PHLE）/蒸发热„„„ (36)

x＝EWL/rH2O„„„ (37)

rH2O甲烷＝rCH4×甲烷的水损失当量„„„ (38)

粪中干物质含量＝(TEE÷饲料干物质的代谢能含量)×（1－消化率）„„„ (39)

rH2O粪便＝粪中干物质含量×粪中干物质的水损失当量„„„ (40)

使用的参数：f1＝0.941；f2＝0.99；f3＝1.039；x＝0.1；RQ＝0.94。（31）、（32）式中的2H flux、2O flux分别为khN和koN。在该试验中N＝Vo/1.01，有关详细说明见Haggarty(1994a，American Journal of Physiology, 267: R1574-－R1588)。

（2）EWL的计算： 18℃下马鹿的产热量约有50％经过蒸发散失（Brockway， 1967），33℃下水的蒸发热是2418J/kg（Blaxter, 1989），用这两个参数和TEE可以计算EWL。但TEE的计算公式中含有rCO2， rCO2的计算公式中又含有x，而x的计算公式中含有EWL。解决这一问题可采用循环计算的方法，首先不对rCO2的计算进行x校正，得到的结果用于EWL的计算，将得到的EWL在用于rCO2的计算，如此循环重复计算，直到重复计算的结果不再变化为止。该试验得到的x是0.42±0.02。rH2O和rCO2等的计算也用到循环计算方法。

（3）粪中干物质含量（FDM）计算： 动物体重基本不变化的情况下，摄入与消耗的能量相等，因此FDM可由产热量、日粮消化率计算。该试验日粮的能量含量为10.22MJ代谢能/kgDM，用绵羊测得的干物质消化率为0.41，FDM的损失水当量为0.12g（Midwood，1993），因此由上述参数和TEE可以计算FDM。但TEE和FDM的计算过程同样存在相互引用的问题，需进行循环计算。

（4）rCH4的计算： 甲烷分子中的H原子部分来自体内水分，因此甲烷是2H损失的途径之一。甲烷的产量可用rCO2估计，rCO2：rCH4在通常日粮条件下的变化范围是10－20，甲烷的损失水当量为1.052g（Midwood，1989）。该试验日粮条件下用绵羊测得的rCO2∶rCH4为13，以此为初始值经过循环计算得到的rCH4为93±5L/d。

（5）尿N损失的计算： 在体重不增加的情况下，尿N损失量等于N的吸收量。由干物质采食量、消化率、日粮的N含量计算。

（6）关于循环计算： 试验过程中只有2H flux和18O flux是可测的，rH2O甲烷、

rH2O粪便、rCO2(甲烷)、rO2(甲烷)、UN的初始值均设置为0，通过整套公式的循环计算得出。关于循环计算的方法见Haggarty发表的文章（1994b，British Journal of Nutrition, 72:799-813）。

三. 糜流通量的同位素双标记物测定

无论瘤胃内容物还是消化道食糜，均由不均匀的固相和液相组成，采集的样品有可能液相或固相偏多，与瘤胃内容物或食糜的真正组成不同，因此测定瘤胃内容物的成份、十二指肠和回肠的食糜流通量及食糜的成份时，最大的问题是如何采集到有代表性的样品。使用十二指肠和回肠过桥瘘管进行全食糜采集在一定程度上解决了样品的代表性问题，但安装过桥瘘管的动物维持时间较短，不能进行持续时间长的试验，而且采集代表性瘤胃内容物的问题没有得到解决。为此，Faichney于1975年提出了双标记物方法测定消化道的食糜流通量，使得食糜流通量的测定可以在安装T型瘘管的动物上进行。1980年他又将该方法推广到瘤胃代表性内容物样品的采集上。 ⒈ 测定原理

1.1 瘤胃代表性内容物样品的采集

通过连续饲喂使瘤胃内容物总量保持不变，以稳定的速度向瘤胃中同时注入两种标记物。两种标记物在固相和液相中有不同的分配比例，在固相中相对较多的标记物称为固相标记物，在液相中相对较多的标记物称为液相标记物。将瘤胃内容物视为一室模型，标记物在瘤胃内容物的浓度与注入时间的关系为：

CtB1ekt，Bf/Mk„„„ (41)

其中C(t)为经过时间t的标记物注入后，标记物在瘤胃内容物中的浓度，f为标记物的注入速度，M为瘤胃内容物的总量，k为标记物从瘤胃消失的速度常数。经过足够长时间的注入之后，瘤胃内容物中标记物的浓度达到稳定，标记物的稳定浓度为：

C(∞)＝B＝f/Mk„„„„„(42)

若两种标记物的注入速度分别为f1、f2，速度常数分别为k1、k2，稳定浓度分别为C1、C2，将Z值定义如下：

Z＝C1/C2＝f1 k2/f2k1„„„ (43)

f1、f2为已知量，求Z的关键是求出k1、k2。先假定已求出Z值，我们采集

的瘤胃内容中两种标记物的浓度之比等于Z时说明采集的样品具有代表性，这样就给出了判断采集样品是否有代表性的标准。

在实际操作中，我们采集的瘤胃内容物一般是没有代表性的，假定所采集瘤胃内容物中两种标记物的浓度分别为CP1、CP2。为了调整所采集瘤胃内容物中标

记物的浓度，可以采用增加或减少瘤胃内容物中液相部分的方法，使调整后瘤胃内容物中两种标记物的浓度比等于Z。为了确定液相部分的增减数量，将一部分采得的瘤胃内容物离心，测定得到液体中的标记物浓度，假定分别为CF1、CF2。如果在总量为x的瘤胃内容物中加入总量为y的液体后，重组的瘤胃内容物中标记物的浓度比为Z，则通过内容物的重组得到了代表性的瘤胃内容物样品（注意：y可以是正值或负值，负值表示需要从瘤胃内容物中减少总量为y的液体）。重组样品的标记物浓度分别为：

C1＝（x CP1＋y CF1）/（x＋y）

C2＝（x CP2＋y CF2）/（x＋y），而且有：

Z＝C1/C2＝（x CP1＋y CF1）/（x CP2＋y CF2）

整理后得：

R＝y/x＝（CP1－Z CP2）/（Z CF2－CF1）„„„(44)

R称为重组因子，含义是从每份瘤胃内容物中增减液体的数量。

重组后样品中的标记物浓度为：

C1＝（CP1＋RCF1）/（1＋R）„„„„„„„„(45)

C2＝（CP2＋R CF2）/（1＋R）„„„„„„„ (46)

至此，我们还有一个关键问题没有解决，即如何求出Z值。由（43）式，只要求出k1、k2即可求出Z值。停止注入标记物，测定标记物在有代表性瘤胃内容

物中的浓度衰减曲线，两种标记物的浓度衰减均符合下式（一室模型衰减方程）：

kit，Bif/Mki„„„ (47) CitBei

其中t是停止注入后的采样时刻。代表性样品中两种标记物的浓度比变化符合以下方程：

ZtB1/B2ek1k2„„„ (48)

在测定标记物浓度衰减曲线时，同样无法得到代表性样品，也就无从通过对

（45）式的数据拟和求出ki。解决的方法有几种，一是测定不同时刻点采集样品

（无代表性）的标记物浓度，按（47）式进行数据拟和，得到的ki值代入（48）

式计算Z(t)，然后由（44）、（45）、（46）式重新计算C(t)，并重新进行数据拟和，通过循环计算逼近真实的Z值（一般经过两次循环计算即可）。方法二是一次投入标记物，用安装十二指肠过桥瘘管的动物测定代表性十二指肠食糜中的浓度衰减。方法三是一次投入标记物，定时采集粪样，将粪样中出现标记物的时刻定位t＝0。方法二、三均需使用不同的动物，拟和公式与（47）的形式相同，此时Bi＝一次投入剂量/M。

1.2 消化道代表性食糜的采集及食糜流通量的测定

测定消化道某一点（通常是十二指肠和回肠安装T型瘘管处）的食糜流通量和在此点采集代表性食糜样品，不存在食糜滞留问题。在标记物浓度达到平衡后，标记物流入该点的速度等于流出的速度，而流入速度等于标记物的注入速度，即有：

fi＝FCi

其中fi为标记物的注入速度，F为该点的食糜流通量，Ci为代表性样品中标

记物的浓度。对于代表性样品，两种标记物按上式计算出的F应相等，因此判断代表性样品的标准是：

f1/C1＝f2/C2，即Z＝C1/C2＝f1/f2

此时Z值可以直接由注入速度求出。重组代表性样品的方法同瘤胃内容物的重组。由重组代表性样品中的标记物浓度，食糜流通量F为：

F＝f1/C1＝f2/C2„„„ (49)

⒉ 试验操作

2.1 标记物：常用固相标记物为钌放射性同位素的邻二氮杂菲络合物（103Ru－phenanthroline，简写为103Ruphe）或镱的放射性同位素169Yb。液相标记物常用51CrEDTA。

2.2 103Ruphe贮备液的制备

⑴ 秤取0.18g KCl，0.25g RuCl3置于250ml圆形烧瓶内，加入5ml蒸馏水溶解。

⑵ 量筒量取36ml 0.2M HCl和40ml乙醇（分析纯）；

⑶ 在有防护设施的实验室中将2mCi的103RuCl3（盐酸溶液）转移到圆形烧瓶中，用量取的HCl冲洗盛103RuCl3的试管，冲洗液转移到烧瓶中。将剩余的0.2M HCl和40ml乙醇转移到烧瓶中。

⑷ 将烧瓶与冷凝器连接，置于沸水浴中回流20min.。

⑸ 取下烧瓶，安装蒸馏装置，将烧瓶与蒸馏装置连接，蒸发烧瓶内的乙醇和部分水分，共计约80ml。该过程约需3－4小时。

⑹ 取下烧瓶，冷却后加盖瓶塞，置于铅板防护的通风厨内静置2天。

⑺ 秤取0.175g 次磷酸钠，溶于2ml水中。秤取0.75g 1,10－邻二氮杂菲备用。 ⑻ 将次磷酸钠溶液和邻二氮杂菲加到烧瓶中，用5M NaOH调整溶液pH值至3－4，回流4小时。回流后的溶液应为橙红色，并有金属Ru的斑点析出。

⑼ 冷却烧瓶，过滤溶液，冲洗滤渣，定容至100ml，铅板防护的通风厨内保存。 ⑽ 操作过程使用的滤纸等固体同位素污染物应在铅制容器内存放数月，使放射强度降至安全水平后再处理。

2.3 51CrEDTA贮备液的制备

⑴ 非标记CrEDTA的制备：秤取14.2gCrCl3.6H2O（含有2.77g Cr），置于烧杯中，用200ml蒸馏水溶解。秤取20g EDTA，用300ml蒸馏水溶解。将两种溶液在圆形烧瓶内混合，沸水浴回流1小时。回流过程中溶液逐渐变为深紫色。

冷却后，用1M CaCl2中和剩余的少量EDTA。1M NaOH调整pH至6－7，定容

至1000ml。2.77g Cr全部与EDTA络合后相当于18.23gCrEDTA。 ⑵ 非标记CrEDTA用于稀释51CrEDTA。稀释后每1mmolCrEDTA中含有1mCi的51CrEDTA。稀释3mCi51CrEDTA需60ml非标记CrEDTA溶液。

2.4 灌注液的制备：灌注液稀释1000倍后测定放射强度。对于绵羊，每天每种标记物的注入剂量约为3106cpm，计算两种的贮备液每天用量，根据注入速度计算每天注入液体总量，将一定量的贮备稀释成灌注液。

2.5 标记物的灌注及采样：动物安装瘤胃、十二指肠、回肠瘘管，自动喂料器饲喂，每小时饲喂一次。蠕动泵连续瘤胃灌注标记物混合溶液，开始灌注前，先启动灌注相当于一天灌注量的两种标记物的贮备溶液。在灌注的第四天开始采集样

品，每天等间隔采集两次，共计约250ml。边搅拌边取一部分样品于离心管中，离心分离样品的液相。取混匀样品及样品的液相各4ml，3个重复测定放射强度。

同位素示踪在脂肪、葡萄糖、矿物质及其它营养物质的代谢研究中均有广泛的应用，在瘤胃微生物蛋白合成研究中也有应用。方法原理大都涉及到室分析、同位素平衡下的周转速度测定等，在此不一一介绍。

(王中华 编著)

参考文献

Wolfe、Robert R，1992, Radioactive and Stable Isotope Tracers in Biomedicine，Principles and Practice of Kinetic Analysis, Wiley-Liss, Inc. Press.