异种动物ig免疫白兔实验设计
1. 器材：
剪刀（剪兔毛用）一把、弯头眼科手术镊子（游离血管用）一把、直头眼科手术剪（剪血管用）一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿（直径18cm）、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。
2. 试剂：
生理盐水(或PBS)，
弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant, FCA） Sigma F-5881， 弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant, FIA) Sigma F-5506， 二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3
3. 兔子的选择：
兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。
4. Pre-bleeding：
抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。取血量约5ml足矣。
免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。
免疫方法可采用背部多点注射法。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射（不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好）。每次免疫的抗原量约100μg。免疫次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。
免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。因为起初几次免疫产生的抗体的效价比较低，头两次取血，够检测用即可。在三次免疫后，可以获得较高效价的抗体，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否则会造成兔子贫血。
最后一次取血可以采用颈动脉放血，具体操作如下：
a.家兔仰卧于兔架上固定头部，用纱布固定四肢。头部略放低以暴露颈部。剃毛
并消毒皮肤；
b.沿颈部中线用手术刀切开皮肤约10cm，分离皮下结缔组织，直至暴露出气管两侧的胸锁 乳突肌（小心操作，如碰到小血管出血，可用止血钳止血） c.用直头止血钳分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉
后用弯头眼科镊使之游离，剥离神经和结缔组织；
d.于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心
端的动脉用血管夹夹住；
e.用小拇指垫在血管下，用尖头眼科手术剪在两根丝线间的动脉璧上剪一小口（勿剪断），插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放
血管滑脱；
f.松开止血钳，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。
5. 血清的分离：
如果用三角瓶或平皿盛血，将器皿倾斜放置于37oC烘箱2hr，转移到4oC
沉淀过夜，第二天早上用吸管吸取血清。如果用离心管收集，37oC烘箱放置2hr，转移到4oC沉淀过夜，第二天早上离心，10000RCF，10分钟。在血清中加入
NaN3 至终浓度0.02%，分装后-20oC保存。
多克隆抗体制备
（一）多克隆抗体制备原理
1．多克隆抗体的概念
多克隆抗体：在含有多种抗原决定簇的抗原刺激下，体内多个 B 细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的单克隆抗体，其混和物为多克隆抗体。机体内所产生多克隆免疫血清实质上是由多种抗体组成的混合物，又称多克隆抗体。
2.多克隆抗体产生原理
初次反应的抗体持续时间较短，亲和力也较低，多无实际应用价值。机体初次接触抗原后，激发体液免疫应答反应。在Mø 和Th 的作用下，B 细胞被激活,增生分化为浆细胞和记忆B 细胞（Bm）。浆细胞产生特异性抗体。由于初次反应时，只有少量对该抗原特异的免疫活性细胞被诱导而增生分化为浆细胞。随着抗原的消耗，抑制T 细胞（Tc）的激活和循环抗体的反馈抑制作用，浆细胞减少，抗体滴度很快下降。
二次反应产生的抗体主要是高亲和力的IgG。
机体再次受同一抗原刺激后，对该抗原特异性的Bm 迅速增殖分化为浆细胞，产生特异性抗体。Th 的记忆细胞也加快反应的进行，在抗原作用1~2 天后，抗体滴度迅速上升。抗体合成率为初次反应的几倍到几十倍。
3. 多克隆抗体制备方法流程
纯化的抗原→与弗氏佐剂一起充分乳化→注射动物体内（剂量，次数，途经等均要适宜）→测定效价（如效价高，则不必加强免疫） → 1 周后经动脉放血→分离血清→纯化抗血清备用。
（二）材料与试剂
1．提取的动物Ig
2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂
3．青霉素和链霉素
4．实验动物 兔
5．其它材料及试剂
（三）操作方法
1．免疫方法 可以采用以下各种方法之一进行免疫。
（1）淋巴结注射法：①在兔的两后足跖部皮下（或皮内）注射活卡介苗50mg（每侧约0.30ml）。7～10天后，兔跖及腘肌淋巴结肿大；②于肿大的两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的IgG乳化抗原0.50ml(含IgG 5mg/ml、青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml)；③必要时，14天后，重复步骤②一次；④再过7天后，于两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的IgG乳化
抗原0.50ml（含IgG5mg/ml、青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml）；⑤5～7天后，耳静脉采血。测定血清效价。
（2）皮下多点注射法：①家兔两侧掌（跖内各注射含有完全佐剂抗原0.10ml（IgG含量5mg/ml）；②7～10天后，脊柱两侧多点（颈、胸、腰椎各两点、共6点）皮下注射含不完全佐剂的抗原，每点0.50ml；③7～10天后，脊柱两侧重复注射一次；④7～10天后试血。不合格者重复步骤③。
（3）多途径联合注射法：①两侧掌（跖）内侧皮下注射含完全佐剂抗原0.50ml（IgG量为5mg/ml）；②14天后，多点皮下注射含有不完全佐剂抗原；③7天后，耳静脉注射不含佐剂的抗原2ml；④测定血清抗体效价，不合格者重复步骤③，并适当递增IgG量。
2．效价测定 采用琼脂扩散法。
⑴ 将血清倍比稀释，加入外周孔。
⑵ 中间孔加动物Ig。
⑶ 37℃湿盒琼扩24小时，观察结果。
（四）结果判定
1．抗Ig的效价测定 琼脂扩散效价达1﹕16或1﹕32者为合格。
2．纯度鉴定 采用琼扩法。中间孔加抗Ig血清，外周孔加Ig和标准品Ig。在抗Ig与Ig以及标准品Ig均出现一条沉淀线，且这两条沉淀线相互融合者，说明提取的Ig是纯的。
多克隆抗体制备原理
1 多克隆抗体的概念
多克隆抗体：在含有多种抗原决定簇的抗原刺激下，体内多个 B 细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的单克隆抗体，其混和物为多克隆抗体。机体内所产生多克隆免疫血清实质上是由多种抗体组成的混合物，又称多克隆抗体。 2 多克隆抗体产生原理
初次反应的抗体持续时间较短，亲和力也较低，多无实际应用价值。机体初次接触抗原后，激发体液免疫应答反应。在Mø 和Th 的作用下，B 细胞被激活,增生分化为浆细胞和记忆B 细胞（Bm）。浆细胞产生特异性抗体。由于初次反应时，只有少量对该抗原特异的免疫活性细胞被诱导而增生分化为浆细胞。随着抗原的消耗，抑制T 细胞（Tc）的激活和循环抗体的反馈抑制作用，浆细胞减少，抗体滴度很快下降。
二次反应产生的抗体主要是高亲和力的IgG。
机体再次受同一抗原刺激后，对该抗原特异性的Bm 迅速增殖分化为浆细胞，产生特异性抗体。Th 的记忆细胞也加快反应的进行，在抗原作用1~2 天后，抗体滴度迅速上升。抗体合成率为初次反应的几倍到几十倍。
（一）抗原的制备与纯化
1 颗粒抗原制备
细胞抗原：自然界中某些细胞组分的抗原性不仅取决于组成它的蛋白分子的一级结构，有时也要求完整的二级结构甚至三级结构。将细胞组分整体分离直接免疫动物会得到事半功倍的效果。
利用细胞个组分质量大小的不同，通过密度梯度离心的方法，在适当的介质中，各组分沉降于离心管内的不同区域，分别收集，即可得到所需组分。
细菌类抗原：细菌类抗原首先应该选好免疫用菌株，在适宜条件下培养增殖，刮取菌苔，经杀菌后稀释成适当浓度作为抗原液。
2 可溶性抗原制备与纯化
可溶性抗原包括蛋白质、多肽、脂蛋白、铁蛋白、类脂、糖蛋白、细菌毒素、酶、补体等均为良好的抗原。为制备特异性高的抗血清一般均需加以纯化。抗原纯化常用的方法：中性盐沉淀法、凝胶过滤层析法、离子交换层析法、免疫吸附亲和层析法。
3 半抗原的免疫原制备法
半抗原：多肽， 甾族激素，药物，脂肪胺，核苷等小分子物质仅能与相应的抗体发生特异性结合反应，而它们本身并不是免疫原，不能刺激机体产生抗体。 半抗原免疫原制备: 将小分子半抗原制备成免疫原通常可用物理吸附方法和化学方法。
物理吸附方法: 通过电荷和微孔吸附半抗原。
物理吸附剂有：碳粉，聚乙 ，葡聚糖硫酸钠，甲基纤维素等。
化学方法: 应用某些功能团试剂把半抗原连接到载体上。
载体: 包括血清蛋白（牛血清白蛋白，甲状腺球蛋白，血蓝蛋白，卵白蛋白以及人工合成的多聚赖酸等。半抗原结合到载体上的数目直接与抗体生成有关，半抗原连接在载体上的数目至少有20 个以上，才能有效地产生抗体。
（二）抗原纯度的鉴定方法
蛋白质抗原纯化以及抗血清制备后均需作纯度鉴定，通常采用的鉴定方法有：
1、醋酸纤维薄膜电泳，此法可以初步鉴定抗原纯度，不需要抗血清，较为方便。
2、SDS-PAGE，是鉴定纯度最为常用的方法，分辨率高，不需要抗血清，可以从样品的泳动率初步了解其分子量。还可以和标准样品相比较，对各电泳区带的物质加以定型。
3、双向琼脂扩散法，是鉴定抗原纯度最为简单的方法，主要是通过各种特异性抗血清鉴定抗原纯度，首先必须有抗体才能用这一方法。
（三）免疫佐剂
1 佐剂的概念和种类
佐剂的概念：佐剂是非特异性的免疫增强剂，有些物质与抗原一起或预先注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型。
佐剂的种类：
1）微生物及其产物：如分枝杆菌（结核杆菌、卡介苗) 短小棒状杆菌、白日咳杆菌、革兰氏阴性菌的内毒素。
2）无机化合物：氢氧化铝、明矾等
3）合成佐剂：如双链多聚肌胞苷酸（polyI:C)
4）油剂：如弗氏佐剂、矿物油、植物油
2 佐剂的生物学作用
增加抗原的免疫原性，使无或微弱免疫原物质变成有效的免疫原；提高抗体的滴度，提高初次免疫应答和再次免疫应答抗体的滴度；改变抗体的类型，由产生IgM 转变成IgG；引起或增强迟发型超敏反应。
3 佐剂的作用机制
① 改变抗原物理性状，延缓抗原降解和排除，延长体内存留的时间，从而更有效的刺激免疫系统；
② 刺激单核巨噬细胞增强其对抗原的处理和递呈能力；
③ 刺激淋巴细胞增生和分化，从而增强和扩大免疫应答的效应。
4 弗氏佐剂
弗氏不完全佐剂（IFA) 石蜡油+羊毛脂
弗氏完全佐剂 (CFA) 石蜡油+羊毛脂+ 卡介苗
抗原和佐剂的比例为 1：1，由于佐剂是油剂，加抗原后要充分混合成乳剂。
（四） 动物的选择
1 动物的种类和种系：供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的免疫应答受动物的遗传基因影响，同一种系的动物对不同抗原的免疫应答和不同种系的动物对同一抗原的免疫应答均不尽相同。抗原的来源与免疫动物的亲缘较远，产生的抗体效价高，同种系或亲缘较近，产生的抗体的效价就差。
2 动物的生理状况：由于个体差异的存在，同一抗原免疫同一种系不同个体的动物，产生的抗体的效价有很大的差异。与动物的年龄和营养状况密切相关。免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。
3 抗血清的需要量：根据实验中抗血清的需要量，选用最经济的动物和免疫动物的只数。一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。
（五）动物的免疫
1 抗原剂量：抗原的免疫剂量应根据抗原的免疫原性强弱、抗原来源难易、动物的种类、免疫周期等来选择抗原剂量。
免疫剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。在一定的范围内，抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。一般情况下，小鼠的首次免疫剂量为50μg～400μg/次，大鼠为100μg～1 000μg／次，家兔为500μg～1 000μg/kg/次，加强剂量为首次剂量的1／2～1／3。
2 注射途径：抗原的进入途径决定了抗原吸收、分布和代谢的速度。吸收越快，分解代谢越快，对机体影响的时间越短。吸收越快，单位时间的有效抗原量就越大，机体的免疫应答就越强，毒副作用也越强。根据免疫应答过程中各阶段的特点，选择注射途径。常用的途径有：静脉、脾脏、淋巴结、腹腔、肌肉、皮下、皮内、掌内、跖内皮下。对抗原吸收的速度：静脉=脾脏=淋巴结>腹腔>肌肉>皮下>皮内>掌内=跖内皮下。基础免疫应选择缓慢吸收的途径，延长抗原刺激时间。 3 加强免疫时间：与抗原的理化性质、剂量、进入途径、机体状况和所处的免疫应答阶段有关。抗原理化性质稳定，吸收分布速度慢或机体处于免疫应答的早期，应延长间隔时间。两次注射的间隔时间应长短适宜,太短起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的敏感作用。一般情况下，第一次加强免疫应在基础免疫后的2~3 周，以后每7~10 天加强一次。加佐剂间隔时间应为2 周左右。注射的Ig 纯度高，则一般不易引起过敏反应，如注射血清，即使是少量，在再次免疫时，极易引起过敏反应，所以一定要采取措施。
4 加强免疫次数：抗原的免疫原性强弱和动物对抗原的敏感性有关。抗原免疫原性弱，需多次加强才能获满意的抗血清。得制备高度特异性的抗血清,可选用低剂量抗原短程免疫法需要获得高效价的抗血清，宜采用大剂。量长程免疫法。免疫周期长者，可少量多次。免疫周期短者，应大量少次。最简单的方法是直接检测血清中的抗体滴度，观察免疫效果。
5 佐剂应用：加佐剂比不加佐剂的注射剂量要小，对家兔而言，采用弗氏完全佐剂，则需注射0.5mg～1mg/kg./次，如采用弗氏不完全佐剂则注射剂量应大10 倍以上。
（六）多克隆抗体制备方法
1 多克隆抗体制备方法流程
纯化的抗原→与弗氏佐剂一起充分乳化→注射动物体内（剂量，次数，途经等均要适宜）→测定效价（如效价高，则不必加强免疫） → 1 周后经动脉放血→分离血清→纯化抗血清备用。
（七）抗血清效价及纯度鉴定
抗血清效价：指抗血清中抗体含量的某一相应的近似值。
抗血清纯度：指只与相应的抗原产生沉淀线，而不与其它血清学无关的抗原物质发生反应。抗血清效价鉴定方法：双向免疫扩散试验、凝集反应。结果判定：根据出现沉淀线的数量和位置来鉴定免疫血清的纯度和效价。
（八）抗血清的纯化和保存
由抗原免疫动物制得的多克隆抗血清是一个非常复杂的复合体。包括了全部血清成分。对于一些试验来说，免疫血清无需纯化即可应用，如用于FACS 分析，大多数ELISA，以及细胞毒试验等。有些试验则要求应用进一步纯化的抗体，如需要精确知道抗体浓度时进行化学修饰标记荧光素时或放射物时，以及制备抗体片段（F（ab’）2，Fab 等）时。抗体存在于抗血清中时，其活性相对稳定。每一次的纯化过程都会使抗体的活性和绝对量损失。因此抗体的纯化要根据实验需要进行，尽量减少不必要的纯化过程。主要纯化方法：中性盐沉淀法、凝胶过滤层析法、离子交换剂层析法、免疫吸附亲和层析法。
免疫血清的保存：制备的抗血清如果保存得当，可数月至数年效价无明显变化。常用的保存方法：⑴ 冰冻保存； ⑵ 冷冻干燥保存； ⑶ 加防腐剂保存； ⑷ 中性甘油保存；
⑸ 除菌保存。
异种动物ig免疫白兔实验设计
1. 器材：
剪刀（剪兔毛用）一把、弯头眼科手术镊子（游离血管用）一把、直头眼科手术剪（剪血管用）一把，手术刀架，手术刀片，注射器(1ml、10ml，25ml)附针头，兔子固定架，灭菌三角烧瓶(200ml)或平皿（直径18cm）、弯头止血钳四把，直头止血钳两把，手术缝合线，塑料放血管，纱布等。
2. 试剂：
生理盐水(或PBS)，
弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant, FCA） Sigma F-5881， 弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant, FIA) Sigma F-5506， 二甲苯，酒精棉，脱脂棉，2% NaN3
3. 兔子的选择：
兔子的重量应在四斤以上，两耳光滑，明显可见耳静、动脉，健康。
4. Pre-bleeding：
抗原注射以前需要收集一些正常血清，已备检测抗体时作为阴性对照。待兔子在新环境中稳定，大概需要四天左右时间，可以进行耳动脉取血。取血量约5ml足矣。
免疫用的抗原必须纯化，否则影响抗体的质量。抗原经FCA或FIA充分乳化后才能注射。将抗原液与佐剂等比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡使抗原充分乳化，乳化过程比较费时、费力，但若乳化不充分，会影响免疫的效果，振荡后，1000rpm离心一分钟，如水相和油相不分层即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。
免疫方法可采用背部多点注射法。即于家兔脊柱两旁选4-6点皮下注射，每点注0.1ml，间隔2周后再于上述部位选不同点注射（不要选择临近位点，否则溃疡愈合不好）。每次免疫的抗原量约100μg。免疫次数在四五次即可，抗原用量大可以减少次数。
免疫一周后，可以耳动脉取血检测抗体效价。因为起初几次免疫产生的抗体的效价比较低，头两次取血，够检测用即可。在三次免疫后，可以获得较高效价的抗体，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否则会造成兔子贫血。
最后一次取血可以采用颈动脉放血，具体操作如下：
a.家兔仰卧于兔架上固定头部，用纱布固定四肢。头部略放低以暴露颈部。剃毛
并消毒皮肤；
b.沿颈部中线用手术刀切开皮肤约10cm，分离皮下结缔组织，直至暴露出气管两侧的胸锁 乳突肌（小心操作，如碰到小血管出血，可用止血钳止血） c.用直头止血钳分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉
后用弯头眼科镊使之游离，剥离神经和结缔组织；
d.于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心
端的动脉用血管夹夹住；
e.用小拇指垫在血管下，用尖头眼科手术剪在两根丝线间的动脉璧上剪一小口（勿剪断），插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放
血管滑脱；
f.松开止血钳，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。
5. 血清的分离：
如果用三角瓶或平皿盛血，将器皿倾斜放置于37oC烘箱2hr，转移到4oC
沉淀过夜，第二天早上用吸管吸取血清。如果用离心管收集，37oC烘箱放置2hr，转移到4oC沉淀过夜，第二天早上离心，10000RCF，10分钟。在血清中加入
NaN3 至终浓度0.02%，分装后-20oC保存。
多克隆抗体制备
（一）多克隆抗体制备原理
1．多克隆抗体的概念
多克隆抗体：在含有多种抗原决定簇的抗原刺激下，体内多个 B 细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的单克隆抗体，其混和物为多克隆抗体。机体内所产生多克隆免疫血清实质上是由多种抗体组成的混合物，又称多克隆抗体。
2.多克隆抗体产生原理
初次反应的抗体持续时间较短，亲和力也较低，多无实际应用价值。机体初次接触抗原后，激发体液免疫应答反应。在Mø 和Th 的作用下，B 细胞被激活,增生分化为浆细胞和记忆B 细胞（Bm）。浆细胞产生特异性抗体。由于初次反应时，只有少量对该抗原特异的免疫活性细胞被诱导而增生分化为浆细胞。随着抗原的消耗，抑制T 细胞（Tc）的激活和循环抗体的反馈抑制作用，浆细胞减少，抗体滴度很快下降。
二次反应产生的抗体主要是高亲和力的IgG。
机体再次受同一抗原刺激后，对该抗原特异性的Bm 迅速增殖分化为浆细胞，产生特异性抗体。Th 的记忆细胞也加快反应的进行，在抗原作用1~2 天后，抗体滴度迅速上升。抗体合成率为初次反应的几倍到几十倍。
3. 多克隆抗体制备方法流程
纯化的抗原→与弗氏佐剂一起充分乳化→注射动物体内（剂量，次数，途经等均要适宜）→测定效价（如效价高，则不必加强免疫） → 1 周后经动脉放血→分离血清→纯化抗血清备用。
（二）材料与试剂
1．提取的动物Ig
2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂
3．青霉素和链霉素
4．实验动物 兔
5．其它材料及试剂
（三）操作方法
1．免疫方法 可以采用以下各种方法之一进行免疫。
（1）淋巴结注射法：①在兔的两后足跖部皮下（或皮内）注射活卡介苗50mg（每侧约0.30ml）。7～10天后，兔跖及腘肌淋巴结肿大；②于肿大的两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的IgG乳化抗原0.50ml(含IgG 5mg/ml、青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml)；③必要时，14天后，重复步骤②一次；④再过7天后，于两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的IgG乳化
抗原0.50ml（含IgG5mg/ml、青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml）；⑤5～7天后，耳静脉采血。测定血清效价。
（2）皮下多点注射法：①家兔两侧掌（跖内各注射含有完全佐剂抗原0.10ml（IgG含量5mg/ml）；②7～10天后，脊柱两侧多点（颈、胸、腰椎各两点、共6点）皮下注射含不完全佐剂的抗原，每点0.50ml；③7～10天后，脊柱两侧重复注射一次；④7～10天后试血。不合格者重复步骤③。
（3）多途径联合注射法：①两侧掌（跖）内侧皮下注射含完全佐剂抗原0.50ml（IgG量为5mg/ml）；②14天后，多点皮下注射含有不完全佐剂抗原；③7天后，耳静脉注射不含佐剂的抗原2ml；④测定血清抗体效价，不合格者重复步骤③，并适当递增IgG量。
2．效价测定 采用琼脂扩散法。
⑴ 将血清倍比稀释，加入外周孔。
⑵ 中间孔加动物Ig。
⑶ 37℃湿盒琼扩24小时，观察结果。
（四）结果判定
1．抗Ig的效价测定 琼脂扩散效价达1﹕16或1﹕32者为合格。
2．纯度鉴定 采用琼扩法。中间孔加抗Ig血清，外周孔加Ig和标准品Ig。在抗Ig与Ig以及标准品Ig均出现一条沉淀线，且这两条沉淀线相互融合者，说明提取的Ig是纯的。
多克隆抗体制备原理
1 多克隆抗体的概念
多克隆抗体：在含有多种抗原决定簇的抗原刺激下，体内多个 B 细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的单克隆抗体，其混和物为多克隆抗体。机体内所产生多克隆免疫血清实质上是由多种抗体组成的混合物，又称多克隆抗体。 2 多克隆抗体产生原理
初次反应的抗体持续时间较短，亲和力也较低，多无实际应用价值。机体初次接触抗原后，激发体液免疫应答反应。在Mø 和Th 的作用下，B 细胞被激活,增生分化为浆细胞和记忆B 细胞（Bm）。浆细胞产生特异性抗体。由于初次反应时，只有少量对该抗原特异的免疫活性细胞被诱导而增生分化为浆细胞。随着抗原的消耗，抑制T 细胞（Tc）的激活和循环抗体的反馈抑制作用，浆细胞减少，抗体滴度很快下降。
二次反应产生的抗体主要是高亲和力的IgG。
机体再次受同一抗原刺激后，对该抗原特异性的Bm 迅速增殖分化为浆细胞，产生特异性抗体。Th 的记忆细胞也加快反应的进行，在抗原作用1~2 天后，抗体滴度迅速上升。抗体合成率为初次反应的几倍到几十倍。
（一）抗原的制备与纯化
1 颗粒抗原制备
细胞抗原：自然界中某些细胞组分的抗原性不仅取决于组成它的蛋白分子的一级结构，有时也要求完整的二级结构甚至三级结构。将细胞组分整体分离直接免疫动物会得到事半功倍的效果。
利用细胞个组分质量大小的不同，通过密度梯度离心的方法，在适当的介质中，各组分沉降于离心管内的不同区域，分别收集，即可得到所需组分。
细菌类抗原：细菌类抗原首先应该选好免疫用菌株，在适宜条件下培养增殖，刮取菌苔，经杀菌后稀释成适当浓度作为抗原液。
2 可溶性抗原制备与纯化
可溶性抗原包括蛋白质、多肽、脂蛋白、铁蛋白、类脂、糖蛋白、细菌毒素、酶、补体等均为良好的抗原。为制备特异性高的抗血清一般均需加以纯化。抗原纯化常用的方法：中性盐沉淀法、凝胶过滤层析法、离子交换层析法、免疫吸附亲和层析法。
3 半抗原的免疫原制备法
半抗原：多肽， 甾族激素，药物，脂肪胺，核苷等小分子物质仅能与相应的抗体发生特异性结合反应，而它们本身并不是免疫原，不能刺激机体产生抗体。 半抗原免疫原制备: 将小分子半抗原制备成免疫原通常可用物理吸附方法和化学方法。
物理吸附方法: 通过电荷和微孔吸附半抗原。
物理吸附剂有：碳粉，聚乙 ，葡聚糖硫酸钠，甲基纤维素等。
化学方法: 应用某些功能团试剂把半抗原连接到载体上。
载体: 包括血清蛋白（牛血清白蛋白，甲状腺球蛋白，血蓝蛋白，卵白蛋白以及人工合成的多聚赖酸等。半抗原结合到载体上的数目直接与抗体生成有关，半抗原连接在载体上的数目至少有20 个以上，才能有效地产生抗体。
（二）抗原纯度的鉴定方法
蛋白质抗原纯化以及抗血清制备后均需作纯度鉴定，通常采用的鉴定方法有：
1、醋酸纤维薄膜电泳，此法可以初步鉴定抗原纯度，不需要抗血清，较为方便。
2、SDS-PAGE，是鉴定纯度最为常用的方法，分辨率高，不需要抗血清，可以从样品的泳动率初步了解其分子量。还可以和标准样品相比较，对各电泳区带的物质加以定型。
3、双向琼脂扩散法，是鉴定抗原纯度最为简单的方法，主要是通过各种特异性抗血清鉴定抗原纯度，首先必须有抗体才能用这一方法。
（三）免疫佐剂
1 佐剂的概念和种类
佐剂的概念：佐剂是非特异性的免疫增强剂，有些物质与抗原一起或预先注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型。
佐剂的种类：
1）微生物及其产物：如分枝杆菌（结核杆菌、卡介苗) 短小棒状杆菌、白日咳杆菌、革兰氏阴性菌的内毒素。
2）无机化合物：氢氧化铝、明矾等
3）合成佐剂：如双链多聚肌胞苷酸（polyI:C)
4）油剂：如弗氏佐剂、矿物油、植物油
2 佐剂的生物学作用
增加抗原的免疫原性，使无或微弱免疫原物质变成有效的免疫原；提高抗体的滴度，提高初次免疫应答和再次免疫应答抗体的滴度；改变抗体的类型，由产生IgM 转变成IgG；引起或增强迟发型超敏反应。
3 佐剂的作用机制
① 改变抗原物理性状，延缓抗原降解和排除，延长体内存留的时间，从而更有效的刺激免疫系统；
② 刺激单核巨噬细胞增强其对抗原的处理和递呈能力；
③ 刺激淋巴细胞增生和分化，从而增强和扩大免疫应答的效应。
4 弗氏佐剂
弗氏不完全佐剂（IFA) 石蜡油+羊毛脂
弗氏完全佐剂 (CFA) 石蜡油+羊毛脂+ 卡介苗
抗原和佐剂的比例为 1：1，由于佐剂是油剂，加抗原后要充分混合成乳剂。
（四） 动物的选择
1 动物的种类和种系：供免疫用的动物主要是哺乳动物和禽类，常选择家兔、绵羊、山羊、马、骡和豚鼠及小鼠等。动物的免疫应答受动物的遗传基因影响，同一种系的动物对不同抗原的免疫应答和不同种系的动物对同一抗原的免疫应答均不尽相同。抗原的来源与免疫动物的亲缘较远，产生的抗体效价高，同种系或亲缘较近，产生的抗体的效价就差。
2 动物的生理状况：由于个体差异的存在，同一抗原免疫同一种系不同个体的动物，产生的抗体的效价有很大的差异。与动物的年龄和营养状况密切相关。免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，雌性动物特别是妊娠动物用于制备免疫抗体则非常不合适，有时甚至不产生抗体。
3 抗血清的需要量：根据实验中抗血清的需要量，选用最经济的动物和免疫动物的只数。一般实验室采用的抗体，多用兔和羊制备。
（五）动物的免疫
1 抗原剂量：抗原的免疫剂量应根据抗原的免疫原性强弱、抗原来源难易、动物的种类、免疫周期等来选择抗原剂量。
免疫剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。在一定的范围内，抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。一般情况下，小鼠的首次免疫剂量为50μg～400μg/次，大鼠为100μg～1 000μg／次，家兔为500μg～1 000μg/kg/次，加强剂量为首次剂量的1／2～1／3。
2 注射途径：抗原的进入途径决定了抗原吸收、分布和代谢的速度。吸收越快，分解代谢越快，对机体影响的时间越短。吸收越快，单位时间的有效抗原量就越大，机体的免疫应答就越强，毒副作用也越强。根据免疫应答过程中各阶段的特点，选择注射途径。常用的途径有：静脉、脾脏、淋巴结、腹腔、肌肉、皮下、皮内、掌内、跖内皮下。对抗原吸收的速度：静脉=脾脏=淋巴结>腹腔>肌肉>皮下>皮内>掌内=跖内皮下。基础免疫应选择缓慢吸收的途径，延长抗原刺激时间。 3 加强免疫时间：与抗原的理化性质、剂量、进入途径、机体状况和所处的免疫应答阶段有关。抗原理化性质稳定，吸收分布速度慢或机体处于免疫应答的早期，应延长间隔时间。两次注射的间隔时间应长短适宜,太短起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的敏感作用。一般情况下，第一次加强免疫应在基础免疫后的2~3 周，以后每7~10 天加强一次。加佐剂间隔时间应为2 周左右。注射的Ig 纯度高，则一般不易引起过敏反应，如注射血清，即使是少量，在再次免疫时，极易引起过敏反应，所以一定要采取措施。
4 加强免疫次数：抗原的免疫原性强弱和动物对抗原的敏感性有关。抗原免疫原性弱，需多次加强才能获满意的抗血清。得制备高度特异性的抗血清,可选用低剂量抗原短程免疫法需要获得高效价的抗血清，宜采用大剂。量长程免疫法。免疫周期长者，可少量多次。免疫周期短者，应大量少次。最简单的方法是直接检测血清中的抗体滴度，观察免疫效果。
5 佐剂应用：加佐剂比不加佐剂的注射剂量要小，对家兔而言，采用弗氏完全佐剂，则需注射0.5mg～1mg/kg./次，如采用弗氏不完全佐剂则注射剂量应大10 倍以上。
（六）多克隆抗体制备方法
1 多克隆抗体制备方法流程
纯化的抗原→与弗氏佐剂一起充分乳化→注射动物体内（剂量，次数，途经等均要适宜）→测定效价（如效价高，则不必加强免疫） → 1 周后经动脉放血→分离血清→纯化抗血清备用。
（七）抗血清效价及纯度鉴定
抗血清效价：指抗血清中抗体含量的某一相应的近似值。
抗血清纯度：指只与相应的抗原产生沉淀线，而不与其它血清学无关的抗原物质发生反应。抗血清效价鉴定方法：双向免疫扩散试验、凝集反应。结果判定：根据出现沉淀线的数量和位置来鉴定免疫血清的纯度和效价。
（八）抗血清的纯化和保存
由抗原免疫动物制得的多克隆抗血清是一个非常复杂的复合体。包括了全部血清成分。对于一些试验来说，免疫血清无需纯化即可应用，如用于FACS 分析，大多数ELISA，以及细胞毒试验等。有些试验则要求应用进一步纯化的抗体，如需要精确知道抗体浓度时进行化学修饰标记荧光素时或放射物时，以及制备抗体片段（F（ab’）2，Fab 等）时。抗体存在于抗血清中时，其活性相对稳定。每一次的纯化过程都会使抗体的活性和绝对量损失。因此抗体的纯化要根据实验需要进行，尽量减少不必要的纯化过程。主要纯化方法：中性盐沉淀法、凝胶过滤层析法、离子交换剂层析法、免疫吸附亲和层析法。
免疫血清的保存：制备的抗血清如果保存得当，可数月至数年效价无明显变化。常用的保存方法：⑴ 冰冻保存； ⑵ 冷冻干燥保存； ⑶ 加防腐剂保存； ⑷ 中性甘油保存；
⑸ 除菌保存。