胚胎干细胞培养方法研究进展

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广东医学２０１０年１月第３ｌ卷第１期

ＧｕａｎｇｄｏｕｇＭｅｄｉｃａｌ

Ｊｏｕｒｎａｌ

Ｊａｎ．２０１０，Ｖ０１．３１，Ｎｏ．１

？综述・。讲座ｉ

胚胎干细胞培养方法研究进展宰

吴静，胡东，张荣渡△

安徼理工大学医学院（安徽淮南２３２００１）

胚胎干细胞（ＥＳＣ）是一种永生化细胞，在适宜培养条件下具有永久的自我更新能力并维持未分化状态、高端粒酶活生物学平台，用于多方面的科学研究与临床应用。如药物筛（ＦＥＥＤＥＲ）上，基本培养基多为ＤＭＥＭ并添加胎牛血清源血清成分及病原体等干扰，在满足促进ＥＳＣ分裂增殖及ＦＥＥＤＥＲ对ＥＳＣ自我更新及全能性的维持起重要作用。

了来自于ＩＣＭ（内细胞群）的ｍＥＳＣ，具有正常核型、多分化・安徽省高等学校青年教师科研资助计划（编号：２００８ｊｑｌ０４２）△通信作者。教授，硕士研究生导师；电话：０５５４—６６４９０８４；Ｅ—

万方数据

病毒及其他已知或未知的病原体，若将这些ＥＳＣ用于临床治疗，可能给患者带来巨大危险口Ｊ。

人源性细胞可作为ｈＥｓｃ的饲养层细胞，如人胚胎成纤维细胞及人皮肤成纤维细胞等。通过广泛筛选，可在一定程度上避免病原体的污染。从而保证供者的饲养层细胞的安全性。由于胎盘的高效屏障作用，人胎盘成纤维细胞制备的饲养层可大大减少病原体污染可能性。更为理想的方案是用人ＥＳＣ分化出成纤维样细胞并体外扩增，将这些成纤维样细胞作为ＥｓＣ的饲养层，这样既保证了饲养层与Ｅｓｃ间的同源性，又避免了外源性病原体的引入。这种培养体系下的ｈＥＳＣ能长期维持ＥＳＣ的生长特征，保持向三胚层分化的潜能、无限未分化增殖能力及正常的核型。这个方案存在的问题是原代ｈＥＳＣ的培养仍然需要非同源性饲养层的支持。除了应用最为广泛的成纤维细胞，饲养层细胞还可以为子宫上皮细胞（ＵＥ）、大鼠肝细胞（ＢＲＬ）、人包皮成纤维细胞、脾细胞等。在源于囊胚期的斑马鱼ＥＳＣ（ｚＥＳＣ）培养中，ＦＡＮ等Ｈ１采用生长停止的彩红鳟鱼脾细胞（ＲＴＳ３４ｓｔ）为饲养层．能维持ｚＥＳＣ的未分化状态，碱性磷酸酶及ＳＳＥＡ—ｌ阳性。

然而，ＦＥＥＤＥＲ细胞的介入除了会导致异源物质、病原体等缺点，还会对ＥＳｃ生长、增殖度分化等研究造成限制．因为在饲养层培养体系中，很多数据都来源于饲养层细胞与ＥＳＣ时某种刺激或处理的共同反应。２００５年ＢＩＧＤＥＬＩ等＂Ｊ

构建了无ＦＥＥＤＥＲ无ｍａｔｒｉｘ的培养体系，将ＦＥＥＤＥＲ支持培

养的ｈＥＳＣ（ＳＡｌ６７ＭＦＧ与ＡＳ０３４．１ＭＦＧ细胞系）转移到人胚胎肺成纤维细胞（ｈＳＬ）来源的ｃＭ（舍有２０％ＳＲ）中，就能使其在塑料培养瓶表面未分化生长，保持其多潜能性及正常核型，表达ＯＣＴ一４、ｓｓＥＡ一３、ＳｓＥＡ一４、ＴＲＡ—ｌ一６０及ＴＲＡ一１—８１等ｈＥＳＣ特征标志，并且可冷冻保藏，大大简化了ｈＥＳＣ培养、传代、保存的过程。

将ＥＳＣ培养液加到铺有ＦＥＥＤＥＲ的平皿中，定时收集

培养液，即为条件培养基。来自于ＭＥＦ饲养层的ＣＭ内舍有已鉴定的蛋白种类约为１３６种及其他未知的蛋白，其功能包括参与细胞的生长与分化、细胞外基质的形成与重塑等。

由此可见。ＦＥＥＤＥＲ提供的大量分子对维持ＥＳＣ的自我更新

及分裂增殖的机制是十分复杂的。可能也是其他培养条件所不能比拟的。细胞外基质是由复杂的分子成分所构成的三维结构。除了纤维粘连蛋白、胶原、糖蛋白、透明质酸、蛋白聚糖等基本结构成分。还需要有激素及生长因子等功能调节分子，如ＩＬ一６对ｍＥＳＣ多能性的维持有重要作用，ＦＧＦ（成纤维细胞生长因子）可支持ｈＥＳＣ的未分化生长。ＣＭ一方面避免了ＦＥＥＤＥＲ与ＥＳＣ的共同培养。另一方面又收获了较多由ＦＥＥＤＥＲ提供的复杂重要因子，从而维持Ｅｓｃ的增殖及全能性。然而，目前ＣＭ仍然需要通过ＦＥＥＤＥＲ的培养，

性、正常核型、胚胎表面标志及多潜能转录因子的表达，如ＳＳＥＡ、ＯＣＴ－４、Ｎａｎｏｇ等。ＥＳＣ被认为可以提供一种理想的选平台的建立、细胞发育与分化的分子调节机制研究、基因靶向敲除动物模型的构建、组织工程种子细胞及基因治疗载体的建立、细胞治疗及再生医学等。选择最优化的细胞培养基对于ＥＳＣ的研究及临床应用是至关重要的。一个合格的ＥＳＣ培养基的首要条件为促进Ｅｓｃ的永久性分裂增殖及维持Ｅｓｃ的未分化状态，前者是对ＥＳＣ数量上的要求，后者是对功能的保证。为满足这２个条件，已建立有很多的标准方法，一般要求ＥＳＣ生长在有丝分裂失活的饲养层细胞（ＦＣＳ）及白血病抑制因子（ＬＩＦ）等。另外，为了排除不明外维持其全能性的基础之上，又尝试及建立了其他培养基，包括条件培养基（ＣＭ）、无饲养层、无血清、血清替代物（ＳＲ）非务件培养基等。

ｌ饲养层细胞

其机制仍未完全阐明，很大程度上与饲养层所提供的细胞接触及复杂的蛋白分子环境有关。小鼠胚胎成纤维细胞（ＭＥＦ）不仅可用来作为小鼠ＥＳＣ的饲养层细胞，也可支持人ＥＳＣ的增殖。１９８１年ＥＶＡＮＳ等…采用丝裂霉素ｃ灭活的ＳＴＯ成纤维细胞作为饲养层，在添加有１０％ＦｃＳ及ｌＯ％新生小牛血清（ＮＢＣＳ）的Ｄｕｌｂｅｃｃｏ＇ｓ基础培养基中成功培养潜能。１９９８年ＴＨＯＭＳＯＮ等怛１在ＭＥＦ饲养层上成功培养了ｈＥｓｃ，具有高水平端粒酶活性、表达原始ＥＳＣ表面标志［包括阶段特异性胚胎抗原（ＳＳＥＡ）一３、ＳＳＥＡ一４、ＴＲＡ—ｌ一６０、ＴＲＡ一１—８１及碱性磷酸酶（ＡＰ）］、具有向三胚层分化的潜能。饲养层目前仍为最常用的培养ＥＳＣ方法。常用的ＭＥＦ包括小鼠成纤维细胞株（ＳＴＯ）、原代小鼠胎儿成纤维细胞（ＰＭＥＦ）等，然而这些具有活性的外源性细胞，一方面作为异种抗原会影响ｈＥＳＣ的正常生长与增殖，若发生细胞问融合则会引起ＥＳＣ表达异源性抗原，这将给ｈＥＳＣ的临床移植治疗带来免疫排斥反应，如用ＭＥＦ饲养层联合ＳＲ作为培养基时，ｈＥＳｃ会表达异源性的糖类Ｎ一乙酰神经氨酸（ＮｅｕＳＣ，ｃ）；另外也会增加对ＥＳＣ的污染，如动物源性逆转录

２条件培养基

ｍａｉｌ：１００４５６＠１２６．ｃｏｒｎ

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ＭｅｄｌｉｃａｉＪｏｕｒｎａｌ

Ｊａｎ．２０１０。Ｖ０１．３１。Ｎｏ．１

才能收获复杂的能维持ＥＳＣ生长与增殖的因子，而这种复杂性给ＥＳＣ生长、发育及分化的确切分子机制研究带来极大限制，也不能保证每一批收获的ｃＭ之间的均一性、依然有来自于ＦＥＥＤＥＲ的异源性及病原体污染危险。

３血清

ＦＣＳ或ＦＢＳ是细胞培养中最为常用的血清，能提供大量至今仍未完全明确的因予以促进细胞的生长．另外极低的抗体水平可减少对培养细胞的免疫攻击作用。目前用于临床治疗的ｈＭＳＣ大多数仍须培养于添加有ＦＢＳ的培养基中。具有正常的形态、表型及分化潜能，移植过程中并未显示明显的不良反应。ＦＣＳ含有的小分子生物活性因子能抑制线粒体膜的凋亡及半胱天冬氨酸酶一３（Ｃ勰ｐａｓｅ一３）的活化，减弱了细胞凋亡信号，因而对神经细胞具有保护功能；另外还存在细胞分化抑制因子，如抑制淋巴细胞亚型的增殖，可在同种异型细胞移植中起到抑制移植免疫排斥反应的作用。

然而对于ｈＥｓｃ的培养，ＦＣＳ仍是一种外源性物质。会造成Ｅｓｃ表迭异源糖蛋白及多聚脂糖【“。动物来源血清存在种问异源性、潜在病原体等问题，给ＥＳＣ的培养与临床应用带来不便。自身同源血清能促进体外培养的ｈＭＳＣ的增殖，维持其多向分化潜能，提高其一临床移植治疗的效果。但也会引起复制能力减弱、端粒缩短等现象，导致ｈＭＳＣ的体外生命周期变短，另外自身同源血清还存在数量上的局限性。尤其对于衰弱、消耗性患者。血清与血浆在组成上明显不同。后者可能因含有大量的血小板而对ｈＭＳＣ的培养更为有利。研究显示新鲜冷冻血浆与血小板、血小板溶解物、血小板释放上清能够替代ＦＣＳ作为一种有效且安全的培养基添加物，促进ｈＭＳＣ体外扩增及迁移能力、抑制免疫原性、维持向成骨细胞、软骨形成细胞及脂肪细胞分化的潜能。与ＦＣＳ相比，同种异源富含血小板的血浆具有更强的促进体外ｈＭＳＣ增殖能力（累积群体倍增数：６８．１哪２４．４）、维持向脂肪细胞

及成骨细胞分化潜能、保持ＭＳＣ标拶“。

已有研究显示无血清的培养体系也能使ＩＩＥＳＣ保持正常核型、表达多潜能标志，体外培养可向三胚层细胞分化，接种动物能形成畸胎癌的能力。ＡＭＩＴ等¨ｏ采用ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ包被培养板、添加有１５％ＳＲ及生长因子的基础培养基构成了无ＦＥＥＤＥＲ无血清的培养体系。支持ｈＥＳＣ未分化长期培养到５０代。脐血来源的ＭＳＣ在无血清培养中也能增殖，并保留向软骨细胞、脂肪细胞及成骨细胞系分化潜能，培养基中须添加有高葡萄糖、ｂＦＧＦ、人白蛋白、皮质醇及ＳＩＴＥ（硒酸钠、牛胰岛素、人转铁蛋白及乙醇胺）等因子。血清中很多因子对Ｓｃ的生长与分化起着相当微妙的作用，若将ＭＳＣ培养于无细胞因子及生长因子的ａ～最低基础培养基中，将可以分离出具有祖细胞特征的ＭＳＣ亚型，与培养于Ｆｃｓ培养基中的ＭＳＣ相比，这些细胞显示更长的端粒、ＯＣＴ一４及其他胚胎细胞特征基因的更高表达【９】。另一方面，无血清培养基也会给干细胞的生长带来阻碍，可能与某些生长因子的缺乏而诱导ｃａｓｐａｓｅ凋亡途径有关¨…。

为解决明确培养基成分、避免异源物质及潜在病原体等问题，目前较为理想的培养基采用成分明确的基础培养基并添加ＳＲ及能促进细胞增殖并维持未分化状态的相关因子。虽然含血清替代物或舍血清的培养基都可以维持ＥＳＣ的未分化生长，但是两者对ＥＳＣ的影响仍有较大差别。虽然在

万方数据

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不同的培养系统中ＥＳＣ可以在通常的干细胞标志上表现一致，但是在细胞表型上可能已发生了巨大改变。包括在基因表达程度上的差异，因此确定最优化的ＥＳＣ培养基，还应对ＥＳＣ基因表达的改变进行监测¨们。ＡＭＩＴ等【８１采用ｆｉｂｒｏｎｅ－ｃｔｉｎ联合添加有１５％ＳＲ、ＴＧＦｐｌ、ＬＩＦ、ＦＧＦ的培养基代替传统的ＦＥＥＤＥＲ联合血清的培养体系。完成了ｈＥＳＣ的长期来分化培养，表现为维持向三胚层代表性组织分化潜能、无限的未分化增殖能力及正常的核型。

４细胞因子

ＥＳＣ要维持多潜能性及低免疫原性的大规模体外增殖培养，除了要求血清的质量外，还包括其他培养因素的优化。如基础培养基、葡萄耱含量、谷氨酰胺稳定性、细胞接种密度及传代密度、培养板表面质量及重要细胞因子的添加等…。一些细胞因子已被证实在维持干细胞全能性、未分化增殖方面有重要作用，ｂＦＧＦ是最通常的ＭｓＣ培养基添加物，能极大地提高细胞增殖能力，同时上调ＨＬＡＩ类分子、抑制ＨＬＡ—ＤＲ分子的表达，但对Ｍｓｃ的分化潜能亦有影响，如有助于向成骨细胞系而抑制向神经细胞分化。在无ＦＥＥＤＥＲ无血清的培养体系中。需要加ＴＧＦＩＳＩ、ｂＦＧＦ、ＬＩＦ等才能维持ｈＥＳＣ的未分化增殖¨Ｊ。ＵＦ能维持ｍＥＳＣ的未分化状态…。却不能阻止ｈＥＳＣ的分化。ＬＩＦ通过与异源二聚体受体及ｇｐｌ３０结合激活ＪＡＫ／Ｓｔａｔ３信号通路，活化的Ｓｔａｔ３可以维持ｍＥＳＣ的长期自我更新能力、胚胎克隆形成能力，表达未分化表型特征。骨形成蛋白（ＢＭＰ）显示抑制Ｅｓｃ向神经系统分化的作用，单独的ＢＭＰ可促进ＥＳＣ向非神经系统分化，不具有抑制ＥＳＣ分化的功能。但若将ＢＭＰ与ＬＩＦ联合。剧显示抑制ＥＳＣ分化的功能，支持ＥＳＣ的自我更新。ＧＤＦ一６（ＢＭＰ相关生长与分化因子）联合ＬＩＦ同样能支持ＥＳＣ的自我更新，进一步提示了ＢＭＰ在支持ＥＳＣ未分化增殖中的作用。添加有ＵＦ与ＢＭＰ的基础培养基同样可以支持ｍＥＳＣ的未分化增殖。说明Ｎ２与Ｂ２７并非是支持ＥＳＣ自我更新的必要成分ｆｌＩ】。

ｂＦＧＦ可激活ｂＥＳＣ表达中胚层如Ｍｕｓｌｅ—ＥＮＯＬＡＳＥ（肌肉烯醇化酶）、Ｂｏｎｅ—ＣＭＰ（骨髓软骨基质蛋白）、Ｋｉｄｎｅｙ—ＲＥＮＩＮ（肾素）、Ｈｅａｒｔ—ｔＡＣＴ（心肌动蛋白）、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ一８ＧＬＯＢＩＮ（造血８珠蛋白）及外胚层标志（如脑神经微丝重链蛋白、皮肤角蛋白）。虽然研究显示ｂＦＧＦ能抑制ＢＭＰ信号途径，但其支持ｌｌＥＳＣ未分化增殖的机制仍未清楚。ＴＧＦＤＩ是ＴＧＦＢ超家族成员之一，可存在于基质胶或条件培养基中”Ｊ。能诱导ｈＥＳＣ表达中胚层标志（如肌肉烯醇化酶、

心肌动蛋白）。依据培养环境及细胞发育阶段的不同，

ＴＧＦｐＩ会对造血系统的增殖、分化及死亡产生不同的影响。

寻找最佳培养条件的最终目的是获得最优的ＥＳＣ，然而最优的ＥＳＣ的评价标准往往跟其目的相关。因此，我们的努力方向改为寻找最适合的ＥＳＣ更为实际。例如，若用于临床移植治疗，则要求ＥｓＣ具有足够的增殖能力、易于向目标细胞分化的潜能、较低的免疫原性及安全性，这类细胞的培养条件要求无动物源性的ＦＥＥＤＥＲ、血清等异源物质，可避免免疫原性及病原体感染问题，但可能限制ＥＳＣ的增殖及分化能力。若用于研究早期胚胎发育，ＥＳＣ需具有早期的发育特征．包括增殖能力、细胞周期调节、基因表达及对发育信号的反应能力、多向分化潜能。适于临床治疗的ＥＳＣ有

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ＭｅｄｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ

Ｊａｎ．２０１０。Ｖ０１．３１．Ｎｏ．１

可能其增殖及分化能力有限，而适于发育学研究的ＥＳＣ易ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃａｃｉｄｘｅｎｏａｎｔｉｇｅｎｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ

ｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃ

携带异源物质，培养条件要根据不同目的加以选择。除了满ａｎｄ

ｍｅ∞ｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｉｌｓｉｓ

ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ

ｒｅｖｅｌｓｉｂｌｅ［ｊ】．Ｓｔｅｍ

足适合ＥＳＣ的生长需要，最优化的培养系统还需要其明确ｃｅｌｌｓ，２００７，２５（１）：１９７—２０２．组成成分，以便于在多个实验室重复开展，需要明确培养基［７］ＫＯＣＡＯＥＭＥＲ

Ａ，ＫＥＲＮ

Ｓ，ＫＬＵＥＴＥＲＨ，ｅｔ

ａ１．Ｈｕｍａ．ｑ

ＡＢ一

质、培养基成分、重组蛋白因子的种类、传代培养的密度与时￥ｅｒｕｎｌ∞ｗｅｌｌ∞ｔｈｒｏｍｂｉｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｐｌａｔｅｌｅｔ—ｒｉｃｈ—ｐｌａｓｍａ

ａＩ℃

ｓｕｉｔａｂｌｅａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ

ｔｏ

ｆｅｔａｌｃａｌｆ８ｅｒｌｌｍｆｏｒｔｈｅ间：另外，ＥＳＣ的来源、胎胚获取方式、甚至培养瓶的材质等，ｅｘｐａｎｓｉｏｎｏｆ

ｌｎｅ目｛ＩＩ－

ｃｈｙＩＩ“ｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍ这些因素都可能在一定程度对研究结果产生影响。ａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］．Ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２００７，２５

（５）：１２７０—１２７８．参考文献

［８］

ＡＭＩＴ

Ｍ．ＳＨＡＲＩＫＩ

Ｃ，ＭＡＲＧＵＬＥＴＳＶ，ｅｔ

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ＥＶＡＮＳ

Ｍ

Ｊ，ＫＡＵＦＭＡＮＭ

Ｈ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｉｎｃｕｈｕｒｅ

ｏｆｐｌｕｒｉ－

ａｎｄｓｅｌⅢｎ—ｆｒｅｅ

ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｈｕｍａｎ

ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍ

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Ｊ

Ｒ。ＹＬＯＳＴＡＬＯ

Ｊ，ｅｔａ１．Ｓｅｒｕｍ

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ＥＬＤＯＲ

Ｊ，ＳＡＰＨＩＲＯＳＳ，ｅｔ

ａ１．

ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｍａｒｒｏｗｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ（ｈＭＳＣｓ）ｓｅｌｅｃｔｓ

ｆｏｒ

ａ

Ｅｍｂｒｙｏｍｃ

ｓｔｅｍｃｅｌｌ

ｌｉｎｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎ

ｂｌａｓｔｅｅｙｓｔｓ［Ｊ］．ｓｃｉ－

ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ

ｏｆｅａｒｌｙｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｔｓｗｉｔｌＩｅｎｈａｎｃｅｄ

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Ｓｅｌａｌｍｄｅｐｄｖａ－

［４］ＦＡＮＬ，ＣＲＯＤＩＡＮＪ，ＣＯＬＬＯＤＩ

Ｐ．Ｃａｌｔｕｒｅｏｆ

ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ

ｓｔｍ

ｃｅｌｌ

ｔｉｏｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ

ａｐｏｐｔｏｓｉｓ

ｉｎ

ｍｏｓｅｎｃｈｙｍａｌ

ｓｔｅｍ

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［５］

ＢＩＧＤＥＬＩ

Ｎ，ＡＮＤＥＲＳＳＯＮ

Ｍ，ＳＴＲＥＨＬＲ，ｅｔａ１．Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ

ｏｆ［１１］ＹＩＮＧＱ

Ｌ，ＮＩＣＨＯＬＳ

Ｊ。ＣＨＡＭＢＥＲＳＩ，ｅｔ

ａ１．ＢＭＰｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆ

ｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃ

ｓｔｅｍｃｅｉｌｓ

ｔｏ

ｆｅｅｄｅｒ—－ｆｒｅｅａｎｄ

ｍａａ－ｉｘ—－ｆｒｅｅ

ｃｕｌ・・

Ｉｄ

ｐｒｏｔｅｉｎｓ

ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ

ａｎｄｓｕｓｔａｉｎｓ

ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ

ｓｔｅｍ

ｔＵｒｅ

ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

ｄｉｒｅｃｔｌｙｏｎ

ｐｌａｓｔｉｃｓｕｒｆａｃｅｓ【】］．Ｊ

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。

ｃｅｌｌｓｅｌｆ—ｒｅｎｅｗａｌｉｎｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎｗｉｔｈ

ＳＴＡＴ３【Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００３。

２００８，１３３（１）：１４６—１５３．１１５（３）：２８Ｉ一２９２．

［６］ＨＥＩＳＫＡＮＥＮ

Ａ，ＳＡＴＯＭＡＡＴ，ＴＩＩＴＩＮＥＮＳ，ｅｔ８１．Ｎ—ｇｌｙｃｏｌｙｌ－

（收稿日期：２００９—０５—１７编辑：王冰）

以ＭＡＰＫ通路为靶向的肿瘤生物治疗宰

王伟飞▲，王新颖△，姜泊△

南方医科大学南方医院消化科（广州５１０５１５）

丝裂原激活蛋白激酶（ｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ．

活、迁移以及肿瘤侵袭能力方面有重要的调节作用，主要参ＭＡＰＫ）是一组被不同的细胞外刺激（如生长因子、细胞因与各种生长因子、细胞因子、丝裂原以及激素受体活化后的子、激素、药物及细胞应激等）激活的丝氨酸一苏氨酸蛋白激信号转导，参与多种肿瘤细胞的生存和增殖…。

酶。ｔＪ。ＭＡＰＫ通路的基本组成是一种从酵母到人类都保守ＥＲＫｌ／２通路的ＭＡＰＫＫＫ，即Ｒ丑ｆ激酶，是４０一７５ｋＤ的

的ＭＡＰＫ激酶激酶（ＭＡＰＫＫＫ）、ＭＡＰＫ激酶（ＭＡＰＫＫ）及Ｓｅｒ／Ｔｈｒ蛋白激酶，有Ｒａｆ—ｌ（ｃ一蹦）、Ａ—Ｒａｆ和Ｂ—Ｒａｆ

ＭＡＰＫ三级激酶模式。在真核细胞中，已确定出细胞外信号３个同型异构体，其分布具有组织特异性，Ａ—Ｒａｆ和Ｂ—Ｒａｆ调节蛋白激酶（ｅｘｔｒａｅｅｌｌｕｌａｒ

ｓｉｇｎａｌ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ．

主要分布于泌尿生殖和神经组织，而Ｒａｆ—ｌ则广泛表达于ＥＲＫ）、ｐ３８、Ｃ—Ｊｕｎ氨基末端激酶（ｃ—ＪｕｎＮ—ｔｅｒｍｉｎａｌＫｉ．

各种组织中ＨＪ。Ｒａｆ激酶特异性地磷酸化并激活ＭＡＰＫＫｎａｓｅ，ＪＮＫ）和ＥＲＫＳ／ＢＭＫＩ（ｂｉｇ

ＭＡＰ

ｋｉｎａｓｅ）４个ＭＡＰＫ亚

（ＭＥＫｌ／２）。ＭＥＫＩ和ＭＥＫ２蛋白分子量分别为４４ｋＤ和

族。ＭＡＰＫ通路与细胞的增殖和凋亡密切相关．对肿瘤的生

４５

ｋＤ，属于少有的双重特异性蛋白激酶（ｄｕａｌｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ

Ｐ

长增殖起至关重要的作用…。ＭＡＰＫ通路在大肠癌等多种

ｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅ），既为Ｔｙｒ蛋白激酶，又为Ｓｅｒ／Ｔｈｒ蛋白激酶。

恶，ｌ生肿瘤中过度激活，以ＭＡＰＫ通路激酶为靶点来阻断增殖ＭＥＫｌ／２激活ＥＲＫＩ和ＥＲＫ２ＭＡＰｌ（８。ＥＲＫｌ／２一旦被活化。信号的传递，为肿瘤的个体化治疗带来新的希望呤Ｊ。

胞浆中的一部分转位至细胞核，然后，通过核转录因子的磷１

附一ＭＥＫ—ＥＲＫ通路

酸化作用来调节基因表达，细胞膜、细胞核、细胞骨架及内膜Ｒｄ—ＭＥＫ—ＥＲＫ通路，即ＥＲＫＩ／２通路，是ＭＡＰＫ通路

系统的多种功能都受其影响Ｌ４Ｊ。

中最早被发现的最经典的一个亚族。它在细胞的分裂、存

Ｒａｆ激酶的上游激活分子是Ｒａｓ小ＧＴＰ酶，两者常以复

合物形式存在，Ｒａｓ催化胞浆中的附激酶重新定位于细胞

・国家自然科学基金资助项目（编号：３０９７１５２０）

膜内侧，Ｒａｆ激酶一旦与胞膜的脂质层结合即暴露出其功能▲现工作单位：南方医科大学第三附属医院消化科（广州５１０６３０）区，进一步被ＥＧＦＲ或Ｓｒｃ等分子激活ｐ１。ＥＧＦＲ在包括大△通信作者。王新颖，主治医师，电话：０２０一６１６４２２５６，Ｅ—ｍａｉｌ：肠癌在内的多种肿瘤中高表达，而Ｒａｓ和Ｂ—Ｒａｆ在结肠癌、ｓｕｎｗｉｎｇｗｘｙ＠１６３．ｅｏｍ；姜泊，教授，电话：０２０—６１６４１５４１，Ｅ—ｍａｉｌ：胰腺癌等多种肿瘤中发生突变，最终导致ＥＲＫ通路在肿瘤ｄＩｊｉａｎｇ＠１６３．ｔｏｍ

组织中持续激活。由此可见，以ＥＲＫ通路为靶点，阻断其激

万方数据

胚胎干细胞培养方法研究进展

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：引用次数：

吴静， 胡东， 张荣波

安徽理工大学医学院,安徽淮南,232001广东医学

GUANGDONG MEDICAL JOURNAL2010，31(1)0次

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下载时间：2010年6月13日

・１１６・

广东医学２０１０年１月第３ｌ卷第１期

ＧｕａｎｇｄｏｕｇＭｅｄｉｃａｌ

Ｊｏｕｒｎａｌ

Ｊａｎ．２０１０，Ｖ０１．３１，Ｎｏ．１

？综述・。讲座ｉ

胚胎干细胞培养方法研究进展宰

吴静，胡东，张荣渡△

安徼理工大学医学院（安徽淮南２３２００１）

胚胎干细胞（ＥＳＣ）是一种永生化细胞，在适宜培养条件下具有永久的自我更新能力并维持未分化状态、高端粒酶活生物学平台，用于多方面的科学研究与临床应用。如药物筛（ＦＥＥＤＥＲ）上，基本培养基多为ＤＭＥＭ并添加胎牛血清源血清成分及病原体等干扰，在满足促进ＥＳＣ分裂增殖及ＦＥＥＤＥＲ对ＥＳＣ自我更新及全能性的维持起重要作用。

了来自于ＩＣＭ（内细胞群）的ｍＥＳＣ，具有正常核型、多分化・安徽省高等学校青年教师科研资助计划（编号：２００８ｊｑｌ０４２）△通信作者。教授，硕士研究生导师；电话：０５５４—６６４９０８４；Ｅ—

万方数据

病毒及其他已知或未知的病原体，若将这些ＥＳＣ用于临床治疗，可能给患者带来巨大危险口Ｊ。

人源性细胞可作为ｈＥｓｃ的饲养层细胞，如人胚胎成纤维细胞及人皮肤成纤维细胞等。通过广泛筛选，可在一定程度上避免病原体的污染。从而保证供者的饲养层细胞的安全性。由于胎盘的高效屏障作用，人胎盘成纤维细胞制备的饲养层可大大减少病原体污染可能性。更为理想的方案是用人ＥＳＣ分化出成纤维样细胞并体外扩增，将这些成纤维样细胞作为ＥｓＣ的饲养层，这样既保证了饲养层与Ｅｓｃ间的同源性，又避免了外源性病原体的引入。这种培养体系下的ｈＥＳＣ能长期维持ＥＳＣ的生长特征，保持向三胚层分化的潜能、无限未分化增殖能力及正常的核型。这个方案存在的问题是原代ｈＥＳＣ的培养仍然需要非同源性饲养层的支持。除了应用最为广泛的成纤维细胞，饲养层细胞还可以为子宫上皮细胞（ＵＥ）、大鼠肝细胞（ＢＲＬ）、人包皮成纤维细胞、脾细胞等。在源于囊胚期的斑马鱼ＥＳＣ（ｚＥＳＣ）培养中，ＦＡＮ等Ｈ１采用生长停止的彩红鳟鱼脾细胞（ＲＴＳ３４ｓｔ）为饲养层．能维持ｚＥＳＣ的未分化状态，碱性磷酸酶及ＳＳＥＡ—ｌ阳性。

然而，ＦＥＥＤＥＲ细胞的介入除了会导致异源物质、病原体等缺点，还会对ＥＳｃ生长、增殖度分化等研究造成限制．因为在饲养层培养体系中，很多数据都来源于饲养层细胞与ＥＳＣ时某种刺激或处理的共同反应。２００５年ＢＩＧＤＥＬＩ等＂Ｊ

构建了无ＦＥＥＤＥＲ无ｍａｔｒｉｘ的培养体系，将ＦＥＥＤＥＲ支持培

养的ｈＥＳＣ（ＳＡｌ６７ＭＦＧ与ＡＳ０３４．１ＭＦＧ细胞系）转移到人胚胎肺成纤维细胞（ｈＳＬ）来源的ｃＭ（舍有２０％ＳＲ）中，就能使其在塑料培养瓶表面未分化生长，保持其多潜能性及正常核型，表达ＯＣＴ一４、ｓｓＥＡ一３、ＳｓＥＡ一４、ＴＲＡ—ｌ一６０及ＴＲＡ一１—８１等ｈＥＳＣ特征标志，并且可冷冻保藏，大大简化了ｈＥＳＣ培养、传代、保存的过程。

将ＥＳＣ培养液加到铺有ＦＥＥＤＥＲ的平皿中，定时收集

培养液，即为条件培养基。来自于ＭＥＦ饲养层的ＣＭ内舍有已鉴定的蛋白种类约为１３６种及其他未知的蛋白，其功能包括参与细胞的生长与分化、细胞外基质的形成与重塑等。

由此可见。ＦＥＥＤＥＲ提供的大量分子对维持ＥＳＣ的自我更新

及分裂增殖的机制是十分复杂的。可能也是其他培养条件所不能比拟的。细胞外基质是由复杂的分子成分所构成的三维结构。除了纤维粘连蛋白、胶原、糖蛋白、透明质酸、蛋白聚糖等基本结构成分。还需要有激素及生长因子等功能调节分子，如ＩＬ一６对ｍＥＳＣ多能性的维持有重要作用，ＦＧＦ（成纤维细胞生长因子）可支持ｈＥＳＣ的未分化生长。ＣＭ一方面避免了ＦＥＥＤＥＲ与ＥＳＣ的共同培养。另一方面又收获了较多由ＦＥＥＤＥＲ提供的复杂重要因子，从而维持Ｅｓｃ的增殖及全能性。然而，目前ＣＭ仍然需要通过ＦＥＥＤＥＲ的培养，

性、正常核型、胚胎表面标志及多潜能转录因子的表达，如ＳＳＥＡ、ＯＣＴ－４、Ｎａｎｏｇ等。ＥＳＣ被认为可以提供一种理想的选平台的建立、细胞发育与分化的分子调节机制研究、基因靶向敲除动物模型的构建、组织工程种子细胞及基因治疗载体的建立、细胞治疗及再生医学等。选择最优化的细胞培养基对于ＥＳＣ的研究及临床应用是至关重要的。一个合格的ＥＳＣ培养基的首要条件为促进Ｅｓｃ的永久性分裂增殖及维持Ｅｓｃ的未分化状态，前者是对ＥＳＣ数量上的要求，后者是对功能的保证。为满足这２个条件，已建立有很多的标准方法，一般要求ＥＳＣ生长在有丝分裂失活的饲养层细胞（ＦＣＳ）及白血病抑制因子（ＬＩＦ）等。另外，为了排除不明外维持其全能性的基础之上，又尝试及建立了其他培养基，包括条件培养基（ＣＭ）、无饲养层、无血清、血清替代物（ＳＲ）非务件培养基等。

ｌ饲养层细胞

其机制仍未完全阐明，很大程度上与饲养层所提供的细胞接触及复杂的蛋白分子环境有关。小鼠胚胎成纤维细胞（ＭＥＦ）不仅可用来作为小鼠ＥＳＣ的饲养层细胞，也可支持人ＥＳＣ的增殖。１９８１年ＥＶＡＮＳ等…采用丝裂霉素ｃ灭活的ＳＴＯ成纤维细胞作为饲养层，在添加有１０％ＦｃＳ及ｌＯ％新生小牛血清（ＮＢＣＳ）的Ｄｕｌｂｅｃｃｏ＇ｓ基础培养基中成功培养潜能。１９９８年ＴＨＯＭＳＯＮ等怛１在ＭＥＦ饲养层上成功培养了ｈＥｓｃ，具有高水平端粒酶活性、表达原始ＥＳＣ表面标志［包括阶段特异性胚胎抗原（ＳＳＥＡ）一３、ＳＳＥＡ一４、ＴＲＡ—ｌ一６０、ＴＲＡ一１—８１及碱性磷酸酶（ＡＰ）］、具有向三胚层分化的潜能。饲养层目前仍为最常用的培养ＥＳＣ方法。常用的ＭＥＦ包括小鼠成纤维细胞株（ＳＴＯ）、原代小鼠胎儿成纤维细胞（ＰＭＥＦ）等，然而这些具有活性的外源性细胞，一方面作为异种抗原会影响ｈＥＳＣ的正常生长与增殖，若发生细胞问融合则会引起ＥＳＣ表达异源性抗原，这将给ｈＥＳＣ的临床移植治疗带来免疫排斥反应，如用ＭＥＦ饲养层联合ＳＲ作为培养基时，ｈＥＳｃ会表达异源性的糖类Ｎ一乙酰神经氨酸（ＮｅｕＳＣ，ｃ）；另外也会增加对ＥＳＣ的污染，如动物源性逆转录

２条件培养基

ｍａｉｌ：１００４５６＠１２６．ｃｏｒｎ

广东医学２０１０年１月第３ｌ卷第１期Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ

ＭｅｄｌｉｃａｉＪｏｕｒｎａｌ

Ｊａｎ．２０１０。Ｖ０１．３１。Ｎｏ．１

才能收获复杂的能维持ＥＳＣ生长与增殖的因子，而这种复杂性给ＥＳＣ生长、发育及分化的确切分子机制研究带来极大限制，也不能保证每一批收获的ｃＭ之间的均一性、依然有来自于ＦＥＥＤＥＲ的异源性及病原体污染危险。

３血清

ＦＣＳ或ＦＢＳ是细胞培养中最为常用的血清，能提供大量至今仍未完全明确的因予以促进细胞的生长．另外极低的抗体水平可减少对培养细胞的免疫攻击作用。目前用于临床治疗的ｈＭＳＣ大多数仍须培养于添加有ＦＢＳ的培养基中。具有正常的形态、表型及分化潜能，移植过程中并未显示明显的不良反应。ＦＣＳ含有的小分子生物活性因子能抑制线粒体膜的凋亡及半胱天冬氨酸酶一３（Ｃ勰ｐａｓｅ一３）的活化，减弱了细胞凋亡信号，因而对神经细胞具有保护功能；另外还存在细胞分化抑制因子，如抑制淋巴细胞亚型的增殖，可在同种异型细胞移植中起到抑制移植免疫排斥反应的作用。

然而对于ｈＥｓｃ的培养，ＦＣＳ仍是一种外源性物质。会造成Ｅｓｃ表迭异源糖蛋白及多聚脂糖【“。动物来源血清存在种问异源性、潜在病原体等问题，给ＥＳＣ的培养与临床应用带来不便。自身同源血清能促进体外培养的ｈＭＳＣ的增殖，维持其多向分化潜能，提高其一临床移植治疗的效果。但也会引起复制能力减弱、端粒缩短等现象，导致ｈＭＳＣ的体外生命周期变短，另外自身同源血清还存在数量上的局限性。尤其对于衰弱、消耗性患者。血清与血浆在组成上明显不同。后者可能因含有大量的血小板而对ｈＭＳＣ的培养更为有利。研究显示新鲜冷冻血浆与血小板、血小板溶解物、血小板释放上清能够替代ＦＣＳ作为一种有效且安全的培养基添加物，促进ｈＭＳＣ体外扩增及迁移能力、抑制免疫原性、维持向成骨细胞、软骨形成细胞及脂肪细胞分化的潜能。与ＦＣＳ相比，同种异源富含血小板的血浆具有更强的促进体外ｈＭＳＣ增殖能力（累积群体倍增数：６８．１哪２４．４）、维持向脂肪细胞

及成骨细胞分化潜能、保持ＭＳＣ标拶“。

已有研究显示无血清的培养体系也能使ＩＩＥＳＣ保持正常核型、表达多潜能标志，体外培养可向三胚层细胞分化，接种动物能形成畸胎癌的能力。ＡＭＩＴ等¨ｏ采用ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ包被培养板、添加有１５％ＳＲ及生长因子的基础培养基构成了无ＦＥＥＤＥＲ无血清的培养体系。支持ｈＥＳＣ未分化长期培养到５０代。脐血来源的ＭＳＣ在无血清培养中也能增殖，并保留向软骨细胞、脂肪细胞及成骨细胞系分化潜能，培养基中须添加有高葡萄糖、ｂＦＧＦ、人白蛋白、皮质醇及ＳＩＴＥ（硒酸钠、牛胰岛素、人转铁蛋白及乙醇胺）等因子。血清中很多因子对Ｓｃ的生长与分化起着相当微妙的作用，若将ＭＳＣ培养于无细胞因子及生长因子的ａ～最低基础培养基中，将可以分离出具有祖细胞特征的ＭＳＣ亚型，与培养于Ｆｃｓ培养基中的ＭＳＣ相比，这些细胞显示更长的端粒、ＯＣＴ一４及其他胚胎细胞特征基因的更高表达【９】。另一方面，无血清培养基也会给干细胞的生长带来阻碍，可能与某些生长因子的缺乏而诱导ｃａｓｐａｓｅ凋亡途径有关¨…。

为解决明确培养基成分、避免异源物质及潜在病原体等问题，目前较为理想的培养基采用成分明确的基础培养基并添加ＳＲ及能促进细胞增殖并维持未分化状态的相关因子。虽然含血清替代物或舍血清的培养基都可以维持ＥＳＣ的未分化生长，但是两者对ＥＳＣ的影响仍有较大差别。虽然在

万方数据

・１１７・

不同的培养系统中ＥＳＣ可以在通常的干细胞标志上表现一致，但是在细胞表型上可能已发生了巨大改变。包括在基因表达程度上的差异，因此确定最优化的ＥＳＣ培养基，还应对ＥＳＣ基因表达的改变进行监测¨们。ＡＭＩＴ等【８１采用ｆｉｂｒｏｎｅ－ｃｔｉｎ联合添加有１５％ＳＲ、ＴＧＦｐｌ、ＬＩＦ、ＦＧＦ的培养基代替传统的ＦＥＥＤＥＲ联合血清的培养体系。完成了ｈＥＳＣ的长期来分化培养，表现为维持向三胚层代表性组织分化潜能、无限的未分化增殖能力及正常的核型。

４细胞因子

ＥＳＣ要维持多潜能性及低免疫原性的大规模体外增殖培养，除了要求血清的质量外，还包括其他培养因素的优化。如基础培养基、葡萄耱含量、谷氨酰胺稳定性、细胞接种密度及传代密度、培养板表面质量及重要细胞因子的添加等…。一些细胞因子已被证实在维持干细胞全能性、未分化增殖方面有重要作用，ｂＦＧＦ是最通常的ＭｓＣ培养基添加物，能极大地提高细胞增殖能力，同时上调ＨＬＡＩ类分子、抑制ＨＬＡ—ＤＲ分子的表达，但对Ｍｓｃ的分化潜能亦有影响，如有助于向成骨细胞系而抑制向神经细胞分化。在无ＦＥＥＤＥＲ无血清的培养体系中。需要加ＴＧＦＩＳＩ、ｂＦＧＦ、ＬＩＦ等才能维持ｈＥＳＣ的未分化增殖¨Ｊ。ＵＦ能维持ｍＥＳＣ的未分化状态…。却不能阻止ｈＥＳＣ的分化。ＬＩＦ通过与异源二聚体受体及ｇｐｌ３０结合激活ＪＡＫ／Ｓｔａｔ３信号通路，活化的Ｓｔａｔ３可以维持ｍＥＳＣ的长期自我更新能力、胚胎克隆形成能力，表达未分化表型特征。骨形成蛋白（ＢＭＰ）显示抑制Ｅｓｃ向神经系统分化的作用，单独的ＢＭＰ可促进ＥＳＣ向非神经系统分化，不具有抑制ＥＳＣ分化的功能。但若将ＢＭＰ与ＬＩＦ联合。剧显示抑制ＥＳＣ分化的功能，支持ＥＳＣ的自我更新。ＧＤＦ一６（ＢＭＰ相关生长与分化因子）联合ＬＩＦ同样能支持ＥＳＣ的自我更新，进一步提示了ＢＭＰ在支持ＥＳＣ未分化增殖中的作用。添加有ＵＦ与ＢＭＰ的基础培养基同样可以支持ｍＥＳＣ的未分化增殖。说明Ｎ２与Ｂ２７并非是支持ＥＳＣ自我更新的必要成分ｆｌＩ】。

ｂＦＧＦ可激活ｂＥＳＣ表达中胚层如Ｍｕｓｌｅ—ＥＮＯＬＡＳＥ（肌肉烯醇化酶）、Ｂｏｎｅ—ＣＭＰ（骨髓软骨基质蛋白）、Ｋｉｄｎｅｙ—ＲＥＮＩＮ（肾素）、Ｈｅａｒｔ—ｔＡＣＴ（心肌动蛋白）、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ一８ＧＬＯＢＩＮ（造血８珠蛋白）及外胚层标志（如脑神经微丝重链蛋白、皮肤角蛋白）。虽然研究显示ｂＦＧＦ能抑制ＢＭＰ信号途径，但其支持ｌｌＥＳＣ未分化增殖的机制仍未清楚。ＴＧＦＤＩ是ＴＧＦＢ超家族成员之一，可存在于基质胶或条件培养基中”Ｊ。能诱导ｈＥＳＣ表达中胚层标志（如肌肉烯醇化酶、

心肌动蛋白）。依据培养环境及细胞发育阶段的不同，

ＴＧＦｐＩ会对造血系统的增殖、分化及死亡产生不同的影响。

寻找最佳培养条件的最终目的是获得最优的ＥＳＣ，然而最优的ＥＳＣ的评价标准往往跟其目的相关。因此，我们的努力方向改为寻找最适合的ＥＳＣ更为实际。例如，若用于临床移植治疗，则要求ＥｓＣ具有足够的增殖能力、易于向目标细胞分化的潜能、较低的免疫原性及安全性，这类细胞的培养条件要求无动物源性的ＦＥＥＤＥＲ、血清等异源物质，可避免免疫原性及病原体感染问题，但可能限制ＥＳＣ的增殖及分化能力。若用于研究早期胚胎发育，ＥＳＣ需具有早期的发育特征．包括增殖能力、细胞周期调节、基因表达及对发育信号的反应能力、多向分化潜能。适于临床治疗的ＥＳＣ有

・１１８・

广东医学２０１０年１月第３ｌ卷第１期Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ

ＭｅｄｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ

Ｊａｎ．２０１０。Ｖ０１．３１．Ｎｏ．１

可能其增殖及分化能力有限，而适于发育学研究的ＥＳＣ易ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃａｃｉｄｘｅｎｏａｎｔｉｇｅｎｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ

ｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃ

携带异源物质，培养条件要根据不同目的加以选择。除了满ａｎｄ

ｍｅ∞ｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｉｌｓｉｓ

ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ

ｒｅｖｅｌｓｉｂｌｅ［ｊ】．Ｓｔｅｍ

足适合ＥＳＣ的生长需要，最优化的培养系统还需要其明确ｃｅｌｌｓ，２００７，２５（１）：１９７—２０２．组成成分，以便于在多个实验室重复开展，需要明确培养基［７］ＫＯＣＡＯＥＭＥＲ

Ａ，ＫＥＲＮ

Ｓ，ＫＬＵＥＴＥＲＨ，ｅｔ

ａ１．Ｈｕｍａ．ｑ

ＡＢ一

质、培养基成分、重组蛋白因子的种类、传代培养的密度与时￥ｅｒｕｎｌ∞ｗｅｌｌ∞ｔｈｒｏｍｂｉｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｐｌａｔｅｌｅｔ—ｒｉｃｈ—ｐｌａｓｍａ

ａＩ℃

ｓｕｉｔａｂｌｅａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ

ｔｏ

ｆｅｔａｌｃａｌｆ８ｅｒｌｌｍｆｏｒｔｈｅ间：另外，ＥＳＣ的来源、胎胚获取方式、甚至培养瓶的材质等，ｅｘｐａｎｓｉｏｎｏｆ

ｌｎｅ目｛ＩＩ－

ｃｈｙＩＩ“ｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍ这些因素都可能在一定程度对研究结果产生影响。ａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］．Ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．２００７，２５

（５）：１２７０—１２７８．参考文献

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ＡＭＩＴ

Ｍ．ＳＨＡＲＩＫＩ

Ｃ，ＭＡＲＧＵＬＥＴＳＶ，ｅｔ

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Ｍ

Ｊ，ＫＡＵＦＭＡＮＭ

Ｈ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｉｎｃｕｈｕｒｅ

ｏｆｐｌｕｒｉ－

ａｎｄｓｅｌⅢｎ—ｆｒｅｅ

ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｈｕｍａｎ

ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍ

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Ｒ。ＹＬＯＳＴＡＬＯ

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ＥＬＤＯＲ

Ｊ，ＳＡＰＨＩＲＯＳＳ，ｅｔ

ａ１．

ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｍａｒｒｏｗｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓ（ｈＭＳＣｓ）ｓｅｌｅｃｔｓ

ｆｏｒ

ａ

Ｅｍｂｒｙｏｍｃ

ｓｔｅｍｃｅｌｌ

ｌｉｎｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｈｕｍａｎ

ｂｌａｓｔｅｅｙｓｔｓ［Ｊ］．ｓｃｉ－

ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ

ｏｆｅａｒｌｙｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｔｓｗｉｔｌＩｅｎｈａｎｃｅｄ

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Ｓｅｌａｌｍｄｅｐｄｖａ－

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Ｐ．Ｃａｌｔｕｒｅｏｆ

ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ

ｓｔｍ

ｃｅｌｌ

ｔｉｏｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ

ａｐｏｐｔｏｓｉｓ

ｉｎ

ｍｏｓｅｎｃｈｙｍａｌ

ｓｔｅｍ

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ＢＩＧＤＥＬＩ

Ｎ，ＡＮＤＥＲＳＳＯＮ

Ｍ，ＳＴＲＥＨＬＲ，ｅｔａ１．Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ

ｏｆ［１１］ＹＩＮＧＱ

Ｌ，ＮＩＣＨＯＬＳ

Ｊ。ＣＨＡＭＢＥＲＳＩ，ｅｔ

ａ１．ＢＭＰｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆ

ｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃ

ｓｔｅｍｃｅｉｌｓ

ｔｏ

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ｃｕｌ・・

Ｉｄ

ｐｒｏｔｅｉｎｓ

ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ

ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ

ａｎｄｓｕｓｔａｉｎｓ

ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ

ｓｔｅｍ

ｔＵｒｅ

ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

ｄｉｒｅｃｔｌｙｏｎ

ｐｌａｓｔｉｃｓｕｒｆａｃｅｓ【】］．Ｊ

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。

ｃｅｌｌｓｅｌｆ—ｒｅｎｅｗａｌｉｎｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎｗｉｔｈ

ＳＴＡＴ３【Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００３。

２００８，１３３（１）：１４６—１５３．１１５（３）：２８Ｉ一２９２．

［６］ＨＥＩＳＫＡＮＥＮ

Ａ，ＳＡＴＯＭＡＡＴ，ＴＩＩＴＩＮＥＮＳ，ｅｔ８１．Ｎ—ｇｌｙｃｏｌｙｌ－

（收稿日期：２００９—０５—１７编辑：王冰）

以ＭＡＰＫ通路为靶向的肿瘤生物治疗宰

王伟飞▲，王新颖△，姜泊△

南方医科大学南方医院消化科（广州５１０５１５）

丝裂原激活蛋白激酶（ｍｉｔｏｇｅｎ—ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ．

活、迁移以及肿瘤侵袭能力方面有重要的调节作用，主要参ＭＡＰＫ）是一组被不同的细胞外刺激（如生长因子、细胞因与各种生长因子、细胞因子、丝裂原以及激素受体活化后的子、激素、药物及细胞应激等）激活的丝氨酸一苏氨酸蛋白激信号转导，参与多种肿瘤细胞的生存和增殖…。

酶。ｔＪ。ＭＡＰＫ通路的基本组成是一种从酵母到人类都保守ＥＲＫｌ／２通路的ＭＡＰＫＫＫ，即Ｒ丑ｆ激酶，是４０一７５ｋＤ的

的ＭＡＰＫ激酶激酶（ＭＡＰＫＫＫ）、ＭＡＰＫ激酶（ＭＡＰＫＫ）及Ｓｅｒ／Ｔｈｒ蛋白激酶，有Ｒａｆ—ｌ（ｃ一蹦）、Ａ—Ｒａｆ和Ｂ—Ｒａｆ

ＭＡＰＫ三级激酶模式。在真核细胞中，已确定出细胞外信号３个同型异构体，其分布具有组织特异性，Ａ—Ｒａｆ和Ｂ—Ｒａｆ调节蛋白激酶（ｅｘｔｒａｅｅｌｌｕｌａｒ

ｓｉｇｎａｌ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ．

主要分布于泌尿生殖和神经组织，而Ｒａｆ—ｌ则广泛表达于ＥＲＫ）、ｐ３８、Ｃ—Ｊｕｎ氨基末端激酶（ｃ—ＪｕｎＮ—ｔｅｒｍｉｎａｌＫｉ．

各种组织中ＨＪ。Ｒａｆ激酶特异性地磷酸化并激活ＭＡＰＫＫｎａｓｅ，ＪＮＫ）和ＥＲＫＳ／ＢＭＫＩ（ｂｉｇ

ＭＡＰ

ｋｉｎａｓｅ）４个ＭＡＰＫ亚

（ＭＥＫｌ／２）。ＭＥＫＩ和ＭＥＫ２蛋白分子量分别为４４ｋＤ和

族。ＭＡＰＫ通路与细胞的增殖和凋亡密切相关．对肿瘤的生

４５

ｋＤ，属于少有的双重特异性蛋白激酶（ｄｕａｌｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ

Ｐ

长增殖起至关重要的作用…。ＭＡＰＫ通路在大肠癌等多种

ｒｏｔｅｉｎ

ｋｉｎａｓｅ），既为Ｔｙｒ蛋白激酶，又为Ｓｅｒ／Ｔｈｒ蛋白激酶。

恶，ｌ生肿瘤中过度激活，以ＭＡＰＫ通路激酶为靶点来阻断增殖ＭＥＫｌ／２激活ＥＲＫＩ和ＥＲＫ２ＭＡＰｌ（８。ＥＲＫｌ／２一旦被活化。信号的传递，为肿瘤的个体化治疗带来新的希望呤Ｊ。

胞浆中的一部分转位至细胞核，然后，通过核转录因子的磷１

附一ＭＥＫ—ＥＲＫ通路

酸化作用来调节基因表达，细胞膜、细胞核、细胞骨架及内膜Ｒｄ—ＭＥＫ—ＥＲＫ通路，即ＥＲＫＩ／２通路，是ＭＡＰＫ通路

系统的多种功能都受其影响Ｌ４Ｊ。

中最早被发现的最经典的一个亚族。它在细胞的分裂、存

Ｒａｆ激酶的上游激活分子是Ｒａｓ小ＧＴＰ酶，两者常以复

合物形式存在，Ｒａｓ催化胞浆中的附激酶重新定位于细胞

・国家自然科学基金资助项目（编号：３０９７１５２０）

膜内侧，Ｒａｆ激酶一旦与胞膜的脂质层结合即暴露出其功能▲现工作单位：南方医科大学第三附属医院消化科（广州５１０６３０）区，进一步被ＥＧＦＲ或Ｓｒｃ等分子激活ｐ１。ＥＧＦＲ在包括大△通信作者。王新颖，主治医师，电话：０２０一６１６４２２５６，Ｅ—ｍａｉｌ：肠癌在内的多种肿瘤中高表达，而Ｒａｓ和Ｂ—Ｒａｆ在结肠癌、ｓｕｎｗｉｎｇｗｘｙ＠１６３．ｅｏｍ；姜泊，教授，电话：０２０—６１６４１５４１，Ｅ—ｍａｉｌ：胰腺癌等多种肿瘤中发生突变，最终导致ＥＲＫ通路在肿瘤ｄＩｊｉａｎｇ＠１６３．ｔｏｍ

组织中持续激活。由此可见，以ＥＲＫ通路为靶点，阻断其激

万方数据

胚胎干细胞培养方法研究进展

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：引用次数：

吴静， 胡东， 张荣波

安徽理工大学医学院,安徽淮南,232001广东医学

GUANGDONG MEDICAL JOURNAL2010，31(1)0次

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下载时间：2010年6月13日