第23卷第2期 高 校 化 学 工 程 学 报 No.2 V ol.23 2009 年 4 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Apr . 2009
文章编号：1003-9015(2009)02-0360-05
木犀草素分子印迹聚合物的分子识别特性及固相萃取研究
潘浪胜, 刘敏敏, 田红锦, 刘跃进 (湘潭大学 化工学院, 湖南 湘潭 411105)
摘 要：采用分子印迹技术，以木犀草素为模板分子，丙烯酰胺为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，通过热引发聚合，制备了木犀草素分子印迹聚合物，并通过装入固相萃取柱研究了聚合物对木犀草素的选择性能。结果表明，该分子印迹聚合物对模板分子具有高度选择性和识别能力，而空白聚合物却不具备这样的特性。将木犀草素分子印迹聚合物用于固相萃取花生壳提取物，分离富集其中的木犀草素活性成分，在萃取柱上载样品之后，先用V (乙醇):V (水) ＝1:1溶液进行清洗，再用V (乙醇):V (水) ＝7:5溶液进行目标分子的洗脱，木犀草素的纯度可由1.6％提高到94.1％，回收率90.0％。木犀草素分子印迹固相萃取柱具有较好的稳定性和耐用性能，使用4次后其选择识别性能仍未降低，显示该聚合物具有直接作为复杂天然产物中木犀草素分离提取材料的潜能。 关键词：木犀草素；分子印迹聚合物；分子识别；固相萃取
中图分类号：O658.11；TQ028.8 文献标识码：A
Molecular Recognition Characteristics and Solid-phase Extraction Ability of
Luteolin Imprinted Polymer
PAN Lang-sheng, LIU Min-min, TIAN Hong-jin, LIU Yue-jin
(College of Chemical Engineering, Xiangtan University, Xiangtan 411105, China)
Abstract: Molecular imprinted polymer (MIP) of luteolin was prepared via heat-initiating polymerization with luteolin as the template molecule, acrylamide as the functional monomer and ethylene glycol dimethacrylate as the cross linking monomer. The selectivity of the prepared MIP for luteolin was studied by packing it in a solid-phase extraction column. The results reveal that the prepared MIP exhibits high selectivity and good recognition ability to luteolin but the blank polymer doesn’t. Experiments of using the solid-phase extraction column packed with prepared MIP as solid-phase material to extract the luteolin from peanut shell extracts were conducted too. The sample was uploaded and then the column was cleaned up with ethanol-water (1:1, V/V) solution and the luteolin was eluted with ethanol-water (7:5, V/V) solution; such that the purity of luteolin could be increased from 1.6% to 94.1% and its recovery is about 90.0%. The solid-phase extraction column with prepared MIP as solid-phase material shows good stability and durability, and its recognition ability doesn’t descend even if the luteolin-MIP filled column is used repeatedly for 4 times. The successful preparation of the MIP for luteolin provides an innovative opportunity for the development of the advanced luteolin separation materials and the novel material for selective enrichment and determination of trace luteolin in complex nature products.
Key words: luteolin; molecular imprinted polymer; molecular recognition; solid-phase extraction
1 前 言
分子印迹聚合物(MIP)是一种对模板分子具有特异选择性识别功能的聚合物。其制备过程是以目标分
收稿日期：2007-10-16；修订日期：2008-07-25。 基金项目：湖南省教育厅资助科研项目(05C084)。
作者简介：潘浪胜(1972-)，男，江西丰城人，湘潭大学副教授，博士。 通讯联系人：潘浪胜，E-mail ：[email protected]
第23卷第2期 潘浪胜等： 木犀草素分子印迹聚合物的分子识别特性及固相萃取研究 361
子为模板分子，将其与具有结构互补的聚合物单体分子通过非共价键的方式相互作用，加入交联剂引发聚合反应；从生成的聚合物中将模板分子提取出来，形成能记忆模板分子形状及官能团位置的高分子聚合物，对模板分子具有很高的选择性。分子印迹聚合物以其通用性和惊人的立体专一识别性，越来越受到人们的青睐。分子印迹固相萃取已成为固相萃取研究的热点之一，有着广泛的应用前景[1~5]。黄酮类化合物是中草药中重要的活性成分，广泛分布于各种植物中，在医药领域有着许多重要的应用。但是由于其种类繁多，结构又很相似，使分离和提取有较大困难[6]。木犀草素是一种具有代表性的天然黄酮，在植物界分布较广。木犀草素在临床上具有止咳、祛痰及消炎等作用, 在体内具有抗菌、抗病毒及降低血脂和胆固醇等作用[7]。本研究以木犀草素为模板分子，采用分子印迹技术制备木犀草素分子印迹聚合物，通过填充成固相萃取柱研究该印迹聚合物对木犀草素的选择性萃取性能，并尝试把该聚合物用于固相萃取花生壳提取物中的木犀草素。本文的研究结果对从复杂的天然产物中高效分离富集木犀草素有一定的指导作用。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
CS501-3C 型恒温水浴箱(重庆四达试验仪器有限公司) ；XR-2400W 型超声波清洗机(张家港市信任超声设备有限公司) ；Perkin Elmer Series200型高效液相色谱仪；美国康塔公司NOVA 2200e比表面孔径分析仪。
丙烯酰胺(分析纯，天津科密欧化学试剂开发中心) ；木犀草素(Luteolin，SKYHERB Technologies Co.Ltd ，98%)；芦丁(中国生物制品检定所) ；偶氮二异丁腈(AIBN，化学纯，中国上海试剂四厂) ；甲醇(分析纯，天津市化学试剂二厂) ；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，Sigma-Aldrich 公司) ；花生壳：花生果产于湖南，手工剥壳，粉碎后备用。其余试剂为分析纯，水为去离子二次蒸馏水。 2.2 分子印迹聚合物的制备
称取0.228 g (0.8 mmo1)木犀草素加入12 mL乙腈中，再加入0.341 g (4.8 mmo1)丙烯酰胺功能单体，于振荡器中振荡30 min，使模板分子与功能单体充分作用，然后加入4.7 mL (24 mmo1)EGDMA交联剂和0.033 g引发剂AIBN ，将该混合液倒入20 mL具塞刻度试管中，超声脱气15 min，然后充入氮气15 min，密封。将其放入60℃恒温水浴中加热24 h，所得的棒状聚合物粉碎过筛，收集粒径100~200目部分，将其放入索氏提取器中，并加入200 mL (V ) 甲醇:(V ) 乙酸=9:1溶液抽提24 h除去模板分子，再用甲醇洗脱，除去乙酸，晾干后60℃真空干燥24 h，放入干燥器中备用。制备空白聚合物时，除不加模板分子木犀草素外，其它方法同上。
2.3 分子印迹聚合物的孔径、比表面积和孔容的测定
用美国康塔公司NOVA 2200e比表面孔径分析仪对分子印迹聚合物的孔径、比表面积和孔容进行测 定。木犀草素分子印迹聚合物的平均孔径为1.435 nm，比表面积为310.677 m2⋅g −1，孔容为0.505 mL⋅g −1。2.4 花生壳提取物的制备
取100.3 g粉碎的花生壳置于三口瓶中，用工业酒精回流提取2次，每次的溶剂用量分别为800 mL和500 mL，回流时间分别为2.0 h和1.0 h。合并提取液，过滤，滤液旋转蒸发除去乙醇，转入水相，用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯萃取物浓缩至干，得花生壳提取物。花生壳提取物用HPLC 测得木犀草素含量为1.6％。 2.5 HPLC 检测条件
色谱条件如下：色谱柱—Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm ，迪马公司) ，流动相—甲醇:0.5%磷酸(70:30)，流速—1.0 mL⋅min −1，柱温—室温，检测—UV 360 nm，进样量—20 μL 。 2.6 聚合物的静态吸附性能实验
称取9份等量的分子印迹聚合物(每份50 mg)，分别置于容量为5 mL样瓶中，加入5 mL木犀草素的甲醇溶液(0.08 mg⋅mL −1) ，室温下分别振荡15 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，然
362 高 校 化 学 工 程 学 报 2009年4月
后用0.45 μm 膜过滤，收集滤液，在360 nm波长处用HPLC 测定其浓度，依据标准曲线计算不同吸附时间木犀草素的浓度。根据结合前后溶液中木犀草素浓度的变化，由方程Q =(c 0−c ) ⋅V /m 计算出聚合物对木犀草素的吸附量Q (mg⋅g −1) ，绘出吸附量Q 与吸附时间关系的动力学曲线，方程式中c 0 (mg⋅mL −1) 为木犀草素的初始浓度，c (mg⋅mL −1) 为吸附一定时间后木犀草素的浓度，V (mL)为溶液体积，m (g)为木犀草素分子印迹聚合物的质量。空白聚合物的吸附动力学曲线同上。依据吸附速率和平衡吸附量衡量分子印迹聚合物的特异性吸附性能。 2.7 固相萃取选择性能实验 2.7.1 固相萃取柱的制备
湿法装柱：称取木犀草素分子印迹聚合物0.5 g，用乙醇:水=1:1的溶液制成浆液，装入容量为9 mL、直径为6 mm的聚丙烯固相萃取空柱中，装填均匀后再用10 mL乙醇:水=1:1的溶液冲洗。 2.7.2 选择性固相萃取方法
取V (乙醇):V (水)=1:1配制的浓度为0.1 mmol⋅L −1的木犀草素和芦丁标准溶液2 mL，加载至提取柱上端。先用5 mL V (乙醇):V (水)=1:1的溶液洗脱，收集洗脱液；再用5 mL V (甲醇):V (乙酸)=8:2的溶液洗脱，收集洗脱液。洗脱液分别浓缩至干，用甲醇定容至1 mL，HPLC 分析。 2.7.3 花生壳提取物中木犀草素的固相萃取
取V (乙醇):V (水)=1:1的溶液配制的0.0175 g⋅mL −1花生壳提取物2 mL加载至提取柱上端。先用6 mL V (乙醇):V (水)=1:1的溶液洗脱，再用6 mL V (乙醇):V (水)=7:5的溶液洗脱，收集洗脱液(乙醇):V (水)=7:5部分并浓缩至干，称重，甲醇定容并HPLC 分析。
3 结果与讨论
3.1 模板分子对聚合物吸附性能的影响
图1是印迹聚合物MIP 及其对应的空白聚合物BP 的吸附动力学曲线。由图1可见，MIP 在前2 h内吸附量迅速增加，此后吸附量增加渐缓，4 h已基本达到平衡。而空白聚合物BP 的吸附量随时间延长迅速增加直到90 min达到吸附饱和。这是由于MIP 的孔穴由木犀草素分子所印迹，生成的孔穴较大，有利于模板分子由液相到固相的传质，因此吸附实验开始阶段呈现出较快的吸附速度。但随着时间的增加，模板分子的浅孔被逐渐结合饱和，由于其向MIP 深孔的传质有一定的位阻使吸附速度下
Q ×10−2/ m g ⋅g −1
t / h
图1 分子印迹聚合物的吸附动力学曲线 Fig.1 The adsorption kinetics curves of luteolin MIP
降，从而吸附量增加渐缓乃至达到平衡。而空白聚合物中没有有序排列的而且与模板分子结构相对应的立体孔穴，因此主要存在非模板聚合物表面的非异性吸附作用，所以很快就能达吸附平衡。 3.2 分子印迹聚合物的固相萃取选择性能
图2中，V (乙醇):V (水)=1:1能把芦丁洗脱下来而木犀草素保留，强洗脱阶段V (甲醇):V (乙酸)=8:2可以把木犀草素洗脱下来。V (乙醇):V (水)=1:1水含量高，增加了离子作用或疏水作用，使得木犀草素保留增加而不易洗脱。强洗脱阶段乙酸使溶液极性增强，破坏了氢键作用，使木犀草素的保留减弱而洗脱下来。
由图2、图3可推断，木犀草素由于空间结构与木犀草素分子印迹聚合物的孔穴相吻合，形成了特异性吸附，而芦丁由于3位上的羟基连有一个鼠李糖和一个葡萄糖，容易形成较大的空间位阻，不能与木犀草素分子印迹聚合物的孔穴吻合产生特异性吸附，只能形成非特异性吸附，故芦丁容易被洗脱而木犀草素不易洗脱，因此，所制备的分子印迹固相萃取柱对木犀草素具有高度的选择能力。由于非印迹聚合物(NMIP)不具备与印迹分子相吻合的空间结构以形成特异性吸附，只能形成非特异性吸附，因此，如
第23卷第2期 潘浪胜等： 木犀草素分子印迹聚合物的分子识别特性及固相萃取研究 363
图3所示，当用较弱的洗脱液洗脱时，木犀草素跟芦丁均被微量洗脱，但当用较强的洗脱液洗脱时，芦丁和木犀草素全都被大量洗下来。
1
2
1
2
a b c
0 2 4 6 8 10 t / min
图2 分子印迹聚合物固相萃取两种结构相似物的色谱图
similar components
a-before the solid-phase extraction; b-eluent of V (ethanol):V (water) =1:1; c- eluent of V (mehanol):V (acetic
acid)=8:2; 1-rutin; 2-luteolin
t / min
图3 非模板聚合物固相萃取两种结构相似物的色谱图 Fig.3 HPLC chromatograms of NMIP extracting two
structural similar components
a-before the solid-phase extraction; b-eluent of V (ethanol):V (water) =1:1; c- eluent of V (mehanol):V (acetic
acid)=8:2; 1-rutin; 2-luteolin
a b c
0 2 4 6 8 10
Fig.2 HPLC chromatograms of MIP extracting two structural
3.3 分子印迹聚合物固相萃取花生壳提取物中的木犀草素
在床层高度90 mm的分子印迹聚合物固相萃取柱中上载样品后，先用6 mL V (乙醇):V (水)=1:1的溶液清洗，再用6 mLV (乙醇):V (水)=7:5的溶液洗脱，收集洗脱剂V (乙醇):V (水)= 7:5部分并浓缩至干，得到的木犀草素纯度达94.1%，回收率为90.0%。固相萃取前样品和萃取后收集的含木犀草素的溶液的色谱图见图4。水含量高时洗脱能力弱，原因是水含量高时增加了离子作用或疏水作用，使得木犀草素不易洗脱。 3.4 重复使用分子印迹聚合物的分离效果
分子印迹聚合物固相萃取1次后，按3.3节操作条件重复使用3次，结果见表1。由表1可知，分子印迹聚合物重复使用3次，分离效果未见明显变化。因为分子印迹聚合物对物料中的杂质不产生特异性吸附，使得其可多次重复使用而分离效果基本不变。
表1 重复使用分子印迹聚合物的分离结果
Table 1 Lutelin purification results of using repeatedly used MIP
b
0 2 4 6 8 10 12 14 16 t / min
图4 分子印迹聚合物对花生壳提取物的固相萃取色谱图 Fig.4 HPLC chromatograms of MIP extracting luteolin
from peanut shell extraction
a-before the solid-phase extraction; b-eluent of
V (ethanol):V (water)=7:5; 1-luteolin
a
1
Repeated times Purity Recovery
1 94.4 89.6 2 92.7 91.8 3 93.2 90.7
4 结 论
(1) 木犀草素分子印迹聚合物对木犀草素具有很高的选择性和识别能力，而空白聚合物不具备这样的特性。
(2) 木犀草素分子印迹聚合物固相萃取花生壳提取物，分离其中的木犀草素活性成分，木犀草素的纯度可由1.6％提高到92％以上，回收率90％左右。分子印迹聚合物重复使用3次，分离效果基本不变。
(3) 本文的研究结果对从复杂的天然产物中高效分离富集黄酮类活性成分木犀草素有一定的指导作用。
364 高 校 化 学 工 程 学 报 2009年4月
参考文献：
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technology in solid phase extraction(分子印迹技术在固相萃取中的应用与展望) [J]. J Chem Ind and Eng (China) (化工学报), 2004, 55(10): 1602-1607.
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Chimica Acta, 2007, 591(1): 29-39.
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Phyllostachys Pubescens (从毛竹叶中提取总黄酮的工艺研究) [J]. J Chem Eng of Chinese Univ(高校化学工程学报), 2006, 20(5): 691-695.
[7] ZHANG Wei-min(张伟敏), ZHANG Sheng-lin (张盛林), ZHONG Geng (钟耕). The study survey of luteolin (木犀草素的研究概况)
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第23卷第2期 高 校 化 学 工 程 学 报 No.2 V ol.23 2009 年 4 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities Apr . 2009
文章编号：1003-9015(2009)02-0360-05
木犀草素分子印迹聚合物的分子识别特性及固相萃取研究
潘浪胜, 刘敏敏, 田红锦, 刘跃进 (湘潭大学 化工学院, 湖南 湘潭 411105)
摘 要：采用分子印迹技术，以木犀草素为模板分子，丙烯酰胺为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，通过热引发聚合，制备了木犀草素分子印迹聚合物，并通过装入固相萃取柱研究了聚合物对木犀草素的选择性能。结果表明，该分子印迹聚合物对模板分子具有高度选择性和识别能力，而空白聚合物却不具备这样的特性。将木犀草素分子印迹聚合物用于固相萃取花生壳提取物，分离富集其中的木犀草素活性成分，在萃取柱上载样品之后，先用V (乙醇):V (水) ＝1:1溶液进行清洗，再用V (乙醇):V (水) ＝7:5溶液进行目标分子的洗脱，木犀草素的纯度可由1.6％提高到94.1％，回收率90.0％。木犀草素分子印迹固相萃取柱具有较好的稳定性和耐用性能，使用4次后其选择识别性能仍未降低，显示该聚合物具有直接作为复杂天然产物中木犀草素分离提取材料的潜能。 关键词：木犀草素；分子印迹聚合物；分子识别；固相萃取
中图分类号：O658.11；TQ028.8 文献标识码：A
Molecular Recognition Characteristics and Solid-phase Extraction Ability of
Luteolin Imprinted Polymer
PAN Lang-sheng, LIU Min-min, TIAN Hong-jin, LIU Yue-jin
(College of Chemical Engineering, Xiangtan University, Xiangtan 411105, China)
Abstract: Molecular imprinted polymer (MIP) of luteolin was prepared via heat-initiating polymerization with luteolin as the template molecule, acrylamide as the functional monomer and ethylene glycol dimethacrylate as the cross linking monomer. The selectivity of the prepared MIP for luteolin was studied by packing it in a solid-phase extraction column. The results reveal that the prepared MIP exhibits high selectivity and good recognition ability to luteolin but the blank polymer doesn’t. Experiments of using the solid-phase extraction column packed with prepared MIP as solid-phase material to extract the luteolin from peanut shell extracts were conducted too. The sample was uploaded and then the column was cleaned up with ethanol-water (1:1, V/V) solution and the luteolin was eluted with ethanol-water (7:5, V/V) solution; such that the purity of luteolin could be increased from 1.6% to 94.1% and its recovery is about 90.0%. The solid-phase extraction column with prepared MIP as solid-phase material shows good stability and durability, and its recognition ability doesn’t descend even if the luteolin-MIP filled column is used repeatedly for 4 times. The successful preparation of the MIP for luteolin provides an innovative opportunity for the development of the advanced luteolin separation materials and the novel material for selective enrichment and determination of trace luteolin in complex nature products.
Key words: luteolin; molecular imprinted polymer; molecular recognition; solid-phase extraction
1 前 言
分子印迹聚合物(MIP)是一种对模板分子具有特异选择性识别功能的聚合物。其制备过程是以目标分
收稿日期：2007-10-16；修订日期：2008-07-25。 基金项目：湖南省教育厅资助科研项目(05C084)。
作者简介：潘浪胜(1972-)，男，江西丰城人，湘潭大学副教授，博士。 通讯联系人：潘浪胜，E-mail ：[email protected]
第23卷第2期 潘浪胜等： 木犀草素分子印迹聚合物的分子识别特性及固相萃取研究 361
子为模板分子，将其与具有结构互补的聚合物单体分子通过非共价键的方式相互作用，加入交联剂引发聚合反应；从生成的聚合物中将模板分子提取出来，形成能记忆模板分子形状及官能团位置的高分子聚合物，对模板分子具有很高的选择性。分子印迹聚合物以其通用性和惊人的立体专一识别性，越来越受到人们的青睐。分子印迹固相萃取已成为固相萃取研究的热点之一，有着广泛的应用前景[1~5]。黄酮类化合物是中草药中重要的活性成分，广泛分布于各种植物中，在医药领域有着许多重要的应用。但是由于其种类繁多，结构又很相似，使分离和提取有较大困难[6]。木犀草素是一种具有代表性的天然黄酮，在植物界分布较广。木犀草素在临床上具有止咳、祛痰及消炎等作用, 在体内具有抗菌、抗病毒及降低血脂和胆固醇等作用[7]。本研究以木犀草素为模板分子，采用分子印迹技术制备木犀草素分子印迹聚合物，通过填充成固相萃取柱研究该印迹聚合物对木犀草素的选择性萃取性能，并尝试把该聚合物用于固相萃取花生壳提取物中的木犀草素。本文的研究结果对从复杂的天然产物中高效分离富集木犀草素有一定的指导作用。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
CS501-3C 型恒温水浴箱(重庆四达试验仪器有限公司) ；XR-2400W 型超声波清洗机(张家港市信任超声设备有限公司) ；Perkin Elmer Series200型高效液相色谱仪；美国康塔公司NOVA 2200e比表面孔径分析仪。
丙烯酰胺(分析纯，天津科密欧化学试剂开发中心) ；木犀草素(Luteolin，SKYHERB Technologies Co.Ltd ，98%)；芦丁(中国生物制品检定所) ；偶氮二异丁腈(AIBN，化学纯，中国上海试剂四厂) ；甲醇(分析纯，天津市化学试剂二厂) ；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA，Sigma-Aldrich 公司) ；花生壳：花生果产于湖南，手工剥壳，粉碎后备用。其余试剂为分析纯，水为去离子二次蒸馏水。 2.2 分子印迹聚合物的制备
称取0.228 g (0.8 mmo1)木犀草素加入12 mL乙腈中，再加入0.341 g (4.8 mmo1)丙烯酰胺功能单体，于振荡器中振荡30 min，使模板分子与功能单体充分作用，然后加入4.7 mL (24 mmo1)EGDMA交联剂和0.033 g引发剂AIBN ，将该混合液倒入20 mL具塞刻度试管中，超声脱气15 min，然后充入氮气15 min，密封。将其放入60℃恒温水浴中加热24 h，所得的棒状聚合物粉碎过筛，收集粒径100~200目部分，将其放入索氏提取器中，并加入200 mL (V ) 甲醇:(V ) 乙酸=9:1溶液抽提24 h除去模板分子，再用甲醇洗脱，除去乙酸，晾干后60℃真空干燥24 h，放入干燥器中备用。制备空白聚合物时，除不加模板分子木犀草素外，其它方法同上。
2.3 分子印迹聚合物的孔径、比表面积和孔容的测定
用美国康塔公司NOVA 2200e比表面孔径分析仪对分子印迹聚合物的孔径、比表面积和孔容进行测 定。木犀草素分子印迹聚合物的平均孔径为1.435 nm，比表面积为310.677 m2⋅g −1，孔容为0.505 mL⋅g −1。2.4 花生壳提取物的制备
取100.3 g粉碎的花生壳置于三口瓶中，用工业酒精回流提取2次，每次的溶剂用量分别为800 mL和500 mL，回流时间分别为2.0 h和1.0 h。合并提取液，过滤，滤液旋转蒸发除去乙醇，转入水相，用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯萃取物浓缩至干，得花生壳提取物。花生壳提取物用HPLC 测得木犀草素含量为1.6％。 2.5 HPLC 检测条件
色谱条件如下：色谱柱—Diamonsil-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm ，迪马公司) ，流动相—甲醇:0.5%磷酸(70:30)，流速—1.0 mL⋅min −1，柱温—室温，检测—UV 360 nm，进样量—20 μL 。 2.6 聚合物的静态吸附性能实验
称取9份等量的分子印迹聚合物(每份50 mg)，分别置于容量为5 mL样瓶中，加入5 mL木犀草素的甲醇溶液(0.08 mg⋅mL −1) ，室温下分别振荡15 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，然
362 高 校 化 学 工 程 学 报 2009年4月
后用0.45 μm 膜过滤，收集滤液，在360 nm波长处用HPLC 测定其浓度，依据标准曲线计算不同吸附时间木犀草素的浓度。根据结合前后溶液中木犀草素浓度的变化，由方程Q =(c 0−c ) ⋅V /m 计算出聚合物对木犀草素的吸附量Q (mg⋅g −1) ，绘出吸附量Q 与吸附时间关系的动力学曲线，方程式中c 0 (mg⋅mL −1) 为木犀草素的初始浓度，c (mg⋅mL −1) 为吸附一定时间后木犀草素的浓度，V (mL)为溶液体积，m (g)为木犀草素分子印迹聚合物的质量。空白聚合物的吸附动力学曲线同上。依据吸附速率和平衡吸附量衡量分子印迹聚合物的特异性吸附性能。 2.7 固相萃取选择性能实验 2.7.1 固相萃取柱的制备
湿法装柱：称取木犀草素分子印迹聚合物0.5 g，用乙醇:水=1:1的溶液制成浆液，装入容量为9 mL、直径为6 mm的聚丙烯固相萃取空柱中，装填均匀后再用10 mL乙醇:水=1:1的溶液冲洗。 2.7.2 选择性固相萃取方法
取V (乙醇):V (水)=1:1配制的浓度为0.1 mmol⋅L −1的木犀草素和芦丁标准溶液2 mL，加载至提取柱上端。先用5 mL V (乙醇):V (水)=1:1的溶液洗脱，收集洗脱液；再用5 mL V (甲醇):V (乙酸)=8:2的溶液洗脱，收集洗脱液。洗脱液分别浓缩至干，用甲醇定容至1 mL，HPLC 分析。 2.7.3 花生壳提取物中木犀草素的固相萃取
取V (乙醇):V (水)=1:1的溶液配制的0.0175 g⋅mL −1花生壳提取物2 mL加载至提取柱上端。先用6 mL V (乙醇):V (水)=1:1的溶液洗脱，再用6 mL V (乙醇):V (水)=7:5的溶液洗脱，收集洗脱液(乙醇):V (水)=7:5部分并浓缩至干，称重，甲醇定容并HPLC 分析。
3 结果与讨论
3.1 模板分子对聚合物吸附性能的影响
图1是印迹聚合物MIP 及其对应的空白聚合物BP 的吸附动力学曲线。由图1可见，MIP 在前2 h内吸附量迅速增加，此后吸附量增加渐缓，4 h已基本达到平衡。而空白聚合物BP 的吸附量随时间延长迅速增加直到90 min达到吸附饱和。这是由于MIP 的孔穴由木犀草素分子所印迹，生成的孔穴较大，有利于模板分子由液相到固相的传质，因此吸附实验开始阶段呈现出较快的吸附速度。但随着时间的增加，模板分子的浅孔被逐渐结合饱和，由于其向MIP 深孔的传质有一定的位阻使吸附速度下
Q ×10−2/ m g ⋅g −1
t / h
图1 分子印迹聚合物的吸附动力学曲线 Fig.1 The adsorption kinetics curves of luteolin MIP
降，从而吸附量增加渐缓乃至达到平衡。而空白聚合物中没有有序排列的而且与模板分子结构相对应的立体孔穴，因此主要存在非模板聚合物表面的非异性吸附作用，所以很快就能达吸附平衡。 3.2 分子印迹聚合物的固相萃取选择性能
图2中，V (乙醇):V (水)=1:1能把芦丁洗脱下来而木犀草素保留，强洗脱阶段V (甲醇):V (乙酸)=8:2可以把木犀草素洗脱下来。V (乙醇):V (水)=1:1水含量高，增加了离子作用或疏水作用，使得木犀草素保留增加而不易洗脱。强洗脱阶段乙酸使溶液极性增强，破坏了氢键作用，使木犀草素的保留减弱而洗脱下来。
由图2、图3可推断，木犀草素由于空间结构与木犀草素分子印迹聚合物的孔穴相吻合，形成了特异性吸附，而芦丁由于3位上的羟基连有一个鼠李糖和一个葡萄糖，容易形成较大的空间位阻，不能与木犀草素分子印迹聚合物的孔穴吻合产生特异性吸附，只能形成非特异性吸附，故芦丁容易被洗脱而木犀草素不易洗脱，因此，所制备的分子印迹固相萃取柱对木犀草素具有高度的选择能力。由于非印迹聚合物(NMIP)不具备与印迹分子相吻合的空间结构以形成特异性吸附，只能形成非特异性吸附，因此，如
第23卷第2期 潘浪胜等： 木犀草素分子印迹聚合物的分子识别特性及固相萃取研究 363
图3所示，当用较弱的洗脱液洗脱时，木犀草素跟芦丁均被微量洗脱，但当用较强的洗脱液洗脱时，芦丁和木犀草素全都被大量洗下来。
1
2
1
2
a b c
0 2 4 6 8 10 t / min
图2 分子印迹聚合物固相萃取两种结构相似物的色谱图
similar components
a-before the solid-phase extraction; b-eluent of V (ethanol):V (water) =1:1; c- eluent of V (mehanol):V (acetic
acid)=8:2; 1-rutin; 2-luteolin
t / min
图3 非模板聚合物固相萃取两种结构相似物的色谱图 Fig.3 HPLC chromatograms of NMIP extracting two
structural similar components
a-before the solid-phase extraction; b-eluent of V (ethanol):V (water) =1:1; c- eluent of V (mehanol):V (acetic
acid)=8:2; 1-rutin; 2-luteolin
a b c
0 2 4 6 8 10
Fig.2 HPLC chromatograms of MIP extracting two structural
3.3 分子印迹聚合物固相萃取花生壳提取物中的木犀草素
在床层高度90 mm的分子印迹聚合物固相萃取柱中上载样品后，先用6 mL V (乙醇):V (水)=1:1的溶液清洗，再用6 mLV (乙醇):V (水)=7:5的溶液洗脱，收集洗脱剂V (乙醇):V (水)= 7:5部分并浓缩至干，得到的木犀草素纯度达94.1%，回收率为90.0%。固相萃取前样品和萃取后收集的含木犀草素的溶液的色谱图见图4。水含量高时洗脱能力弱，原因是水含量高时增加了离子作用或疏水作用，使得木犀草素不易洗脱。 3.4 重复使用分子印迹聚合物的分离效果
分子印迹聚合物固相萃取1次后，按3.3节操作条件重复使用3次，结果见表1。由表1可知，分子印迹聚合物重复使用3次，分离效果未见明显变化。因为分子印迹聚合物对物料中的杂质不产生特异性吸附，使得其可多次重复使用而分离效果基本不变。
表1 重复使用分子印迹聚合物的分离结果
Table 1 Lutelin purification results of using repeatedly used MIP
b
0 2 4 6 8 10 12 14 16 t / min
图4 分子印迹聚合物对花生壳提取物的固相萃取色谱图 Fig.4 HPLC chromatograms of MIP extracting luteolin
from peanut shell extraction
a-before the solid-phase extraction; b-eluent of
V (ethanol):V (water)=7:5; 1-luteolin
a
1
Repeated times Purity Recovery
1 94.4 89.6 2 92.7 91.8 3 93.2 90.7
4 结 论
(1) 木犀草素分子印迹聚合物对木犀草素具有很高的选择性和识别能力，而空白聚合物不具备这样的特性。
(2) 木犀草素分子印迹聚合物固相萃取花生壳提取物，分离其中的木犀草素活性成分，木犀草素的纯度可由1.6％提高到92％以上，回收率90％左右。分子印迹聚合物重复使用3次，分离效果基本不变。
(3) 本文的研究结果对从复杂的天然产物中高效分离富集黄酮类活性成分木犀草素有一定的指导作用。
364 高 校 化 学 工 程 学 报 2009年4月
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