项目三SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白质分子量
一实训目的
1掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作步骤 2学会聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理 二实训原理
用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质（protein），主要依赖于电荷效应和分子筛效应。再与标准样品对照即可确定各区带的成分。要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必须去掉其电荷效应，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小。SDS能破坏蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键使蛋白质的构象发生变化，继而使蛋白质变性解离成单一亚基，从而降低或消除了各种蛋白质分子间的天然电荷差异，形成SDS-蛋白质负离子，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小，当蛋白质分子量在1.2X104～16.5X104之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈直线关系，符合下列方程。
LogMW＝K－bm
(LogMW为分子量的对数，K、b为常数，m为迁移率)
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量. 三、实训器材
配制方法
1、浓缩胶缓冲液：1.5克Tris、12.0毫升1mol HCl，加水混匀定容至25毫升。 2、分离胶缓冲液：18.15克Tris、48.0毫升1 mol HCl，加水混匀定容至100毫升。 3、电极缓冲液：3克Tris，14.4克甘氨酸、1克SDS，加水混匀定容至1000毫升。 4、1％过硫酸铵：1克过硫酸铵溶于l00ml蒸馏水中，临用前配制。
5、样本缓冲液(Tris-HCl pH6.8 I＝0.0625M)：取浓缩胶缓冲液(B液)1：7(v/v)稀释。 6、样本变性液(Tris-HCl pH6.8 I=0.01M，2％SDS， 10％蔗糖，0.001％溴酚兰)；0.8克SDS， 4克蔗糖溶于样本缓冲液定容至20毫升，再1滴0.1％溴酚兰。使用时与样本l:1(v/v)混匀。 7、固定液：57.0克TCA，17.0磺基水杨酸，150毫升甲醇，加水350毫升混匀。 或25％异丙醇和10％乙酸的混合液中1h，蛋白质就得到固定了。
8、染色液：1.25克考马斯亮兰R-250，227毫升甲醇，227毫升水，46毫升冰乙酸混匀，滤
纸过滤。
9、脱色液：10％乙醇-70％醋酸。100毫升乙醇，70毫升醋酸加水混匀定容至1000毫升。 10、保存液：10％乙醇-10％醋酸-10％甘油，100毫升乙醇，100毫升醋酸，100毫升甘油加
水混匀定容至1000毫升。
11、指示染料液：0.1溴酚兰(BPB)，100毫克溴酚兰溶于100毫升水中。
四、实训步骤
（一）制备聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. 电泳槽的安装：
干燥的两块玻璃板装入配套塑料夹套内，垂直固定在电泳槽上，周边用1.5％的琼脂密封。 2. 样品处理：
将各种标准蛋白质和待测样品分别溶于蛋白质处理液（浓度2mg/ml），在沸水中加热3～4min，待冷却后作点样用。
3. 制胶：选择合适的胶浓度按下表配制7.5％的分离胶，（为小孔胶，进行电泳和分子筛分离）
1、分离胶的制备：10％（催化剂过硫酸铵，加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED） 试 剂 分离胶 （10％）（单位：ml） A液 3 C液 1.85 蒸馏水 3.5 1%TEMED 0.6
E 0.05 总量9ml，化学聚合30－60分钟
2、浓缩胶的制备：4.5％为大孔胶，进行样品浓缩，
试 剂 浓缩胶 （10％）（单位：ml） A液 0.43 C液 1.25 蒸馏水 0.9 1%TEMED 0.25
E 0.015 总量2.845ml，光聚合30－60分钟（催化剂核黄素，加速剂（TENED）
混合后将其沿长玻璃板加入两块玻璃板之间（小心不要产生气泡），加到距短玻璃板上边缘3cm处，立即覆盖2～3mm水层，静止聚合约40min左右。胶聚合好的标志是胶与水之间形成清晰的界面。吸取分离胶的水分，将配制好的浓缩胶注入分离胶之上，立即插上有机玻璃的点样槽模板，待浓缩胶聚合好备用。 4. 点样：
用微量注射器分别吸取标准蛋白质样品液5μl，按分子量（从小到大）的顺序注入样品槽内的浓缩胶面上，同时吸取待测样品液25μl，注入其它样品槽内，在样品上小心地注入电极缓冲液。 5. 电泳：
加样完毕，两槽注入电极缓冲液，接通电源（上负下正），调节电流为15mA，当指示剂进入分离胶后，电流需加大到30mA，电压恒定在80～100伏之间，约3～4h后，指示剂达到距前沿1～2cm时，可终止电泳。 6. 固定：
胶取出后，在水中浸泡10min，浸出部分SDS，然后将胶浸泡在25％异丙醇和10％乙酸的混合液中1h，蛋白质就得到固定了。
7. 染色：
取出凝胶板，测定胶长（D1）后，加入染色液染色2h。 8. 脱色
将胶放在脱色液中脱色0.5h，每隔0.5h换一次脱色液，至少换3次，待蓝色基本脱掉，再放在脱色液里浸泡至蛋白质谱带清晰为止，精确测定胶长（D2）。 （二）、蛋白质标准样品迁移率和待测样品分子量的计算 根据蛋白质分子量对数和电泳迁移率的关系，精确测量溴酚蓝和各种蛋白质迁移距离。把溴酚蓝迁移的距离定为d1，蛋白质迁移距离定为d2，并以D1定为凝胶染色前的长度，D2定为凝胶染色后的长度。根据下面公式计算各种蛋白质的迁移率Rm：Rm＝d2d1×D1D2以标准蛋白质的迁移率为横座标，以其对应的分子量对数为纵座标，绘制标准曲线，可得到一条直线，然后根据未知样品的迁移率，在半对数座标图上查出其对应的分子量。要得到一个可靠的结果，实验需多次重复。 五、实训结果 分离胶未凝固
六、实训结果分析
1、加入催化剂过硫酸铵的量或浓度不够，导致分离胶的聚合时间过长，可适当加大过硫酸铵的量或增大过硫酸铵的浓度，
2、操作的室温温度过低，延长聚合时间，必要时可用电炉在电泳槽旁加热，缩短聚合时间 3、过硫酸铵过期，起不到催化作用
4、垂直玻璃板的底部应与底部橡胶边缘紧密结合，避免分离胶凝固就漏胶。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳色谱
项目三SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白质分子量
一实训目的
1掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作步骤 2学会聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理 二实训原理
用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质（protein），主要依赖于电荷效应和分子筛效应。再与标准样品对照即可确定各区带的成分。要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必须去掉其电荷效应，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小。SDS能破坏蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键使蛋白质的构象发生变化，继而使蛋白质变性解离成单一亚基，从而降低或消除了各种蛋白质分子间的天然电荷差异，形成SDS-蛋白质负离子，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小，当蛋白质分子量在1.2X104～16.5X104之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈直线关系，符合下列方程。
LogMW＝K－bm
(LogMW为分子量的对数，K、b为常数，m为迁移率)
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量. 三、实训器材
配制方法
1、浓缩胶缓冲液：1.5克Tris、12.0毫升1mol HCl，加水混匀定容至25毫升。 2、分离胶缓冲液：18.15克Tris、48.0毫升1 mol HCl，加水混匀定容至100毫升。 3、电极缓冲液：3克Tris，14.4克甘氨酸、1克SDS，加水混匀定容至1000毫升。 4、1％过硫酸铵：1克过硫酸铵溶于l00ml蒸馏水中，临用前配制。
5、样本缓冲液(Tris-HCl pH6.8 I＝0.0625M)：取浓缩胶缓冲液(B液)1：7(v/v)稀释。 6、样本变性液(Tris-HCl pH6.8 I=0.01M，2％SDS， 10％蔗糖，0.001％溴酚兰)；0.8克SDS， 4克蔗糖溶于样本缓冲液定容至20毫升，再1滴0.1％溴酚兰。使用时与样本l:1(v/v)混匀。 7、固定液：57.0克TCA，17.0磺基水杨酸，150毫升甲醇，加水350毫升混匀。 或25％异丙醇和10％乙酸的混合液中1h，蛋白质就得到固定了。
8、染色液：1.25克考马斯亮兰R-250，227毫升甲醇，227毫升水，46毫升冰乙酸混匀，滤
纸过滤。
9、脱色液：10％乙醇-70％醋酸。100毫升乙醇，70毫升醋酸加水混匀定容至1000毫升。 10、保存液：10％乙醇-10％醋酸-10％甘油，100毫升乙醇，100毫升醋酸，100毫升甘油加
水混匀定容至1000毫升。
11、指示染料液：0.1溴酚兰(BPB)，100毫克溴酚兰溶于100毫升水中。
四、实训步骤
（一）制备聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. 电泳槽的安装：
干燥的两块玻璃板装入配套塑料夹套内，垂直固定在电泳槽上，周边用1.5％的琼脂密封。 2. 样品处理：
将各种标准蛋白质和待测样品分别溶于蛋白质处理液（浓度2mg/ml），在沸水中加热3～4min，待冷却后作点样用。
3. 制胶：选择合适的胶浓度按下表配制7.5％的分离胶，（为小孔胶，进行电泳和分子筛分离）
1、分离胶的制备：10％（催化剂过硫酸铵，加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED） 试 剂 分离胶 （10％）（单位：ml） A液 3 C液 1.85 蒸馏水 3.5 1%TEMED 0.6
E 0.05 总量9ml，化学聚合30－60分钟
2、浓缩胶的制备：4.5％为大孔胶，进行样品浓缩，
试 剂 浓缩胶 （10％）（单位：ml） A液 0.43 C液 1.25 蒸馏水 0.9 1%TEMED 0.25
E 0.015 总量2.845ml，光聚合30－60分钟（催化剂核黄素，加速剂（TENED）
混合后将其沿长玻璃板加入两块玻璃板之间（小心不要产生气泡），加到距短玻璃板上边缘3cm处，立即覆盖2～3mm水层，静止聚合约40min左右。胶聚合好的标志是胶与水之间形成清晰的界面。吸取分离胶的水分，将配制好的浓缩胶注入分离胶之上，立即插上有机玻璃的点样槽模板，待浓缩胶聚合好备用。 4. 点样：
用微量注射器分别吸取标准蛋白质样品液5μl，按分子量（从小到大）的顺序注入样品槽内的浓缩胶面上，同时吸取待测样品液25μl，注入其它样品槽内，在样品上小心地注入电极缓冲液。 5. 电泳：
加样完毕，两槽注入电极缓冲液，接通电源（上负下正），调节电流为15mA，当指示剂进入分离胶后，电流需加大到30mA，电压恒定在80～100伏之间，约3～4h后，指示剂达到距前沿1～2cm时，可终止电泳。 6. 固定：
胶取出后，在水中浸泡10min，浸出部分SDS，然后将胶浸泡在25％异丙醇和10％乙酸的混合液中1h，蛋白质就得到固定了。
7. 染色：
取出凝胶板，测定胶长（D1）后，加入染色液染色2h。 8. 脱色
将胶放在脱色液中脱色0.5h，每隔0.5h换一次脱色液，至少换3次，待蓝色基本脱掉，再放在脱色液里浸泡至蛋白质谱带清晰为止，精确测定胶长（D2）。 （二）、蛋白质标准样品迁移率和待测样品分子量的计算 根据蛋白质分子量对数和电泳迁移率的关系，精确测量溴酚蓝和各种蛋白质迁移距离。把溴酚蓝迁移的距离定为d1，蛋白质迁移距离定为d2，并以D1定为凝胶染色前的长度，D2定为凝胶染色后的长度。根据下面公式计算各种蛋白质的迁移率Rm：Rm＝d2d1×D1D2以标准蛋白质的迁移率为横座标，以其对应的分子量对数为纵座标，绘制标准曲线，可得到一条直线，然后根据未知样品的迁移率，在半对数座标图上查出其对应的分子量。要得到一个可靠的结果，实验需多次重复。 五、实训结果 分离胶未凝固
六、实训结果分析
1、加入催化剂过硫酸铵的量或浓度不够，导致分离胶的聚合时间过长，可适当加大过硫酸铵的量或增大过硫酸铵的浓度，
2、操作的室温温度过低，延长聚合时间，必要时可用电炉在电泳槽旁加热，缩短聚合时间 3、过硫酸铵过期，起不到催化作用
4、垂直玻璃板的底部应与底部橡胶边缘紧密结合，避免分离胶凝固就漏胶。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳色谱