华南师范大学学报(自然科学版)
2012年2月JOURNAL OF SOUTH CHINA NORMAL UNIVERSITY 第44卷第1期
(NATURAL SCIENCE EDITION) Feb. 2012 Vol. 44 No. 1文章编号:1000-5463(2012) 01-0103-06
小鼠孤雌生殖胚胎干细胞的分离及分化潜能研究
曾晓辉, 张玉影, 邓禄刚, 李雪峰
*
(华南师范大学生命科学学院, 广东广州510631)
摘要:从小鼠孤雌生殖的胚胎中可分离出孤此雌生殖胚胎干细胞(pES) , 3传代培养25代, 能表达很强的碱性磷酸酶, 核型稳定呈40XX; 培养至第18代在体内可诱导肿瘤形成, 并分化为3个胚层的组织细胞. 免疫组化结果显示神经细胞特异性烯醇化酶(NSE) 、肌肉特异性肌动蛋白A -actin 均呈阳性, 传至第20~24代的pES 细胞, 经体外定向诱导分化为节律性收缩的心肌细胞及神经细胞. 免疫组化检测显示节律性收缩的心肌细胞表达A -actin, 而神经细胞表达NSE. 结果表明:利用免疫外科法可从孤雌生殖的小鼠胚胎建立pES, 这些pES 在体内、体外都具有分化为多种类型细胞的潜能.
关键词:小鼠; 孤雌生殖; 胚胎干细胞; 分化潜能中图分类号:Q132. 4; Q132. 8; Q813 文献标志码:A
胚胎干细胞(ES) 具有无限增殖的能力, 并可在体外被诱导分化为特定的细胞, 在人类疾病的细胞或组织替代治疗中发挥着极其重要的作用, ES 细胞也是基因打靶的重要条件之一, 成为近年来生命科学领域研究的焦点. 最早分离ES 细胞的方法是从囊胚内细胞团中进行分离
[1-2]
胎干细胞(pES) , 建立并完善小鼠pES 分离与克隆的技术体系; 并对分离的pES 的分化潜能进行了体内、体外初步研究, 对体内和体外分化的细胞进行免疫组织化学和免疫细胞化学鉴定, 以期探明小鼠pES 细胞是否具有与正常受精ES 细胞同样的发育潜能.
, 但这种分离ES 的方
法势必破坏本身具有发育为完整个体的受精卵为代价, 这在人类ES 细胞的分离与培养上将会涉及诸多的伦理问题. 为避免由损伤正常胚胎发育所致的伦理问题, 利用细胞融合的方法将体细胞与已建系的干细胞融合, 诱导体细胞具有干细胞的特性或者将早期胚胎的单个卵裂球培养为ES 细胞胞
[5]
[3][4]
1 材料和方法
1. 1 材料
SPF 级昆明(KM) 小鼠、豚鼠及清洁级新西兰白兔均购自广州中医药大学动物实验中心.
Knockout DMEM 、Knockout 血清替代品(KSR) 、B -巯基乙醇(B -ME ) 、胰蛋白酶液(0125%Trypsin +0.02%EDTA) 等为Gibco 公司产品; 视黄酸(RA, CAS#:302-79-4) 和重组小鼠白血病抑制因子(mLIF) 由MbChem 生产.
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP) 生化检测试剂盒为上海科华东菱公司产品; 免疫组化分析用抗体) ) ) 兔抗鼠肌肉特异性肌动蛋白A -actin 、兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶(NSE) 及二抗异硫氰酸荧光素(FITC) 标记的羊抗兔IgG, 均由武汉博士德生物工程有限公司生产; NycoPrep
TM
, ,
或者通过基因转移诱导体细胞转变为多能干细
, 但这些方法获得干细胞的效率相对较低, 远远低于从囊胚内细胞团分离ES 的效率. 卵母细胞经孤雌激活后得到的孤雌生殖胚胎, 其早期发育特征与正常受精卵相同, 但哺乳动物孤雌生殖胚胎无发育为个体的潜力. 因此, 从孤雌生殖胚胎分离干细胞, 若其具有正常干细胞的发育潜能, 将减少因利用人类早期胚胎建立ES 所产生的道德和伦理上的争议, 是分离ES 细胞的另一种措施, 对人类治疗性克隆开辟一条新途径
[6]
.
本研究通过免疫外科法分离孤雌生殖胚胎的胚
收稿日期:2011-05-02
1. 077A 小鼠
基金项目:国家自然科学基金项目(30370724) ; 广东省自然科学基金项目([**************]16) *通讯作者, lixf@scnu. edu. cn
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华南师范大学学报(自然科学版) 第44卷
淋巴细胞分离液产自天津灏洋生物制品科技有限责任公司.
实验用其他试剂均为Sigma 公司分析纯产品. 1. 2 实验方法
1. 2. 1 兔抗鼠抗血清与补体制备 采用常规免疫方法, 用小鼠脾脏分离的淋巴细胞作为抗原, 连续静脉免疫兔4周, 耳静脉采血进行抗血清效价测定. 当血清效价达到1/8以上时, 心脏采血制备兔抗鼠抗血清, 56e 水浴灭活30min, 过滤除菌, 分装, -20e 保存备用.
本实验用豚鼠血清作为补体. 经心脏采血制备豚鼠血清, 过滤除菌, 分装, -20e 保存备用. 1. 2. 2 卵母细胞的孤雌激活与培养 参照张玉影等
[7]
1mL 碱性磷酸酶显色缓冲液中, 加入对甲苯胺兰、氯化硝基四氮唑蓝各50L L, 充分混合后加入到pES 细胞样集落的皿中, 室温中避光孵育约20min, 显色, 自来水冲洗以终止反应.
1. 2. 4 pES 的细胞核型分析 取传代到第10~15代的pES 细胞, 传代培养3d 后, 用含0. 08mg /L秋水仙素的培养液处理2h; 吸出含秋水仙素的溶液, 加入0. 25%Trypsin +0102%EDTA 消化成单细胞悬液, 再用0. 075mol/L氯化钾低渗处理15min, 用甲醇-冰醋酸固定后, 滴片, 改良品红染色, 油镜观察, 对细胞进行核型分析. 1. 2. 5 pES 细胞的体外分化实验
(1) 类胚体(embryonic bodies, EB) 形成实验 取指数生长期的pES 细胞集落, 用0105%Trypsin +0102%EDTA 消化成小的细胞团块, 离心去掉消化液, 用不添加mLIF 的pES 细胞培养液按1@10个/L密度重悬细胞. 将25L L 上述细胞悬液接种于培养皿的皿盖内部上, 加入5mL PBS 液, 放入培养箱中培养, 每天半量更换培养液; 待EB 形成后转入四孔板中, 加入不含mLIF 的干细胞培养液继续培养, 为体外分化做好准备.
(2) pES 细胞体外分化为心肌细胞 将EB 接种到铺有明胶的培养皿内培养, 用添加1@10
-8
8
的方法进行小鼠卵细胞的孤雌激活与培养. (1) 内细胞团的分离
将发育到囊胚或扩张囊胚期的孤雌生殖小鼠胚
1. 2. 3 小鼠pES 细胞的建系
胎分别放入平衡好的酸性泰酪式液中, 待囊胚透明带变薄后立即转移到PBS 中清洗; 然后将无透明带的小鼠孤雌生殖胚胎移入稀释到1/16的兔抗鼠血清中, 培养箱培养20min, PBS 洗去抗血清; 移入稀释到1/16的豚鼠血清中作用10~15min; 用PBS 洗胚胎2次, 每次2min; 转入新的PBS 中, 用前端直径为20~30L m 的吸管轻轻吹打, 去除滋养外胚层即可得到内胞团.
(2) 孤雌生殖胚胎干细胞(pES) 的克隆与培养传代
将分离的内细胞团立即接入丝裂霉素C 处理好的饲养层细胞上, 37e 、5%CO 2、饱和湿度下培养, 每天更换添加1000U /mLmLIF 的ES 基础培养液(80%Knockout DMEM +20%KSR +0.1mmol/LB -ME +4mmol/LL -Glutamin +100L g /mL青霉素+100L g /mL链霉素+1%非必需氨基酸) . 内细胞团接种后24h 出现贴壁, 2d 可见具有典型的核大的小细胞长出, 3~4d 后用细玻璃管取出, 用0. 05%Trypsin +0. 02%EDTA 组成的消化液消化2min, 转入ES 细胞培养液中, 细吸管吹打, 将打散的小细胞团块接种到新的处理好的饲养层细胞上, 每天更换培养液, 2~3d 后可见典型的ES 细胞集落, 3~4d 后可继续传代.
(3) pES 集落的碱性磷酸酶鉴定
取第1、2、15代的pES 细胞集落, 用4%多聚甲, mol/LRA +0.75%DMSO 的ES 基础培养液组成的肌肉细胞定向诱导分化液培养EB, 每天更换诱导培养液; 待诱导分化10d 出现有节律性跳动的细胞团块时, 进行常规免疫组织化学染色, 一抗为兔抗鼠肌肉特异性肌动蛋白A -actin (1B 100) , 二抗为异硫氰酸荧光素(FITC) 标记的羊抗兔IgG (1B 100) . 阴性对照组以0. 01mol/LPBS 代替一抗.
(3) pES 细胞体外分化为神经细胞 将EB 接种到铺有明胶的培养皿内培养, 用添加5@10
-7
mol/LRA 的ES 基础培养液组成的神经细胞定向诱导分化液培养EB, 每天更换诱导培养液; 培养6~8d 后, EB 松散出许多单个的细胞, 10~12d, 这些散开的单细胞就贴壁生长. 进行常规免疫细胞化学染色, 一抗为兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶(NSE) (1B 100) , 二抗为异硫氰酸荧光素(FITC) 标记的羊抗兔IgG (1B 100) . 阴性对照组以0. 01mol/LPBS 代替一抗.
1. 2. 6 pES 细胞的体内分化实验 将传至18代的小鼠pES 细胞消化后, 接种至小鼠睾丸的被膜下, 4.
第1期曾晓辉等:小鼠孤雌生殖胚胎干细胞的分离及分化潜能研究
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膜下形成肿瘤, 将肿瘤进行常规石蜡切片, HE 染色, 显微镜观察.
2 结果
2. 1 小鼠pES 细胞的AKP 染色及核型分析
小鼠胚胎孤雌激活发育到扩张囊胚时期, 去掉透明带后(图1A) , 在抗血清中孵育20min 后, 移入补体孵育约20min, 滋养外胚层细胞肿胀(图1B) , 轻轻吹打, 分离得到内细胞团(图1C) . 经培养3~4d 后可见生长出原代pES 细胞(图1D) . 原代pES 经碱性磷酸酶检测呈阳性(图1E) , 经胰酶消化和多次传代培养可形成形态正常的pES 细胞克隆(图1F)
.
A:第2代pES AKP 呈强阳性; B:第15代pES AKP 呈强阳性; C, D:pES 的染色体与核型分析; 标尺=200L m
图2 pES 细胞的AKP 染色及核型鉴定
Figure 2 The activity of alkaline phosphate enzyme of pES and
karyotype assessment
2. 2 小鼠pES 细胞的体外分化
分别用肌肉细胞定向诱导分化液、神经细胞定向诱导分化液诱导培养EB, 大约诱导10d 后, 出现有节律性的收缩心肌细胞(图3A) 和神经细胞(图3C) . 用肌肉组织和神经组织特异性抗体进行免疫细胞化学分析, 结果显示心肌细胞表达肌肉特异性肌动蛋白A -actin(图3B) , 而神经细胞表达神经元特异性烯醇化酶NSE (图3D) ; 表明小鼠pES 细胞在体外具有分化为中胚层和外胚层的潜能, 与正常受精胚胎建系的ES 细胞系有相同的体外分化能力
.
A:孤雌生殖囊胚; B:抗体、补体作用后滋养外胚层细胞肿胀; C:分离得到的内细胞团; D:原代pES; E:原代pES 的碱性磷酸活性检测; F:第25代时pES 细胞; 标尺=100L m
图1 内细胞团的分离及pES 的培养
Figure 1 Isolation of inner cell mass and culture of mouse pES
选取第2代和第15代的pES, 用AKP 生化检测试剂盒染色ES 细胞集落, 都能表达很强的碱性磷酸酶(图2A 和2B) , 表明原代pES 细胞在传代的过程中仍保持干细胞特性. 对传代10~15代的小鼠pES 细胞进行核型分析, 结果显示pES 细胞染色体为40条(图2C, 2D)
.
A:相差显微镜下的心肌细胞; B:心肌细胞呈A -actin 阳性; C:相差显微镜下的神经细胞; D:神经细胞呈NSE 阳性; 标尺=100L m
图3 小鼠孤雌生殖胚胎干细胞体外分化的免疫荧光检测Figure 3 Immunocytochemistry of the differentiated mouse pES
in vitro
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华南师范大学学报(自然科学版) 第44卷
2. 3 小鼠pES 细胞的体内分化
将传至18代的小鼠pES 细胞移植到小鼠睾丸被膜下, 5周后, 移植的8只中, 有2只小鼠睾丸异常增大, 睾丸被膜下形成肿瘤, 显微观察可见肿瘤组织中含有3个胚层来源的组织细胞(图4) :有源于外胚层的鳞状上皮和中枢神经组织等; 源于中胚层的软骨细胞和肌肉组织等; 源于内胚层的柱状上皮和肠管样组织等. 表明小鼠pES 细胞在体内具有分化为3个胚层组织的潜能, 与正常受精胚胎建系的ES 细胞系有相似的分化能力
.
育的机制, 鉴定、获得其关键基因; 建立ES 细胞向心肌细胞定向诱导分化的合适培养系统, 是目前该研究领域亟待解决的问题.
尽管对ES 细胞定向分化为心肌细胞的分子机制还不清楚, 但DMSO 是常用的诱导分化剂, 能诱导ES 细胞分化为心肌细胞、骨骼肌细胞, 其作用机制主要是抑制c -myc 基因表达, 降低细胞内源性聚腺苷二磷酸核苷水平. 此外, 有人发现维生素C 可显著提高ES 细胞向心肌细胞分化的效率, 使ES 细胞可发生自动节律性收缩, 肌小节肌球蛋白和A
[9]
-辅肌动蛋白染色呈阳性. 目前认为心肌发生相关因子, 如转化生长因子B (TGF -B ) 、骨形态发生蛋白(BMP) 、Wnt 家族蛋白和成纤维细胞生长因子(FGF) 等, 可促进ES 细胞分化为心肌细胞, 增加心
[10]
肌细胞的分化效率. 近年来, 血清对于ES 细胞分化的影响越来越受到重视, 无血清培养基可能更有利于ES 细胞向心肌细胞分化. PASSIER 等采用无血清培养基诱导ES 细胞, 发现其向心肌细胞分化的效率明显提高, 心肌自发搏动的数量较含血清培养增加了24倍, 如果在培养体系中加入维生素C, 分化效率还可以提高40%, 同时心肌特异性的蛋白标志物表达也增加. 在无血清培养基DMEM 中添加KSR 和BMP4, 可以促进小鼠ES 细胞向跳动样心肌细胞分化的比率
[12]
[11]
.
本研究将分离培养的pES 细胞经体外悬浮培
-8
养先形成EB, 在含有1@10mol/LRA 和0. 75%DMSO 的定向诱导培养液来诱导培养EB; EB 经诱
A:鳞状上皮; B:中枢神经组织; C:软骨细胞; D:肌肉组织; E:柱状上皮; F:肠管样组织; 标尺=200L m
导分化大约10d 后, 分化为可自发节律性收缩的细胞团; 免疫组化检测发现节律性收缩的细胞团表达肌肉细胞特异性表达的肌动蛋白A -actin, 表明pES 被成功定向诱导为心肌细胞. 结果表明RA 和DMSO 联合作用可有效地诱导ES 细胞定向分化为心肌细胞.
3. 1. 2 pES 细胞向神经细胞的分化 视黄酸(RA) 在中枢神经、皮肤及骨骼系统的发育过程中具有重要作用. 许多实验证明, RA 是诱导ES 细胞定向分化为神经细胞常用的诱导剂. RA 属脂溶性甾体类激素家族, 扩散进入细胞后与其胞内受体CRABP (cellular retinoic acid binding protein) 结合, 形成复合物转入细胞核调控一系列基因的表达, 最终使细胞表型发生转变引起细胞分化. WILES 等
[13]
图4 小鼠孤雌生殖胚胎干细胞体内分化结果Figure 4 Differentitation of mouse pES in vivo
3 讨论
3. 1 pES 细胞的体外定向诱导分化
ES 细胞体外分化分为一般分化和定向分化2类. 一般分化是指不加入任何诱导剂, 让其自然分化为不同类型的细胞, 但由于分化的细胞较杂, 应用意义不大. 定向分化指针对不同的靶细胞, 选择不同的分化方法和分化诱导剂, 使其发生特异性分化
[7-8]
,
是目前ES 分化研究的主要目标, 也是ES 细胞进行细胞替代治疗的基础.
3. 1. 1 pES 细胞向心肌细胞的分化 研究ES 细胞发现,
RA 可通过激活抑胰蛋白(follistatin) 来抑制骨形成蛋白, 从而使小鼠ES 细胞向神经细胞方向分化.
第1期曾晓辉等:小鼠孤雌生殖胚胎干细胞的分离及分化潜能研究
107
细胞分化, 还可以抑制LIF 信号促进ES 细胞分化. STRUBING 等
[14]
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Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into in gives Nature,
2006,
439
发现, 在无LIF 的培养条件下, ES
细胞自发分化为神经细胞的比例仅为15%~30%, 而用RA 诱导后EB 中几乎全部细胞分化成神经细胞. SCHULDINER 等
[15]
也证实, 用高浓度RA(10
-6
mol /L)诱导人ES 细胞产生的神经细胞比未用RA 处理的增加22%.
本研究用不含mLIF 的胚胎干细胞培养液, 添加5@10
-7
mol /LRA, 来诱导pES 细胞得到了神经
样细胞, 免疫组化结果显示诱导出的神经细胞表达神经细胞特异性烯醇化酶NSE. 结果也证明RA 可诱导ES 细胞定向分化为神经细胞.
3. 2 pES 细胞的体内分化
检测ES 细胞体内分化潜力的一种重要方法是将ES 细胞注射入同源动物皮下、睾丸被膜等部位, 可诱导形成畸胎瘤, 畸胎瘤中含有来源于3个胚层的细胞. KIM 等
[16]
人将小鼠pES 细胞接种到裸鼠皮
下可形成了畸胎瘤, 畸胎瘤中含有3个胚层来源的细胞; 并将小鼠pES 细胞注射到小鼠315d 囊胚中, pES 细胞可以参与胚胎发育并产生有毛色嵌合的小鼠. 标明小鼠pES 具有多种分化潜能.
本研究将分离的pES 注射入同种动物睾丸被膜下, 发现pES 可诱导肿瘤的形成, 组织切片表明, 所获得的肿瘤组织中存在多种类型的组织细胞, 如:有源于外胚层的鳞状上皮和中枢神经组织; 源于中胚层的软骨细胞和肌肉组织; 源于内胚层的柱状上皮和肠管样组织等. 结果证明所分离获得的小鼠pES 细胞具有分化发育成源于3个胚层的组织细胞类型的能力, 具有与正常受精胚胎中分离的ES 细胞完全相同的分化潜能.
4 结论
利用免疫外科法从孤雌生殖的小鼠胚胎可分离出孤雌生殖胚胎干细胞(pES) , 这些pES 在体内、体外都具有分化为多种类型细胞的潜能. 该方法可为从人孤雌生殖胚胎中分离干细胞提供一种技术参考. 参考文献:
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Isolation and Differentiation Potential of Mouse Parthenogenetic Embryonic Stem Cells
ZENG Xiaohui, ZHANG Yuying, DENG Lugang, LI Xuefeng *
(School of Life Science, South China Normal Univers ity, Guangz hou 510631, China)
Abstract:Mouse pES isolated from mouse parthenogenetic blastocysts have the ability to proliferate at least 25gen 2erations in vitro and show very strong activity of alkaline phosphate enzyme. The karyotype of pES was showed as 40XX. To investigate the diffenentiation potential of mouse pES in vivo, pES at the 18generation were trypsinized and transferred into the testicle envelope of Kunming mouse, histomorphological analysis showed that pES main 2tained the developmental potential to differentiate into advanced derivatives of all three primary germ layers -ecto 2derm, endoderm and mesoderm -in vivo. Immuno histochemical results showed that mouse testis had Neuron spe 2cific enolase (NSE) and muscle specific A -actin positive cells which derived from pES. Mouse pES at 20to 24passages were directionally induced to differentiate in vitro. The results showed that they can be induced into nerve cells and myocardial cells with the rhythm of contraction. Immunocytochemistry showed that myocardial cells were A -actin positive and nerve cells were NSE positive.
Key words:mouse; parthenogenetic; ES; differentiation potential
【责任编辑 成 文】
(上接第102页)
Construction of Suppression Subtractive Hybridization Library from the Floral Buds of Paphiopedilum Micranthum
WANG Yanjun 1, WEN Zhenzhen 2, ZHANG E 2, TAN Zhiyong 1, WANG Yaping 1, LIU Yunquan 2, LIU Wei 2
(1. Institute of Agricultural Seeds, Dongguan 523063, China;
2. School of Life Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)
Abstract:With high ornamental and research value, Paphiopedilum micranthum is a species of the genus Paphio 2
pedilum native to China, which is endangered and protected intensively by the country. However, there are few re 2ports on its floral development mechanism because of the supply shortage and backward cultivation technology. In this study, a suppression subtractive hybridization (SSH) library was constructed using the cDNAs from the floral and vegetative buds of P. micranthum as the tester and the driver, respectively. The insert fragments were tested by PCR, and 288clones with 500bp or longer from the library were selected for sequencing. Totally, 18ESTs were obtained, after vector sequences removed and clustered. The ESTs were functionally annotated by Blast. Those which matched significantly with Nr database were further classified into functional groups including photosynthesis, biosynthetic metabolism, gene regulation, etc. Among them, a few sequences with homology to transposons or retro -transposons were obtained. The genes differentially expressed in floral buds of P. micranthum isolated in this study could make a base for investigating the molecular mechanism of floral development.
Key words:Paphiopedilum micranthum ; suppression subtractive hybridization (SSH) ; floral development
【责任编辑 成 文】
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2012年2月JOURNAL OF SOUTH CHINA NORMAL UNIVERSITY 第44卷第1期
(NATURAL SCIENCE EDITION) Feb. 2012 Vol. 44 No. 1文章编号:1000-5463(2012) 01-0103-06
小鼠孤雌生殖胚胎干细胞的分离及分化潜能研究
曾晓辉, 张玉影, 邓禄刚, 李雪峰
*
(华南师范大学生命科学学院, 广东广州510631)
摘要:从小鼠孤雌生殖的胚胎中可分离出孤此雌生殖胚胎干细胞(pES) , 3传代培养25代, 能表达很强的碱性磷酸酶, 核型稳定呈40XX; 培养至第18代在体内可诱导肿瘤形成, 并分化为3个胚层的组织细胞. 免疫组化结果显示神经细胞特异性烯醇化酶(NSE) 、肌肉特异性肌动蛋白A -actin 均呈阳性, 传至第20~24代的pES 细胞, 经体外定向诱导分化为节律性收缩的心肌细胞及神经细胞. 免疫组化检测显示节律性收缩的心肌细胞表达A -actin, 而神经细胞表达NSE. 结果表明:利用免疫外科法可从孤雌生殖的小鼠胚胎建立pES, 这些pES 在体内、体外都具有分化为多种类型细胞的潜能.
关键词:小鼠; 孤雌生殖; 胚胎干细胞; 分化潜能中图分类号:Q132. 4; Q132. 8; Q813 文献标志码:A
胚胎干细胞(ES) 具有无限增殖的能力, 并可在体外被诱导分化为特定的细胞, 在人类疾病的细胞或组织替代治疗中发挥着极其重要的作用, ES 细胞也是基因打靶的重要条件之一, 成为近年来生命科学领域研究的焦点. 最早分离ES 细胞的方法是从囊胚内细胞团中进行分离
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胎干细胞(pES) , 建立并完善小鼠pES 分离与克隆的技术体系; 并对分离的pES 的分化潜能进行了体内、体外初步研究, 对体内和体外分化的细胞进行免疫组织化学和免疫细胞化学鉴定, 以期探明小鼠pES 细胞是否具有与正常受精ES 细胞同样的发育潜能.
, 但这种分离ES 的方
法势必破坏本身具有发育为完整个体的受精卵为代价, 这在人类ES 细胞的分离与培养上将会涉及诸多的伦理问题. 为避免由损伤正常胚胎发育所致的伦理问题, 利用细胞融合的方法将体细胞与已建系的干细胞融合, 诱导体细胞具有干细胞的特性或者将早期胚胎的单个卵裂球培养为ES 细胞胞
[5]
[3][4]
1 材料和方法
1. 1 材料
SPF 级昆明(KM) 小鼠、豚鼠及清洁级新西兰白兔均购自广州中医药大学动物实验中心.
Knockout DMEM 、Knockout 血清替代品(KSR) 、B -巯基乙醇(B -ME ) 、胰蛋白酶液(0125%Trypsin +0.02%EDTA) 等为Gibco 公司产品; 视黄酸(RA, CAS#:302-79-4) 和重组小鼠白血病抑制因子(mLIF) 由MbChem 生产.
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP) 生化检测试剂盒为上海科华东菱公司产品; 免疫组化分析用抗体) ) ) 兔抗鼠肌肉特异性肌动蛋白A -actin 、兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶(NSE) 及二抗异硫氰酸荧光素(FITC) 标记的羊抗兔IgG, 均由武汉博士德生物工程有限公司生产; NycoPrep
TM
, ,
或者通过基因转移诱导体细胞转变为多能干细
, 但这些方法获得干细胞的效率相对较低, 远远低于从囊胚内细胞团分离ES 的效率. 卵母细胞经孤雌激活后得到的孤雌生殖胚胎, 其早期发育特征与正常受精卵相同, 但哺乳动物孤雌生殖胚胎无发育为个体的潜力. 因此, 从孤雌生殖胚胎分离干细胞, 若其具有正常干细胞的发育潜能, 将减少因利用人类早期胚胎建立ES 所产生的道德和伦理上的争议, 是分离ES 细胞的另一种措施, 对人类治疗性克隆开辟一条新途径
[6]
.
本研究通过免疫外科法分离孤雌生殖胚胎的胚
收稿日期:2011-05-02
1. 077A 小鼠
基金项目:国家自然科学基金项目(30370724) ; 广东省自然科学基金项目([**************]16) *通讯作者, lixf@scnu. edu. cn
104
华南师范大学学报(自然科学版) 第44卷
淋巴细胞分离液产自天津灏洋生物制品科技有限责任公司.
实验用其他试剂均为Sigma 公司分析纯产品. 1. 2 实验方法
1. 2. 1 兔抗鼠抗血清与补体制备 采用常规免疫方法, 用小鼠脾脏分离的淋巴细胞作为抗原, 连续静脉免疫兔4周, 耳静脉采血进行抗血清效价测定. 当血清效价达到1/8以上时, 心脏采血制备兔抗鼠抗血清, 56e 水浴灭活30min, 过滤除菌, 分装, -20e 保存备用.
本实验用豚鼠血清作为补体. 经心脏采血制备豚鼠血清, 过滤除菌, 分装, -20e 保存备用. 1. 2. 2 卵母细胞的孤雌激活与培养 参照张玉影等
[7]
1mL 碱性磷酸酶显色缓冲液中, 加入对甲苯胺兰、氯化硝基四氮唑蓝各50L L, 充分混合后加入到pES 细胞样集落的皿中, 室温中避光孵育约20min, 显色, 自来水冲洗以终止反应.
1. 2. 4 pES 的细胞核型分析 取传代到第10~15代的pES 细胞, 传代培养3d 后, 用含0. 08mg /L秋水仙素的培养液处理2h; 吸出含秋水仙素的溶液, 加入0. 25%Trypsin +0102%EDTA 消化成单细胞悬液, 再用0. 075mol/L氯化钾低渗处理15min, 用甲醇-冰醋酸固定后, 滴片, 改良品红染色, 油镜观察, 对细胞进行核型分析. 1. 2. 5 pES 细胞的体外分化实验
(1) 类胚体(embryonic bodies, EB) 形成实验 取指数生长期的pES 细胞集落, 用0105%Trypsin +0102%EDTA 消化成小的细胞团块, 离心去掉消化液, 用不添加mLIF 的pES 细胞培养液按1@10个/L密度重悬细胞. 将25L L 上述细胞悬液接种于培养皿的皿盖内部上, 加入5mL PBS 液, 放入培养箱中培养, 每天半量更换培养液; 待EB 形成后转入四孔板中, 加入不含mLIF 的干细胞培养液继续培养, 为体外分化做好准备.
(2) pES 细胞体外分化为心肌细胞 将EB 接种到铺有明胶的培养皿内培养, 用添加1@10
-8
8
的方法进行小鼠卵细胞的孤雌激活与培养. (1) 内细胞团的分离
将发育到囊胚或扩张囊胚期的孤雌生殖小鼠胚
1. 2. 3 小鼠pES 细胞的建系
胎分别放入平衡好的酸性泰酪式液中, 待囊胚透明带变薄后立即转移到PBS 中清洗; 然后将无透明带的小鼠孤雌生殖胚胎移入稀释到1/16的兔抗鼠血清中, 培养箱培养20min, PBS 洗去抗血清; 移入稀释到1/16的豚鼠血清中作用10~15min; 用PBS 洗胚胎2次, 每次2min; 转入新的PBS 中, 用前端直径为20~30L m 的吸管轻轻吹打, 去除滋养外胚层即可得到内胞团.
(2) 孤雌生殖胚胎干细胞(pES) 的克隆与培养传代
将分离的内细胞团立即接入丝裂霉素C 处理好的饲养层细胞上, 37e 、5%CO 2、饱和湿度下培养, 每天更换添加1000U /mLmLIF 的ES 基础培养液(80%Knockout DMEM +20%KSR +0.1mmol/LB -ME +4mmol/LL -Glutamin +100L g /mL青霉素+100L g /mL链霉素+1%非必需氨基酸) . 内细胞团接种后24h 出现贴壁, 2d 可见具有典型的核大的小细胞长出, 3~4d 后用细玻璃管取出, 用0. 05%Trypsin +0. 02%EDTA 组成的消化液消化2min, 转入ES 细胞培养液中, 细吸管吹打, 将打散的小细胞团块接种到新的处理好的饲养层细胞上, 每天更换培养液, 2~3d 后可见典型的ES 细胞集落, 3~4d 后可继续传代.
(3) pES 集落的碱性磷酸酶鉴定
取第1、2、15代的pES 细胞集落, 用4%多聚甲, mol/LRA +0.75%DMSO 的ES 基础培养液组成的肌肉细胞定向诱导分化液培养EB, 每天更换诱导培养液; 待诱导分化10d 出现有节律性跳动的细胞团块时, 进行常规免疫组织化学染色, 一抗为兔抗鼠肌肉特异性肌动蛋白A -actin (1B 100) , 二抗为异硫氰酸荧光素(FITC) 标记的羊抗兔IgG (1B 100) . 阴性对照组以0. 01mol/LPBS 代替一抗.
(3) pES 细胞体外分化为神经细胞 将EB 接种到铺有明胶的培养皿内培养, 用添加5@10
-7
mol/LRA 的ES 基础培养液组成的神经细胞定向诱导分化液培养EB, 每天更换诱导培养液; 培养6~8d 后, EB 松散出许多单个的细胞, 10~12d, 这些散开的单细胞就贴壁生长. 进行常规免疫细胞化学染色, 一抗为兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶(NSE) (1B 100) , 二抗为异硫氰酸荧光素(FITC) 标记的羊抗兔IgG (1B 100) . 阴性对照组以0. 01mol/LPBS 代替一抗.
1. 2. 6 pES 细胞的体内分化实验 将传至18代的小鼠pES 细胞消化后, 接种至小鼠睾丸的被膜下, 4.
第1期曾晓辉等:小鼠孤雌生殖胚胎干细胞的分离及分化潜能研究
105
膜下形成肿瘤, 将肿瘤进行常规石蜡切片, HE 染色, 显微镜观察.
2 结果
2. 1 小鼠pES 细胞的AKP 染色及核型分析
小鼠胚胎孤雌激活发育到扩张囊胚时期, 去掉透明带后(图1A) , 在抗血清中孵育20min 后, 移入补体孵育约20min, 滋养外胚层细胞肿胀(图1B) , 轻轻吹打, 分离得到内细胞团(图1C) . 经培养3~4d 后可见生长出原代pES 细胞(图1D) . 原代pES 经碱性磷酸酶检测呈阳性(图1E) , 经胰酶消化和多次传代培养可形成形态正常的pES 细胞克隆(图1F)
.
A:第2代pES AKP 呈强阳性; B:第15代pES AKP 呈强阳性; C, D:pES 的染色体与核型分析; 标尺=200L m
图2 pES 细胞的AKP 染色及核型鉴定
Figure 2 The activity of alkaline phosphate enzyme of pES and
karyotype assessment
2. 2 小鼠pES 细胞的体外分化
分别用肌肉细胞定向诱导分化液、神经细胞定向诱导分化液诱导培养EB, 大约诱导10d 后, 出现有节律性的收缩心肌细胞(图3A) 和神经细胞(图3C) . 用肌肉组织和神经组织特异性抗体进行免疫细胞化学分析, 结果显示心肌细胞表达肌肉特异性肌动蛋白A -actin(图3B) , 而神经细胞表达神经元特异性烯醇化酶NSE (图3D) ; 表明小鼠pES 细胞在体外具有分化为中胚层和外胚层的潜能, 与正常受精胚胎建系的ES 细胞系有相同的体外分化能力
.
A:孤雌生殖囊胚; B:抗体、补体作用后滋养外胚层细胞肿胀; C:分离得到的内细胞团; D:原代pES; E:原代pES 的碱性磷酸活性检测; F:第25代时pES 细胞; 标尺=100L m
图1 内细胞团的分离及pES 的培养
Figure 1 Isolation of inner cell mass and culture of mouse pES
选取第2代和第15代的pES, 用AKP 生化检测试剂盒染色ES 细胞集落, 都能表达很强的碱性磷酸酶(图2A 和2B) , 表明原代pES 细胞在传代的过程中仍保持干细胞特性. 对传代10~15代的小鼠pES 细胞进行核型分析, 结果显示pES 细胞染色体为40条(图2C, 2D)
.
A:相差显微镜下的心肌细胞; B:心肌细胞呈A -actin 阳性; C:相差显微镜下的神经细胞; D:神经细胞呈NSE 阳性; 标尺=100L m
图3 小鼠孤雌生殖胚胎干细胞体外分化的免疫荧光检测Figure 3 Immunocytochemistry of the differentiated mouse pES
in vitro
106
华南师范大学学报(自然科学版) 第44卷
2. 3 小鼠pES 细胞的体内分化
将传至18代的小鼠pES 细胞移植到小鼠睾丸被膜下, 5周后, 移植的8只中, 有2只小鼠睾丸异常增大, 睾丸被膜下形成肿瘤, 显微观察可见肿瘤组织中含有3个胚层来源的组织细胞(图4) :有源于外胚层的鳞状上皮和中枢神经组织等; 源于中胚层的软骨细胞和肌肉组织等; 源于内胚层的柱状上皮和肠管样组织等. 表明小鼠pES 细胞在体内具有分化为3个胚层组织的潜能, 与正常受精胚胎建系的ES 细胞系有相似的分化能力
.
育的机制, 鉴定、获得其关键基因; 建立ES 细胞向心肌细胞定向诱导分化的合适培养系统, 是目前该研究领域亟待解决的问题.
尽管对ES 细胞定向分化为心肌细胞的分子机制还不清楚, 但DMSO 是常用的诱导分化剂, 能诱导ES 细胞分化为心肌细胞、骨骼肌细胞, 其作用机制主要是抑制c -myc 基因表达, 降低细胞内源性聚腺苷二磷酸核苷水平. 此外, 有人发现维生素C 可显著提高ES 细胞向心肌细胞分化的效率, 使ES 细胞可发生自动节律性收缩, 肌小节肌球蛋白和A
[9]
-辅肌动蛋白染色呈阳性. 目前认为心肌发生相关因子, 如转化生长因子B (TGF -B ) 、骨形态发生蛋白(BMP) 、Wnt 家族蛋白和成纤维细胞生长因子(FGF) 等, 可促进ES 细胞分化为心肌细胞, 增加心
[10]
肌细胞的分化效率. 近年来, 血清对于ES 细胞分化的影响越来越受到重视, 无血清培养基可能更有利于ES 细胞向心肌细胞分化. PASSIER 等采用无血清培养基诱导ES 细胞, 发现其向心肌细胞分化的效率明显提高, 心肌自发搏动的数量较含血清培养增加了24倍, 如果在培养体系中加入维生素C, 分化效率还可以提高40%, 同时心肌特异性的蛋白标志物表达也增加. 在无血清培养基DMEM 中添加KSR 和BMP4, 可以促进小鼠ES 细胞向跳动样心肌细胞分化的比率
[12]
[11]
.
本研究将分离培养的pES 细胞经体外悬浮培
-8
养先形成EB, 在含有1@10mol/LRA 和0. 75%DMSO 的定向诱导培养液来诱导培养EB; EB 经诱
A:鳞状上皮; B:中枢神经组织; C:软骨细胞; D:肌肉组织; E:柱状上皮; F:肠管样组织; 标尺=200L m
导分化大约10d 后, 分化为可自发节律性收缩的细胞团; 免疫组化检测发现节律性收缩的细胞团表达肌肉细胞特异性表达的肌动蛋白A -actin, 表明pES 被成功定向诱导为心肌细胞. 结果表明RA 和DMSO 联合作用可有效地诱导ES 细胞定向分化为心肌细胞.
3. 1. 2 pES 细胞向神经细胞的分化 视黄酸(RA) 在中枢神经、皮肤及骨骼系统的发育过程中具有重要作用. 许多实验证明, RA 是诱导ES 细胞定向分化为神经细胞常用的诱导剂. RA 属脂溶性甾体类激素家族, 扩散进入细胞后与其胞内受体CRABP (cellular retinoic acid binding protein) 结合, 形成复合物转入细胞核调控一系列基因的表达, 最终使细胞表型发生转变引起细胞分化. WILES 等
[13]
图4 小鼠孤雌生殖胚胎干细胞体内分化结果Figure 4 Differentitation of mouse pES in vivo
3 讨论
3. 1 pES 细胞的体外定向诱导分化
ES 细胞体外分化分为一般分化和定向分化2类. 一般分化是指不加入任何诱导剂, 让其自然分化为不同类型的细胞, 但由于分化的细胞较杂, 应用意义不大. 定向分化指针对不同的靶细胞, 选择不同的分化方法和分化诱导剂, 使其发生特异性分化
[7-8]
,
是目前ES 分化研究的主要目标, 也是ES 细胞进行细胞替代治疗的基础.
3. 1. 1 pES 细胞向心肌细胞的分化 研究ES 细胞发现,
RA 可通过激活抑胰蛋白(follistatin) 来抑制骨形成蛋白, 从而使小鼠ES 细胞向神经细胞方向分化.
第1期曾晓辉等:小鼠孤雌生殖胚胎干细胞的分离及分化潜能研究
107
细胞分化, 还可以抑制LIF 信号促进ES 细胞分化. STRUBING 等
[14]
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Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into in gives Nature,
2006,
439
发现, 在无LIF 的培养条件下, ES
细胞自发分化为神经细胞的比例仅为15%~30%, 而用RA 诱导后EB 中几乎全部细胞分化成神经细胞. SCHULDINER 等
[15]
也证实, 用高浓度RA(10
-6
mol /L)诱导人ES 细胞产生的神经细胞比未用RA 处理的增加22%.
本研究用不含mLIF 的胚胎干细胞培养液, 添加5@10
-7
mol /LRA, 来诱导pES 细胞得到了神经
样细胞, 免疫组化结果显示诱导出的神经细胞表达神经细胞特异性烯醇化酶NSE. 结果也证明RA 可诱导ES 细胞定向分化为神经细胞.
3. 2 pES 细胞的体内分化
检测ES 细胞体内分化潜力的一种重要方法是将ES 细胞注射入同源动物皮下、睾丸被膜等部位, 可诱导形成畸胎瘤, 畸胎瘤中含有来源于3个胚层的细胞. KIM 等
[16]
人将小鼠pES 细胞接种到裸鼠皮
下可形成了畸胎瘤, 畸胎瘤中含有3个胚层来源的细胞; 并将小鼠pES 细胞注射到小鼠315d 囊胚中, pES 细胞可以参与胚胎发育并产生有毛色嵌合的小鼠. 标明小鼠pES 具有多种分化潜能.
本研究将分离的pES 注射入同种动物睾丸被膜下, 发现pES 可诱导肿瘤的形成, 组织切片表明, 所获得的肿瘤组织中存在多种类型的组织细胞, 如:有源于外胚层的鳞状上皮和中枢神经组织; 源于中胚层的软骨细胞和肌肉组织; 源于内胚层的柱状上皮和肠管样组织等. 结果证明所分离获得的小鼠pES 细胞具有分化发育成源于3个胚层的组织细胞类型的能力, 具有与正常受精胚胎中分离的ES 细胞完全相同的分化潜能.
4 结论
利用免疫外科法从孤雌生殖的小鼠胚胎可分离出孤雌生殖胚胎干细胞(pES) , 这些pES 在体内、体外都具有分化为多种类型细胞的潜能. 该方法可为从人孤雌生殖胚胎中分离干细胞提供一种技术参考. 参考文献:
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Isolation and Differentiation Potential of Mouse Parthenogenetic Embryonic Stem Cells
ZENG Xiaohui, ZHANG Yuying, DENG Lugang, LI Xuefeng *
(School of Life Science, South China Normal Univers ity, Guangz hou 510631, China)
Abstract:Mouse pES isolated from mouse parthenogenetic blastocysts have the ability to proliferate at least 25gen 2erations in vitro and show very strong activity of alkaline phosphate enzyme. The karyotype of pES was showed as 40XX. To investigate the diffenentiation potential of mouse pES in vivo, pES at the 18generation were trypsinized and transferred into the testicle envelope of Kunming mouse, histomorphological analysis showed that pES main 2tained the developmental potential to differentiate into advanced derivatives of all three primary germ layers -ecto 2derm, endoderm and mesoderm -in vivo. Immuno histochemical results showed that mouse testis had Neuron spe 2cific enolase (NSE) and muscle specific A -actin positive cells which derived from pES. Mouse pES at 20to 24passages were directionally induced to differentiate in vitro. The results showed that they can be induced into nerve cells and myocardial cells with the rhythm of contraction. Immunocytochemistry showed that myocardial cells were A -actin positive and nerve cells were NSE positive.
Key words:mouse; parthenogenetic; ES; differentiation potential
【责任编辑 成 文】
(上接第102页)
Construction of Suppression Subtractive Hybridization Library from the Floral Buds of Paphiopedilum Micranthum
WANG Yanjun 1, WEN Zhenzhen 2, ZHANG E 2, TAN Zhiyong 1, WANG Yaping 1, LIU Yunquan 2, LIU Wei 2
(1. Institute of Agricultural Seeds, Dongguan 523063, China;
2. School of Life Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)
Abstract:With high ornamental and research value, Paphiopedilum micranthum is a species of the genus Paphio 2
pedilum native to China, which is endangered and protected intensively by the country. However, there are few re 2ports on its floral development mechanism because of the supply shortage and backward cultivation technology. In this study, a suppression subtractive hybridization (SSH) library was constructed using the cDNAs from the floral and vegetative buds of P. micranthum as the tester and the driver, respectively. The insert fragments were tested by PCR, and 288clones with 500bp or longer from the library were selected for sequencing. Totally, 18ESTs were obtained, after vector sequences removed and clustered. The ESTs were functionally annotated by Blast. Those which matched significantly with Nr database were further classified into functional groups including photosynthesis, biosynthetic metabolism, gene regulation, etc. Among them, a few sequences with homology to transposons or retro -transposons were obtained. The genes differentially expressed in floral buds of P. micranthum isolated in this study could make a base for investigating the molecular mechanism of floral development.
Key words:Paphiopedilum micranthum ; suppression subtractive hybridization (SSH) ; floral development
【责任编辑 成 文】