实验五 培养基的制作以及灭菌
生物科学 贺冰冰 [1**********]5 周二 9、0 节
一、 实验目的：
1 学习培养基的配制原理和一般方法步骤
2 掌握高压蒸汽灭菌的原理方法
3 了解干热灭菌的原理方法
二、实验原理：
1 培养基的原理
培养基（medium ）是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。由于微生物种类繁多，对营养物质的要求各异，加之实验和研究的目的不同，所以培养基在组成成分上也各有差异。但是，不同种类或不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素等。配制培养基时不仅需要考虑满足这些营养成分的需求，而且应该注意各营养成分之问的协调。
按照配制培养基的营养物质来源，可将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基三类 .
按培养基外观的物理状态可将培养基分成三类，即液体培养基、固体培养基和半固体培养基 .
按照培养基的功能和用途，可将其分为基础培养基、加富培养基、选择培养基、鉴别培养基等 .
牛肉膏蛋白胨培养基是细菌学研究最常用的天然培养基。在配方中不加琼脂时称之为肉汤培养基。加入琼脂配制的固体培养基一般用于细菌的分离、培养和计数等.
2 灭菌的原理
（1) 干热灭菌
用干燥热空气杀死微生物的方法称为干热灭菌。通常将灭菌物品置于鼓风干燥箱内，在160℃～170℃加热1～2h 。灭菌时间可根据灭菌物品性质与体积作适当调整，以达到灭菌日的。玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等凡不适于用其他方法灭菌而又能耐高温的物品都可用此法灭菌；但是，培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用干热灭菌。
注意事项：
（1）灭菌的玻璃器皿切不可有水。有水的玻璃器皿在干热灭菌中容易炸裂。
（2）灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升。
（3）灭菌物品不能直接放在电烘箱底板上。以防止包装纸或棉花被烤焦。
（4）灭菌温度恒定在160～170℃为宜。温度超过180℃棉花、报纸会烧焦甚至燃烧。
（5）降温时，需待温度自然降至60℃以下才能打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
2 湿热灭菌
湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌。在相同温度下，湿热的效力比干热灭菌好的原因是：1）热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，更易使蛋白质变性。蛋白质含水量与其凝固温度成反比；2）热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物；3）蒸汽存在潜热，当气体转变为液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。
分为常压蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌.
3、高压蒸汽灭菌
高压蒸汽灭菌是在密闭的高压蒸汽灭菌器（锅）中进行的。其原理是：将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内。把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100℃以上。为达到良好的灭菌效果，一般要求温度应达到121℃（压力为0.1MPa ），时间维持15～30min 。也可采用在较低的温度(115℃，即0.075Mpa) 下维持30min 的方法。
三、 实验器材：
1 药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、 1NHCl 、1NNaOH 溶液。 2 器材：小烧杯、1000mL 不锈钢杯、电炉、天平、牛角匙、玻棒、pH 试纸、试管、分装漏斗、棉塞、三角瓶、橡皮圈。
3 高压灭菌锅
四、实验方法：
1 在1000mL 不锈钢烧杯中加入500mL 水, 用玻棒标记液面(定容用), 将水倒掉.
2 在100mL 小烧杯中称取牛肉膏2.5g 、蛋白胨 5.0g ，加 25mL 自来水，置电炉搅拌加热至牛肉膏、蛋白胨完全溶解。
3 向不锈钢杯中加人250mL 自来水，将溶解的牛肉膏、蛋白胨倒入不锈钢杯中并用自来水洗2～3次。加入2.5gNaCl ，在电炉上边加热边搅拌。
4 药品完全溶解后, 加入自来水定容至500mL, 用玻棒沾少许液体，测定pH 值。用NaOH 或HCI 调至pH7.4.
5 用量筒将培养基分成400mL 和100mL 两部分.
6 将8g 琼脂粉加入到400mL 培养基中，搅拌，加热至琼脂完全熔化． ７将培养基趁热用注射器分装于18mmX 180mm试管中，每组分装１０只。盖上试管帽，牛皮纸包扎，待灭菌．
８ 将剩余培养基装入 ５00mL 的三角烧瓶中，盖上合适的棉塞，报纸包扎．待灭菌．
９ 剩余的100mL 培养基单数组同学配制液体培养基，将培养基在烧杯中煮沸１０分钟，过滤, 补足水，分装1６mmX 1６0mm 试管１０只，盖上试管帽，牛皮纸包扎，待灭菌．
10 双数组同学将0.5g 琼脂加入到100mL 培养基中, 搅拌，加热至琼脂完全熔化．分装1６mmX 1６0mm 试管１０只，盖上试管帽，牛皮纸包扎，待灭菌．
11 配制150mL 生理盐水(0.85% NaCl水溶液), 用量筒量取100mL 装
于250mL 的三角烧瓶中, 再用移液管取出1mL, 加棉塞, 用报纸包扎, 制成99mL 稀释水; 用移液管移取9mL 生理盐水, 分装于18mmX 180mm 试管中, 分装四只.
12 将培养基和稀释水及枪头等标记好进行高压蒸汽灭菌，在121℃灭菌20min.
13 灭菌后摆放斜面, 其余培养基及仪器放于实验台存放。
注: 试管分装量, 液体---试管高的1/4到1/3; 固体---试管高的1/5; 半固体---试管高的1/3; 三角瓶---瓶高1/2左右.
五、思考题：
1 培养基配好后, 为什么必须立即灭菌? 如何检查灭菌后的培养基是无菌的?
答：配好的培养基如果不立即灭菌，微生物会利用培养基中的营养物质滋生，最后导致微生物大量繁殖，培养基营养物质流失，培养基变浑浊。将灭菌后的培养基放入37摄氏度温箱中培养24~48小时，无菌生长即可。
2 培养微生物的培养基应具备哪些条件? 为什么?
答：（1）不同种类或不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素等。配制培养基时不仅需要考虑满足这些营养成分的需求，而且应该注意各营养成分之问的协调。
（2）因为细菌细胞中各种元素含有一定的比例关系
3 、pH 为什么调过头再回调不好?
答：调过头再回调的时候，HCl 与NaOH 反应生成NaCl, 会使NaCl 浓度变大，使培养基的渗透压发生变化，不利于微生物的培养。 5 为什么分装过程中不要使培养基沾在管口或瓶口上?
答：防止管口或瓶口上微生物繁殖。
6 为什么液体培养基要过滤? 为什么过滤前要先加热煮沸? 答：过滤其中未容杂质。
7 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需温度高时间长?
答：湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌。在相同温度下，湿热的效力比干热灭菌好的原因是：1）热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，更易使蛋白质变性。蛋白质含水量与其凝固温度成反比；2）热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物；3）蒸汽存在潜热，当气体转变为液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。
8 高压蒸汽灭菌开始之前, 为什么要将锅内冷空气排尽?
答：若灭菌开始前未将锅内冷空气排尽，开始灭菌后，蒸汽锅内空气就达不到121℃, （若设定为121℃），灭菌效果不好。
9 灭菌完毕后, 为什么要在压力降到零时, 才能打开排气筏取物?
答：如果压力未降到零时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。
10 在使用高压蒸汽锅灭菌时, 怎样杜绝一切不安全因素?
答：（1）加水 使用前在锅内加入适量的水，加水不可过少，以防将灭菌锅烧干，引起炸裂事放。加水过多有可能引起灭菌物积水。
（2）装锅 将灭菌物品放在灭菌桶中，不要装得过满。盖好锅盖，按对称方法旋紧四周固定螺旋，打开排气筏。
（3）加热排汽 加热后待锅内沸腾并有大量蒸汽自排气阀冒出时，维待2一3min 以排除冷空气。如灭菌物品较大或不易透气。应适当延长排气时间，务必使空气充分排除，然后将排气间关闭。
（4） 保温保压 当压力升至 0.1MPa 时，温度达 121℃，此时应控制热源。保持压力，维持20min 后，切断热源。
（5）出锅 当压力表降至“0”处，稍停，使温度继续降至100℃以下后，打开排气阀，旋开固定螺旋，开盖取出灭菌物。注意。切勿在锅内压力尚在“0” 点以上，温度也在100℃以上时开启排气阀，否则会因压力骤然降低，而造成培养基剧烈沸腾冲出管口或瓶口，污染棉塞，以后培养时引起杂菌污染。
（6） 保养 灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，以保持内壁及内胆干燥，盖好锅盖。
实验五 培养基的制作以及灭菌
生物科学 贺冰冰 [1**********]5 周二 9、0 节
一、 实验目的：
1 学习培养基的配制原理和一般方法步骤
2 掌握高压蒸汽灭菌的原理方法
3 了解干热灭菌的原理方法
二、实验原理：
1 培养基的原理
培养基（medium ）是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。由于微生物种类繁多，对营养物质的要求各异，加之实验和研究的目的不同，所以培养基在组成成分上也各有差异。但是，不同种类或不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素等。配制培养基时不仅需要考虑满足这些营养成分的需求，而且应该注意各营养成分之问的协调。
按照配制培养基的营养物质来源，可将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基三类 .
按培养基外观的物理状态可将培养基分成三类，即液体培养基、固体培养基和半固体培养基 .
按照培养基的功能和用途，可将其分为基础培养基、加富培养基、选择培养基、鉴别培养基等 .
牛肉膏蛋白胨培养基是细菌学研究最常用的天然培养基。在配方中不加琼脂时称之为肉汤培养基。加入琼脂配制的固体培养基一般用于细菌的分离、培养和计数等.
2 灭菌的原理
（1) 干热灭菌
用干燥热空气杀死微生物的方法称为干热灭菌。通常将灭菌物品置于鼓风干燥箱内，在160℃～170℃加热1～2h 。灭菌时间可根据灭菌物品性质与体积作适当调整，以达到灭菌日的。玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等凡不适于用其他方法灭菌而又能耐高温的物品都可用此法灭菌；但是，培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用干热灭菌。
注意事项：
（1）灭菌的玻璃器皿切不可有水。有水的玻璃器皿在干热灭菌中容易炸裂。
（2）灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升。
（3）灭菌物品不能直接放在电烘箱底板上。以防止包装纸或棉花被烤焦。
（4）灭菌温度恒定在160～170℃为宜。温度超过180℃棉花、报纸会烧焦甚至燃烧。
（5）降温时，需待温度自然降至60℃以下才能打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
2 湿热灭菌
湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌。在相同温度下，湿热的效力比干热灭菌好的原因是：1）热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，更易使蛋白质变性。蛋白质含水量与其凝固温度成反比；2）热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物；3）蒸汽存在潜热，当气体转变为液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。
分为常压蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌.
3、高压蒸汽灭菌
高压蒸汽灭菌是在密闭的高压蒸汽灭菌器（锅）中进行的。其原理是：将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内。把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100℃以上。为达到良好的灭菌效果，一般要求温度应达到121℃（压力为0.1MPa ），时间维持15～30min 。也可采用在较低的温度(115℃，即0.075Mpa) 下维持30min 的方法。
三、 实验器材：
1 药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、 1NHCl 、1NNaOH 溶液。 2 器材：小烧杯、1000mL 不锈钢杯、电炉、天平、牛角匙、玻棒、pH 试纸、试管、分装漏斗、棉塞、三角瓶、橡皮圈。
3 高压灭菌锅
四、实验方法：
1 在1000mL 不锈钢烧杯中加入500mL 水, 用玻棒标记液面(定容用), 将水倒掉.
2 在100mL 小烧杯中称取牛肉膏2.5g 、蛋白胨 5.0g ，加 25mL 自来水，置电炉搅拌加热至牛肉膏、蛋白胨完全溶解。
3 向不锈钢杯中加人250mL 自来水，将溶解的牛肉膏、蛋白胨倒入不锈钢杯中并用自来水洗2～3次。加入2.5gNaCl ，在电炉上边加热边搅拌。
4 药品完全溶解后, 加入自来水定容至500mL, 用玻棒沾少许液体，测定pH 值。用NaOH 或HCI 调至pH7.4.
5 用量筒将培养基分成400mL 和100mL 两部分.
6 将8g 琼脂粉加入到400mL 培养基中，搅拌，加热至琼脂完全熔化． ７将培养基趁热用注射器分装于18mmX 180mm试管中，每组分装１０只。盖上试管帽，牛皮纸包扎，待灭菌．
８ 将剩余培养基装入 ５00mL 的三角烧瓶中，盖上合适的棉塞，报纸包扎．待灭菌．
９ 剩余的100mL 培养基单数组同学配制液体培养基，将培养基在烧杯中煮沸１０分钟，过滤, 补足水，分装1６mmX 1６0mm 试管１０只，盖上试管帽，牛皮纸包扎，待灭菌．
10 双数组同学将0.5g 琼脂加入到100mL 培养基中, 搅拌，加热至琼脂完全熔化．分装1６mmX 1６0mm 试管１０只，盖上试管帽，牛皮纸包扎，待灭菌．
11 配制150mL 生理盐水(0.85% NaCl水溶液), 用量筒量取100mL 装
于250mL 的三角烧瓶中, 再用移液管取出1mL, 加棉塞, 用报纸包扎, 制成99mL 稀释水; 用移液管移取9mL 生理盐水, 分装于18mmX 180mm 试管中, 分装四只.
12 将培养基和稀释水及枪头等标记好进行高压蒸汽灭菌，在121℃灭菌20min.
13 灭菌后摆放斜面, 其余培养基及仪器放于实验台存放。
注: 试管分装量, 液体---试管高的1/4到1/3; 固体---试管高的1/5; 半固体---试管高的1/3; 三角瓶---瓶高1/2左右.
五、思考题：
1 培养基配好后, 为什么必须立即灭菌? 如何检查灭菌后的培养基是无菌的?
答：配好的培养基如果不立即灭菌，微生物会利用培养基中的营养物质滋生，最后导致微生物大量繁殖，培养基营养物质流失，培养基变浑浊。将灭菌后的培养基放入37摄氏度温箱中培养24~48小时，无菌生长即可。
2 培养微生物的培养基应具备哪些条件? 为什么?
答：（1）不同种类或不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素等。配制培养基时不仅需要考虑满足这些营养成分的需求，而且应该注意各营养成分之问的协调。
（2）因为细菌细胞中各种元素含有一定的比例关系
3 、pH 为什么调过头再回调不好?
答：调过头再回调的时候，HCl 与NaOH 反应生成NaCl, 会使NaCl 浓度变大，使培养基的渗透压发生变化，不利于微生物的培养。 5 为什么分装过程中不要使培养基沾在管口或瓶口上?
答：防止管口或瓶口上微生物繁殖。
6 为什么液体培养基要过滤? 为什么过滤前要先加热煮沸? 答：过滤其中未容杂质。
7 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需温度高时间长?
答：湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌。在相同温度下，湿热的效力比干热灭菌好的原因是：1）热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，更易使蛋白质变性。蛋白质含水量与其凝固温度成反比；2）热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物；3）蒸汽存在潜热，当气体转变为液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。
8 高压蒸汽灭菌开始之前, 为什么要将锅内冷空气排尽?
答：若灭菌开始前未将锅内冷空气排尽，开始灭菌后，蒸汽锅内空气就达不到121℃, （若设定为121℃），灭菌效果不好。
9 灭菌完毕后, 为什么要在压力降到零时, 才能打开排气筏取物?
答：如果压力未降到零时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。
10 在使用高压蒸汽锅灭菌时, 怎样杜绝一切不安全因素?
答：（1）加水 使用前在锅内加入适量的水，加水不可过少，以防将灭菌锅烧干，引起炸裂事放。加水过多有可能引起灭菌物积水。
（2）装锅 将灭菌物品放在灭菌桶中，不要装得过满。盖好锅盖，按对称方法旋紧四周固定螺旋，打开排气筏。
（3）加热排汽 加热后待锅内沸腾并有大量蒸汽自排气阀冒出时，维待2一3min 以排除冷空气。如灭菌物品较大或不易透气。应适当延长排气时间，务必使空气充分排除，然后将排气间关闭。
（4） 保温保压 当压力升至 0.1MPa 时，温度达 121℃，此时应控制热源。保持压力，维持20min 后，切断热源。
（5）出锅 当压力表降至“0”处，稍停，使温度继续降至100℃以下后，打开排气阀，旋开固定螺旋，开盖取出灭菌物。注意。切勿在锅内压力尚在“0” 点以上，温度也在100℃以上时开启排气阀，否则会因压力骤然降低，而造成培养基剧烈沸腾冲出管口或瓶口，污染棉塞，以后培养时引起杂菌污染。
（6） 保养 灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，以保持内壁及内胆干燥，盖好锅盖。