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・881・
.论著
Notch信号通路在慢性阻塞性肺疾病免疫失衡中的作用及机制研究
杨鑫娜
刘晓菊赵兰婷曾晓丽包海荣
【摘要】目的探讨Notch信号通路在慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)免疫失衡中的作用。方法
BALB/c小鼠30只按随机数字表法分为健康对照组、慢阻肺组及慢阻肺1分泌酶抑制剂(GSI)组。烟草烟雾暴露法建立小鼠慢阻肺模型;尼龙毛柱提纯T淋巴细胞,流式细胞术检测T细胞亚群;实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测Notchl及其下游HeslmRNA和蛋白。结果Thl/CD;T、Thl7/
cDfT和Treg/CD;T慢阻肺组为(13.20±0.95,10.22±0.45,0.41±0.09)较健康对照组(8.07±0.44,5.98±0.26,0.26±0.05)明显增加(均P<0.01);GSI降低Thl/CD;T和Thl7/CD4+T;慢阻肺
组Thl/Th2比值(18.704-4.12)较健康对照组(12.63±1.91)明显升高(P<o.01),慢阻肺组Thl7/
CD;T、Thl7/CD;T较健康对照组分别升高71%、58%,GSI降低慢阻肺Thl/Th2和Thl7/Treg的比值
(均P<0.01)。慢阻肺组Notchl受体及下游HeslmRNA(5.15±0.77,1.92±0.32)和蛋白(0.85±0.04,0.16±0.02)的表达较健康对照组(1.00±0.00,1.00±0.00)和(0.17±0.01,0.09±0.01)明显升高(均P<0.01),GSI明显抑制慢阻肺组Notchl及HeslmRNA和蛋白的表达(均P<0.01)。相关性分析:慢阻肺组Notchl和HeslmRNA和蛋白的表达与Thl和Thl7细胞呈正相关,与TIl2和Treg细胞呈负相关(均P<0.05)。结论慢阻肺小鼠存在T淋巴细胞亚群失衡,以Thl、Thl7等促炎细胞增多为主;Notchl及其下游HeslmRNA及蛋白水平升高,且与T淋巴细胞亚群失衡相关;GSI能部分抑制Notchl、Hesl的表达及Thl、Thl7细胞;Notch信号通路参与慢阻肺的免疫紊乱。
【关键词】肺疾病,慢性阻塞性;受体,Notehl;T淋巴细胞亚群;免疫失衡
基金项目:甘肃省科技支撑项目(144FKCA062);兰州市科技计划项目(2014.1.36)
EffectsandmechanismsofNotchsignalingpathway
on
iinnllmeimbalanteinchronicobstructive
pulmonarydisease
YangXinna,厶ll
Xiaoju,ZhaoLanting,zengXiaoli,BaoHairong.DepartmentofGerontalRespiratoryMedicine,theFirst
HospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China
Correspondingauthor:LiuXiaoju,Entail:liuxiaoju835@126.corn
【Abstract】
Objective
To
explore
theroleofNotchsignalingpathwayonimmuneimbalancein
chronicobstructivepulmonarydisease(COPD).MethodsThirtyBALB/cmicewererandomlyassigned
intothehealthycontrolgroup,COPDgroup,andCOPDGammasecretaseinhibitors(GSI)group.CigarettesmokeexposurewasusedtoestablishtheCOPDmodel.Tcellswereenrichedbyfilteringthroughnylonw001columns.Theproportionofspleen-derivedT.1ymphocytesubsetswasdetectedbyflowcytometrv.Real.timequantitativepolymerasechain
reaction(RT.PCR)and
Westernblot(WB)wereused
todetectthe
expressionofsplenicTcells’NotchlanditsdownstreamHesl
mRNAandproteinrespectively.Results
Thepercentage
of卟l,Thl7
andTregcellsin
CD;T
cellsofCOPD
mice(13.20±0.95,10.22±0.45.
0.41±0.09)%weresignificantlyincreasedcomparedwiththehealthycontrolgroup(8.074-0.44.5.98±0.26,0.26±0.05)%(allP<0.01).TheproportionofThlandThl7cellsinCOPDGSIgroupmice(9.48±0.66,7.70±0.39)%weresignificantlyreducedcomparedwithCOPDgroup(allP<0.01).RatioofThl/Th2inCOPDgroup(18.70±4.12)wassignificantlyincreasedcomparedwiththehealthvcontrolgroup(12.63±1.91)(P<0.01),thepercentageofThl7andTreginCD;Tcellincreased71%
and58%respectively.GSIdecreasedtheratiosofThl/Th2andThl7/Treg(allP<0.01).NotehlreceptoranditsdownstreamHeslmRNAexpression(5.15±0.77,1.92±0.32)andproteinexpression
(0.85±0.04,0.16±0.02)of
COPDmicewere
significantlyincreasedcomparedwitht11ehealthygroup
respectively[(1.00±0.00,1.00±0.00)and(O.17±0.01,0.09±0.01)](allP<0.01).GSI
DOI:10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2016.11.012
作者单位:730000兰州大学第一医院老年呼吸科通信作者:刘晓菊,Email:liuxiaoju835@126.com
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significantlyinhibitedtheexpressionofmRNAandproteininNotchlanditsdownstreamHesl(aUP<
0.01).NotchlandHeslmRNAandproteinexpressions
mice,therewasT.1ymphocytesubsetsimbalalice。suchNotchland
its
downstream
Hesl
mRNA
and
as
were
correlatedpositivelywithThlandThl7cells
InCOPD
andnegativelycorrelatedwithT}12andTregcellsinCOPDgroupfauP<0.05).Conclusion
tIleincreasedofThl,Thl7proinflammatorycells,levels
were
protein
increased.andwasassociatedwith
and’rhl7
T—lymphocytesubsetsimbalance.GSIcouldpartiallyinhibitNotchl.HeslexpressionandThl
cells.andthusNotchsignalingpathwaywasinvolvedintheimmunedisorderofCOPDmice.
【Keywords】Pulmonary
Subsets;Immuneimbalance
disease,chronicobstructive;Receptor,Notchl;T—Lymphocyte
Fundprogram:ScienceandTechnologySuppoaProgramofGansuProvince(144FKCA062);Science
andTechnologyProgramofLanzhouCity(2014—1-36)
慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)是以慢性气道炎症和持续气流受限为特征的常见气道疾病,其发病与肺部炎症反应、氧化应激、蛋白酶一抗蛋白酶失衡、自主神经功能失调等有关。近年来,研究发现慢阻肺的发生发展与免疫紊乱密切相关¨J。Notch信号是条高度保守的信号转导途径,在调控T淋巴细胞分化中发挥重要作用旧引。文献报道Notch信号通路参与哮喘等疾病的免疫失衡H引,但在慢阻肺中的作用鲜见报道。本研究以慢阻肺小鼠为研究对象,通过给予Notch信号通路特异性抑制剂1一分泌酶抑制剂(GSI)阻断Notch信号通路,检测慢阻肺小鼠T细胞Notchl受体及其下游分子Hesl及T细胞亚群的比例,观察慢阻肺小鼠Thl、Th2、Thl7和Treg的变化与Notch信号通路的关系,探讨慢阻肺免疫功能紊乱的发生机制,为防治慢阻肺奠定基础。
材料及方法
1.主要材料:兰州牌香烟(甘肃省烟草公司),藻红蛋白(PE)一花青燃料5(CY5)标记的抗小鼠CD4单克隆抗体、PE标记的抗小鼠白介素(IL)_4单克隆抗体、PE标记的抗小鼠叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3)单克隆抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗小鼠IL.17A单克隆抗体、FITC标记的抗小鼠干扰素-^y(美国BioLegend公司),逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒(日本Takara公司)。羊抗鼠Notchl单克隆抗体(美国Santa
Cruz
公司),兔抗鼠Hesl单克隆抗体(英国Abcam公司),GSI(美国Sigma公司),LSRFortessaTM型流式细胞仪(美国BD公司),BIO-RAD
ChemiDocⅢXRS
凝胶成像系统(美国Bio.Rad公司),GYD-003型无创小鼠肺功能仪(法国Emka公司)。
2.慢阻肺小鼠模型建立与实验分组:8周龄雄性BALB/c小鼠30只,平均体重(20±2)g,购白兰州大学实验动物中心[批号SCXK(甘)2013-0002+]。
慢阻肺小鼠模型建立:采用单纯烟草烟雾暴露cm×30cm×35
cm有机玻璃箱
内,每13暴露烟草烟雾4次(4支×45min),间
隔1h,连续90
d∞。1。
分组:小鼠按随机数字表法分为3组:健康对照d后,隔日腹腔注射GSI(1mg/kg),共肺功能测定:造模结束后,采用小鼠无创肺功能min,检测吸气峰流速(PIF)、呼气峰流速(PEF)和呼出50%潮气量时的呼气流速(EFS0)¨。。
肺组织病理标本采集、染色及测定:造模结束的计数,每只小鼠取3个肺组织病理切片,中倍镜下随机取5个视野(避开大血管和支气管),在每个视野正中心划十字交叉线,计数与交叉线相交的肺泡隔数(NS),同时测出十字线总长(L),按公式计算:MLI=L/NS,以表示肺泡平均内径归J。
3.脾脏淋巴细胞分离及T淋巴细胞提纯:无菌取小鼠脾脏,200目滤网研磨过滤,调整细胞数1×108/ml,加于淋巴细胞分离液上,2500转/min,
min,离心半径:10cm,吸取中间层淋巴细胞,磷
酸盐缓冲液洗2次,RPMI.1640调整细胞数2×107/ml,尼龙毛柱过滤提纯T细胞¨1。,调整细胞数为2×106/ml,加入FITC标记CD,抗体,流式细胞仪测定总T(CD;T)细胞。
4.CD4T淋巴细胞(CD;T)亚群检测:参照
Zhang等【l纠方法,RPMI一1640调整脾淋巴细胞悬液细胞数2×106/ml,接种到24孔板,加入佛波酯/离子霉素混合物和布雷菲德菌素/莫能菌素混合物,
5%CO,、37
oC培养8h,调整细胞数1×106/ml,加
入PE/CY5标记CIM抗体,室温避光孵育20min;
法,将小鼠置于50
组、慢阻肺组及慢阻肺GSI组。慢阻肺GSI组小鼠烟草烟雾暴露61计15次,其余两组注射等体积无菌双蒸水¨引。
检测系统检测小鼠肺功能,将小鼠置于体描箱内,在清醒和自由活动状态下适应5后,处死小鼠,取肺组织,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋、切片,苏木素伊红(HE)染色,酒精脱水、烘干,中性树胶封片,进行肺组织切片肺泡平均间隔(MLI)20
虫垡缱拯塑哩噬盘查呈!!鱼生!!旦箜塑鲞箜!!翅gb也』旦!!望堕!!P堡旦堡:堕!!!堂竺!!!!:y!!:!!:盟!:!1
4%多聚甲醛4℃固定10min后破膜,分别加入PE标记IL-4和FITC标记干扰素-Y、PE标记Foxp3和FITC标记IL.17A,室温避光孵育20min,流式细胞仪检测CD4T的Thl、Th2、Thl7和Treg细胞比例。
5.实时荧光定量PCR法检测Notchl和Hesl
0.01,表1)。肺组织病理切片镜下可见慢阻肺组终末细支气管远端气腔膨胀,间隔变窄,弹力纤维变细或断裂,部分肺泡腔扩大、肺泡壁破裂,融合形成肺大疱,肺泡数目明显减少,肺泡间隔可见炎症细胞浸润,MLI较健康对照组、慢阻肺GSI组明显增加(均P<0.01),慢阻肺GSI组小鼠炎症细胞浸润及肺气肿程度较慢阻肺组小鼠轻,健康对照组肺泡组织结构基本完整无异常。
2.T细胞鉴定:通过流式细胞仪检测总T细胞阳性率百分比为(81.76-4-1.53)%。
3.CD4+T淋巴细胞Thl、Th2、Thl7、Treg及其比值:慢阻肺组较健康对照组Thl、Thl7、Treg
CD4+T
mRNA:提取总RNA,逆转录试剂盒合成cDNA。引物:Notchl上游:5
37,下游:5
7.TGCCAGTATGATGTGGATGAG.
7一GGTCCCTGTGTAACCTTCTGT一3’,扩增
7一AGCCCACCTCTCTCT
长度111bp;Hesl上游:5
TCTGAC.3
7,下游:5’一AGGCGCAATCCAATATGAAC一
3’,扩增长度187bp;13一actin上游:5’一CCTCTATGC
CAACACAGTGC.3’,
下游:
5’一ATACTCCTGCTF
及Thl/Th2比值均明显高于健康对照组,Thl7/Treg无明显差异;慢阻肺组Thl7/CD;T、Treg/CD4+T较健康对照组分别升高71%、58%;GSI能明显降低慢阻肺组Thl/CD4+T、Thl7/CD4+T及Thl/Th2和Thl7/Treg的比值,均P<0.01,GSI降低慢阻肺组
Thl7/CD;T
GCTGATCC.3’,扩增长度211bp;反应体系20汕l,扩
增条件:95℃预变性30
0.5
S,95
oC变性5
s,60
oC退火
延伸34S,共40个循环,溶解65~95℃,每5S上升
oC;基因表达采用2“们‘法。
6.Western
blot法检测Notchl和Hesl蛋白:提25%,升高Treg/CD4+T10%(表2)。
取总蛋白测定蛋白含量,取50¨g蛋白样品,10%十二烷基硫酸钠.聚丙烯酰胺凝胶电泳,转至聚偏氟乙烯膜,5%脱脂奶粉室温封闭2h,羊抗鼠Notchl多克隆抗体(1:200)、兔抗鼠Hesl多克隆抗体
(1:7500)及内参照物兔抗鼠甘油醛一3.磷酸脱氢酶(GAPDH)(1:200)4oC过夜,兔抗羊IgG(1:2000)、
4.T淋巴细胞Notchl及HeslmRNA和蛋白的表达:慢阻肺组Notchl及HeslmRNA和蛋白较健康对照组明显增加(均P<0.01),GSI明显抑制慢阻肺组Notchl及HeslmRNA和蛋白的表达,均P<O.01(表3)。
5.相关性分析:慢阻肺组Notchl和HeslmRNA、蛋白的表达与Thl/CD4+T、Thl7/CD4+T细胞比例呈正相关,与Th2/CD,+T、Treg/CD4+T细胞比例呈负相关(表4)。
讨
论
羊抗兔IgG(1:2000)室温2h,显影,检测蛋白条带。蛋白相对表达为目的基因灰度值/内参基因灰度值。
7.统计学处理:采用SPSS21.0软件进行统计学分析,计量资料数据以元±s表示,组间比较采用单因素方差分析和LSD—t检验,Pearson法进行相关性分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
结
果
慢阻肺的发生发展与免疫紊乱密切相关,研究发现慢阻肺患者存在Thl/Th2失衡,且以Thl型细胞增多为主¨J。慢阻肺小鼠肺内Thl细胞的增多产生干扰素一^y,促进炎性细胞肺内积聚,破坏肺脏结构的完整性¨3I。新近研究发现Thl7和Treg细胞也参与慢阻肺的发病,Thl7细胞主要分泌IL一17A、
1.慢阻肺模型:慢阻肺组肺功能PIF、PEF和EF50明显低于健康对照组和慢阻肺GSI组(均P<
表1健康对照组、慢阻肺组小鼠肺功能的比较(面±s)
注:PIF:吸气峰流速;PEF:呼气峰流速;EF50:呼出50%潮气量时的呼气流速;MLI:平均肺泡间隔;8P<0.01为与健康对照组比较;“P<0.01为与慢阻肺组比较
主堡结蕉塑哩哩苤查呈!!!生!!旦筮!!鲞筮!!翅曼!也』旦!!翌曼塑巳堡旦亟堕!!!里!竺!Q!!:y!!:塑:盟!:!!表2各组小鼠脾源性Thl、Th2、Treg和Thl7细胞比例的比较(面±s)
注:与健康对照组比较,8t值为3.03~25.79,均P<0.Ol;与慢阻肺组比较,“t值为3.31~13.29,均P<O.01
表3各组Notchl及HeslmRNA和蛋白的表达结果比较(面±S,A)
注:mRNA:2—6△Q值;蛋白:目的基因灰度值/内参基因灰度值;与健康对照组相比,8t值为10.34~49.19,均P<0.01;与慢阻肺组相比,“t值为5.72~18.75,均P<0.01
表4慢阻肺组各数据相关性分析
Treg细胞高,表明慢阻肺小鼠除存在Thl/Th2失衡外,仍以Thl7细胞增加为主,而具有免疫抑制的Treg细胞增加不足,致免疫失控,肺组织炎性损伤持续。
Notch信号通路通过细胞间的相互作用,参与T细胞的活化、增殖和分化,进而在多种疾病的免疫失
注:mRNA:2一她a值;蛋白:目的基因灰度值/内参基因灰度值;8P<0.Ol,6P<0.05
衡中起重要作用。各种成熟的免疫细胞和抗原提呈细胞等表面都有Notch受体和配体的表达,Notch是一种单次跨膜受体蛋白,哺乳动物体内有4种同源的Notch受体,即Notchl/2/3/4,同时还有5种同源配体即Jaggedl/2、Deltal/3/4,通过细胞间的相互接触及1一分泌酶酶解后,活化下游靶基因Hes和Hey家族,共同参与T细胞的活化、增殖和分化,尤其在Thl、Th2、Thl7及Treg等细胞分化中作用显
IL-6等加重慢阻肺气道炎症,分化成熟的Thl7细胞促使小鼠气道高表达CCR6趋化因子受体,趋化中性粒细胞进人肺组织释放中性粒细胞弹力蛋白酶破坏肺组织,加剧气道炎症及肺气肿o14]。Treg细胞是调节性T细胞,是CD4T细胞中有免疫抑制和免疫调节效应的亚群,它可以通过细胞间的直接接触或分泌IL-10和转换生长因子(TGF)一B减轻过度的免疫应答,在慢性炎症和自身免疫疾病中起重要作用。
Eppert等。13。发现慢性香烟暴露增加小鼠肺脏Thl
著‘3川8。。Yu等‘191发现Notch信号通路抑制剂GSI
可使Notch信号通路失活,使特发性血小板减少性紫癜患者Thl7细胞及Thl7/Treg比值显著下降致免疫失衡。Zhang等㈣o发现GSI可减轻卵清蛋白诱导的哮喘的进展,抑制脾脏Thl7反应、降低血清IL一17,抑制气道炎症和减轻临床症状,说明GSI抑制Notch信号通路调节Thl7。GSI可使过敏性哮喘小鼠肺泡灌洗液Th2向Thl的漂移,这种表型的改变与炎性细胞Notch信号相关分子,如GATA-3、Hesl和Notch胞内段的变化一致,表明Notch信号通路参与过敏性哮喘的免疫失衡¨0|。“等心川发现,慢性香烟烟雾暴露小鼠其气管旁淋巴结所有Notch受体和配体的表达均增高,尤以Notch3和Dehal的增高
和Thl7细胞,而Th2细胞无明显变化。慢阻肺患者痰中Treg和Thl7细胞均增加【l5|,稳定期和急性加重慢阻肺患者外周血中Treg细胞的比例明显升高,而Treg/IL一17比值无明显变化¨6I。本研究结果显示慢阻肺小鼠Thl、Thl7和Treg细胞分别较健康对照组升高64%、71%、58%,Th2细胞无明显改变,Thl/Th2的比值明显增加,而Thl7/Treg的比值变化不大,考虑慢阻肺小鼠Thl7和Treg细胞比例较健康对照小鼠均增加,但Thl7细胞增加的幅度较
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明显,这和小鼠肺气肿样形态学变化和Thl占优势的炎症一致。本研究结果表明,GSI明显抑制慢阻肺组小鼠Thl和Thl7细胞,降低Thl/Th2和Thl7/Treg的比值,说明GSI阻断Notch信号通路减少促炎的Thl、Thl7细胞,改善Thl/Th2、Thl7/Treg比例,表明Notch信号通路可能部分参与调控慢阻肺小鼠Thl/Th2、Thl7/Treg免疫失衡。研究还发现慢阻肺小鼠脾源性T细胞Notchl及其下游HeslmRNA和蛋白的表达明显升高,且Notchl及HeslmRNA和蛋白的表达与Thl/CD;和Thl7/CD4+细胞呈正相关,与Th2/CD;和Treg/.CD4+细胞比例呈负相关,GSI能部分抑制Notchl、Hesl的表达和Thl及Thl7细胞,表明Notchl、Hesl的高表达与Thl和Th7细胞增加有关,与Th2和Treg细胞降低有关,Thl7信号通路可能通过调节Thl/Th2、Thl7/Treg失衡参与慢阻肺的免疫紊乱。
总之,慢阻肺小鼠存在T细胞亚群失衡,以Thl、Thl7等促炎细胞增多为主;Notchl及其下游
Hesl
mRNA及蛋白水平升高,且与T淋巴细胞亚群
失衡相关;GSI能部分抑制Notchl、Hesl的表达及Thl、Thl7细胞;Notch信号通路参与慢阻肺的免疫紊乱。
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theThl7/Treg
imbalance
in
cellsfrom
patients
with
immune
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Zhang
W,Zhang
X,ShengA,eta1.1/-SeeretaseInhibitor
AlleviatesAcuteAirwayInflammation
ofAllergic
AsthmainMice
by
Downregnlating
Thl7Cell
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in
cigarettesmoke-inducedpulmonaryemphysemaandbleomycin--
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(收稿日期:2016-03-04)
(本文编辑:蔡蜀菁)
[20]
[21]
主堡笙夔塑壁哩盘查!Q!!生!!旦箜!!鲞筮!!翅垦塾也』坠照堡曼塑Pi!旦堡:堕!!!堂竺垫!!:!!!:塑:型堡!!
・881・
.论著
Notch信号通路在慢性阻塞性肺疾病免疫失衡中的作用及机制研究
杨鑫娜
刘晓菊赵兰婷曾晓丽包海荣
【摘要】目的探讨Notch信号通路在慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)免疫失衡中的作用。方法
BALB/c小鼠30只按随机数字表法分为健康对照组、慢阻肺组及慢阻肺1分泌酶抑制剂(GSI)组。烟草烟雾暴露法建立小鼠慢阻肺模型;尼龙毛柱提纯T淋巴细胞,流式细胞术检测T细胞亚群;实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测Notchl及其下游HeslmRNA和蛋白。结果Thl/CD;T、Thl7/
cDfT和Treg/CD;T慢阻肺组为(13.20±0.95,10.22±0.45,0.41±0.09)较健康对照组(8.07±0.44,5.98±0.26,0.26±0.05)明显增加(均P<0.01);GSI降低Thl/CD;T和Thl7/CD4+T;慢阻肺
组Thl/Th2比值(18.704-4.12)较健康对照组(12.63±1.91)明显升高(P<o.01),慢阻肺组Thl7/
CD;T、Thl7/CD;T较健康对照组分别升高71%、58%,GSI降低慢阻肺Thl/Th2和Thl7/Treg的比值
(均P<0.01)。慢阻肺组Notchl受体及下游HeslmRNA(5.15±0.77,1.92±0.32)和蛋白(0.85±0.04,0.16±0.02)的表达较健康对照组(1.00±0.00,1.00±0.00)和(0.17±0.01,0.09±0.01)明显升高(均P<0.01),GSI明显抑制慢阻肺组Notchl及HeslmRNA和蛋白的表达(均P<0.01)。相关性分析:慢阻肺组Notchl和HeslmRNA和蛋白的表达与Thl和Thl7细胞呈正相关,与TIl2和Treg细胞呈负相关(均P<0.05)。结论慢阻肺小鼠存在T淋巴细胞亚群失衡,以Thl、Thl7等促炎细胞增多为主;Notchl及其下游HeslmRNA及蛋白水平升高,且与T淋巴细胞亚群失衡相关;GSI能部分抑制Notchl、Hesl的表达及Thl、Thl7细胞;Notch信号通路参与慢阻肺的免疫紊乱。
【关键词】肺疾病,慢性阻塞性;受体,Notehl;T淋巴细胞亚群;免疫失衡
基金项目:甘肃省科技支撑项目(144FKCA062);兰州市科技计划项目(2014.1.36)
EffectsandmechanismsofNotchsignalingpathway
on
iinnllmeimbalanteinchronicobstructive
pulmonarydisease
YangXinna,厶ll
Xiaoju,ZhaoLanting,zengXiaoli,BaoHairong.DepartmentofGerontalRespiratoryMedicine,theFirst
HospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China
Correspondingauthor:LiuXiaoju,Entail:liuxiaoju835@126.corn
【Abstract】
Objective
To
explore
theroleofNotchsignalingpathwayonimmuneimbalancein
chronicobstructivepulmonarydisease(COPD).MethodsThirtyBALB/cmicewererandomlyassigned
intothehealthycontrolgroup,COPDgroup,andCOPDGammasecretaseinhibitors(GSI)group.CigarettesmokeexposurewasusedtoestablishtheCOPDmodel.Tcellswereenrichedbyfilteringthroughnylonw001columns.Theproportionofspleen-derivedT.1ymphocytesubsetswasdetectedbyflowcytometrv.Real.timequantitativepolymerasechain
reaction(RT.PCR)and
Westernblot(WB)wereused
todetectthe
expressionofsplenicTcells’NotchlanditsdownstreamHesl
mRNAandproteinrespectively.Results
Thepercentage
of卟l,Thl7
andTregcellsin
CD;T
cellsofCOPD
mice(13.20±0.95,10.22±0.45.
0.41±0.09)%weresignificantlyincreasedcomparedwiththehealthycontrolgroup(8.074-0.44.5.98±0.26,0.26±0.05)%(allP<0.01).TheproportionofThlandThl7cellsinCOPDGSIgroupmice(9.48±0.66,7.70±0.39)%weresignificantlyreducedcomparedwithCOPDgroup(allP<0.01).RatioofThl/Th2inCOPDgroup(18.70±4.12)wassignificantlyincreasedcomparedwiththehealthvcontrolgroup(12.63±1.91)(P<0.01),thepercentageofThl7andTreginCD;Tcellincreased71%
and58%respectively.GSIdecreasedtheratiosofThl/Th2andThl7/Treg(allP<0.01).NotehlreceptoranditsdownstreamHeslmRNAexpression(5.15±0.77,1.92±0.32)andproteinexpression
(0.85±0.04,0.16±0.02)of
COPDmicewere
significantlyincreasedcomparedwitht11ehealthygroup
respectively[(1.00±0.00,1.00±0.00)and(O.17±0.01,0.09±0.01)](allP<0.01).GSI
DOI:10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2016.11.012
作者单位:730000兰州大学第一医院老年呼吸科通信作者:刘晓菊,Email:liuxiaoju835@126.com
生堡箜蕉塑竖咝苤查垫!!生!!旦笠!!鲞筮!!塑堡h也』!!b!堡壁!!E堡旦堡:塑竺!些竺!Q!!:!!!:!!:盟!:!!
significantlyinhibitedtheexpressionofmRNAandproteininNotchlanditsdownstreamHesl(aUP<
0.01).NotchlandHeslmRNAandproteinexpressions
mice,therewasT.1ymphocytesubsetsimbalalice。suchNotchland
its
downstream
Hesl
mRNA
and
as
were
correlatedpositivelywithThlandThl7cells
InCOPD
andnegativelycorrelatedwithT}12andTregcellsinCOPDgroupfauP<0.05).Conclusion
tIleincreasedofThl,Thl7proinflammatorycells,levels
were
protein
increased.andwasassociatedwith
and’rhl7
T—lymphocytesubsetsimbalance.GSIcouldpartiallyinhibitNotchl.HeslexpressionandThl
cells.andthusNotchsignalingpathwaywasinvolvedintheimmunedisorderofCOPDmice.
【Keywords】Pulmonary
Subsets;Immuneimbalance
disease,chronicobstructive;Receptor,Notchl;T—Lymphocyte
Fundprogram:ScienceandTechnologySuppoaProgramofGansuProvince(144FKCA062);Science
andTechnologyProgramofLanzhouCity(2014—1-36)
慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)是以慢性气道炎症和持续气流受限为特征的常见气道疾病,其发病与肺部炎症反应、氧化应激、蛋白酶一抗蛋白酶失衡、自主神经功能失调等有关。近年来,研究发现慢阻肺的发生发展与免疫紊乱密切相关¨J。Notch信号是条高度保守的信号转导途径,在调控T淋巴细胞分化中发挥重要作用旧引。文献报道Notch信号通路参与哮喘等疾病的免疫失衡H引,但在慢阻肺中的作用鲜见报道。本研究以慢阻肺小鼠为研究对象,通过给予Notch信号通路特异性抑制剂1一分泌酶抑制剂(GSI)阻断Notch信号通路,检测慢阻肺小鼠T细胞Notchl受体及其下游分子Hesl及T细胞亚群的比例,观察慢阻肺小鼠Thl、Th2、Thl7和Treg的变化与Notch信号通路的关系,探讨慢阻肺免疫功能紊乱的发生机制,为防治慢阻肺奠定基础。
材料及方法
1.主要材料:兰州牌香烟(甘肃省烟草公司),藻红蛋白(PE)一花青燃料5(CY5)标记的抗小鼠CD4单克隆抗体、PE标记的抗小鼠白介素(IL)_4单克隆抗体、PE标记的抗小鼠叉状头/翅膀状螺旋转录因子(Foxp3)单克隆抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗小鼠IL.17A单克隆抗体、FITC标记的抗小鼠干扰素-^y(美国BioLegend公司),逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒(日本Takara公司)。羊抗鼠Notchl单克隆抗体(美国Santa
Cruz
公司),兔抗鼠Hesl单克隆抗体(英国Abcam公司),GSI(美国Sigma公司),LSRFortessaTM型流式细胞仪(美国BD公司),BIO-RAD
ChemiDocⅢXRS
凝胶成像系统(美国Bio.Rad公司),GYD-003型无创小鼠肺功能仪(法国Emka公司)。
2.慢阻肺小鼠模型建立与实验分组:8周龄雄性BALB/c小鼠30只,平均体重(20±2)g,购白兰州大学实验动物中心[批号SCXK(甘)2013-0002+]。
慢阻肺小鼠模型建立:采用单纯烟草烟雾暴露cm×30cm×35
cm有机玻璃箱
内,每13暴露烟草烟雾4次(4支×45min),间
隔1h,连续90
d∞。1。
分组:小鼠按随机数字表法分为3组:健康对照d后,隔日腹腔注射GSI(1mg/kg),共肺功能测定:造模结束后,采用小鼠无创肺功能min,检测吸气峰流速(PIF)、呼气峰流速(PEF)和呼出50%潮气量时的呼气流速(EFS0)¨。。
肺组织病理标本采集、染色及测定:造模结束的计数,每只小鼠取3个肺组织病理切片,中倍镜下随机取5个视野(避开大血管和支气管),在每个视野正中心划十字交叉线,计数与交叉线相交的肺泡隔数(NS),同时测出十字线总长(L),按公式计算:MLI=L/NS,以表示肺泡平均内径归J。
3.脾脏淋巴细胞分离及T淋巴细胞提纯:无菌取小鼠脾脏,200目滤网研磨过滤,调整细胞数1×108/ml,加于淋巴细胞分离液上,2500转/min,
min,离心半径:10cm,吸取中间层淋巴细胞,磷
酸盐缓冲液洗2次,RPMI.1640调整细胞数2×107/ml,尼龙毛柱过滤提纯T细胞¨1。,调整细胞数为2×106/ml,加入FITC标记CD,抗体,流式细胞仪测定总T(CD;T)细胞。
4.CD4T淋巴细胞(CD;T)亚群检测:参照
Zhang等【l纠方法,RPMI一1640调整脾淋巴细胞悬液细胞数2×106/ml,接种到24孔板,加入佛波酯/离子霉素混合物和布雷菲德菌素/莫能菌素混合物,
5%CO,、37
oC培养8h,调整细胞数1×106/ml,加
入PE/CY5标记CIM抗体,室温避光孵育20min;
法,将小鼠置于50
组、慢阻肺组及慢阻肺GSI组。慢阻肺GSI组小鼠烟草烟雾暴露61计15次,其余两组注射等体积无菌双蒸水¨引。
检测系统检测小鼠肺功能,将小鼠置于体描箱内,在清醒和自由活动状态下适应5后,处死小鼠,取肺组织,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋、切片,苏木素伊红(HE)染色,酒精脱水、烘干,中性树胶封片,进行肺组织切片肺泡平均间隔(MLI)20
虫垡缱拯塑哩噬盘查呈!!鱼生!!旦箜塑鲞箜!!翅gb也』旦!!望堕!!P堡旦堡:堕!!!堂竺!!!!:y!!:!!:盟!:!1
4%多聚甲醛4℃固定10min后破膜,分别加入PE标记IL-4和FITC标记干扰素-Y、PE标记Foxp3和FITC标记IL.17A,室温避光孵育20min,流式细胞仪检测CD4T的Thl、Th2、Thl7和Treg细胞比例。
5.实时荧光定量PCR法检测Notchl和Hesl
0.01,表1)。肺组织病理切片镜下可见慢阻肺组终末细支气管远端气腔膨胀,间隔变窄,弹力纤维变细或断裂,部分肺泡腔扩大、肺泡壁破裂,融合形成肺大疱,肺泡数目明显减少,肺泡间隔可见炎症细胞浸润,MLI较健康对照组、慢阻肺GSI组明显增加(均P<0.01),慢阻肺GSI组小鼠炎症细胞浸润及肺气肿程度较慢阻肺组小鼠轻,健康对照组肺泡组织结构基本完整无异常。
2.T细胞鉴定:通过流式细胞仪检测总T细胞阳性率百分比为(81.76-4-1.53)%。
3.CD4+T淋巴细胞Thl、Th2、Thl7、Treg及其比值:慢阻肺组较健康对照组Thl、Thl7、Treg
CD4+T
mRNA:提取总RNA,逆转录试剂盒合成cDNA。引物:Notchl上游:5
37,下游:5
7.TGCCAGTATGATGTGGATGAG.
7一GGTCCCTGTGTAACCTTCTGT一3’,扩增
7一AGCCCACCTCTCTCT
长度111bp;Hesl上游:5
TCTGAC.3
7,下游:5’一AGGCGCAATCCAATATGAAC一
3’,扩增长度187bp;13一actin上游:5’一CCTCTATGC
CAACACAGTGC.3’,
下游:
5’一ATACTCCTGCTF
及Thl/Th2比值均明显高于健康对照组,Thl7/Treg无明显差异;慢阻肺组Thl7/CD;T、Treg/CD4+T较健康对照组分别升高71%、58%;GSI能明显降低慢阻肺组Thl/CD4+T、Thl7/CD4+T及Thl/Th2和Thl7/Treg的比值,均P<0.01,GSI降低慢阻肺组
Thl7/CD;T
GCTGATCC.3’,扩增长度211bp;反应体系20汕l,扩
增条件:95℃预变性30
0.5
S,95
oC变性5
s,60
oC退火
延伸34S,共40个循环,溶解65~95℃,每5S上升
oC;基因表达采用2“们‘法。
6.Western
blot法检测Notchl和Hesl蛋白:提25%,升高Treg/CD4+T10%(表2)。
取总蛋白测定蛋白含量,取50¨g蛋白样品,10%十二烷基硫酸钠.聚丙烯酰胺凝胶电泳,转至聚偏氟乙烯膜,5%脱脂奶粉室温封闭2h,羊抗鼠Notchl多克隆抗体(1:200)、兔抗鼠Hesl多克隆抗体
(1:7500)及内参照物兔抗鼠甘油醛一3.磷酸脱氢酶(GAPDH)(1:200)4oC过夜,兔抗羊IgG(1:2000)、
4.T淋巴细胞Notchl及HeslmRNA和蛋白的表达:慢阻肺组Notchl及HeslmRNA和蛋白较健康对照组明显增加(均P<0.01),GSI明显抑制慢阻肺组Notchl及HeslmRNA和蛋白的表达,均P<O.01(表3)。
5.相关性分析:慢阻肺组Notchl和HeslmRNA、蛋白的表达与Thl/CD4+T、Thl7/CD4+T细胞比例呈正相关,与Th2/CD,+T、Treg/CD4+T细胞比例呈负相关(表4)。
讨
论
羊抗兔IgG(1:2000)室温2h,显影,检测蛋白条带。蛋白相对表达为目的基因灰度值/内参基因灰度值。
7.统计学处理:采用SPSS21.0软件进行统计学分析,计量资料数据以元±s表示,组间比较采用单因素方差分析和LSD—t检验,Pearson法进行相关性分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
结
果
慢阻肺的发生发展与免疫紊乱密切相关,研究发现慢阻肺患者存在Thl/Th2失衡,且以Thl型细胞增多为主¨J。慢阻肺小鼠肺内Thl细胞的增多产生干扰素一^y,促进炎性细胞肺内积聚,破坏肺脏结构的完整性¨3I。新近研究发现Thl7和Treg细胞也参与慢阻肺的发病,Thl7细胞主要分泌IL一17A、
1.慢阻肺模型:慢阻肺组肺功能PIF、PEF和EF50明显低于健康对照组和慢阻肺GSI组(均P<
表1健康对照组、慢阻肺组小鼠肺功能的比较(面±s)
注:PIF:吸气峰流速;PEF:呼气峰流速;EF50:呼出50%潮气量时的呼气流速;MLI:平均肺泡间隔;8P<0.01为与健康对照组比较;“P<0.01为与慢阻肺组比较
主堡结蕉塑哩哩苤查呈!!!生!!旦筮!!鲞筮!!翅曼!也』旦!!翌曼塑巳堡旦亟堕!!!里!竺!Q!!:y!!:塑:盟!:!!表2各组小鼠脾源性Thl、Th2、Treg和Thl7细胞比例的比较(面±s)
注:与健康对照组比较,8t值为3.03~25.79,均P<0.Ol;与慢阻肺组比较,“t值为3.31~13.29,均P<O.01
表3各组Notchl及HeslmRNA和蛋白的表达结果比较(面±S,A)
注:mRNA:2—6△Q值;蛋白:目的基因灰度值/内参基因灰度值;与健康对照组相比,8t值为10.34~49.19,均P<0.01;与慢阻肺组相比,“t值为5.72~18.75,均P<0.01
表4慢阻肺组各数据相关性分析
Treg细胞高,表明慢阻肺小鼠除存在Thl/Th2失衡外,仍以Thl7细胞增加为主,而具有免疫抑制的Treg细胞增加不足,致免疫失控,肺组织炎性损伤持续。
Notch信号通路通过细胞间的相互作用,参与T细胞的活化、增殖和分化,进而在多种疾病的免疫失
注:mRNA:2一她a值;蛋白:目的基因灰度值/内参基因灰度值;8P<0.Ol,6P<0.05
衡中起重要作用。各种成熟的免疫细胞和抗原提呈细胞等表面都有Notch受体和配体的表达,Notch是一种单次跨膜受体蛋白,哺乳动物体内有4种同源的Notch受体,即Notchl/2/3/4,同时还有5种同源配体即Jaggedl/2、Deltal/3/4,通过细胞间的相互接触及1一分泌酶酶解后,活化下游靶基因Hes和Hey家族,共同参与T细胞的活化、增殖和分化,尤其在Thl、Th2、Thl7及Treg等细胞分化中作用显
IL-6等加重慢阻肺气道炎症,分化成熟的Thl7细胞促使小鼠气道高表达CCR6趋化因子受体,趋化中性粒细胞进人肺组织释放中性粒细胞弹力蛋白酶破坏肺组织,加剧气道炎症及肺气肿o14]。Treg细胞是调节性T细胞,是CD4T细胞中有免疫抑制和免疫调节效应的亚群,它可以通过细胞间的直接接触或分泌IL-10和转换生长因子(TGF)一B减轻过度的免疫应答,在慢性炎症和自身免疫疾病中起重要作用。
Eppert等。13。发现慢性香烟暴露增加小鼠肺脏Thl
著‘3川8。。Yu等‘191发现Notch信号通路抑制剂GSI
可使Notch信号通路失活,使特发性血小板减少性紫癜患者Thl7细胞及Thl7/Treg比值显著下降致免疫失衡。Zhang等㈣o发现GSI可减轻卵清蛋白诱导的哮喘的进展,抑制脾脏Thl7反应、降低血清IL一17,抑制气道炎症和减轻临床症状,说明GSI抑制Notch信号通路调节Thl7。GSI可使过敏性哮喘小鼠肺泡灌洗液Th2向Thl的漂移,这种表型的改变与炎性细胞Notch信号相关分子,如GATA-3、Hesl和Notch胞内段的变化一致,表明Notch信号通路参与过敏性哮喘的免疫失衡¨0|。“等心川发现,慢性香烟烟雾暴露小鼠其气管旁淋巴结所有Notch受体和配体的表达均增高,尤以Notch3和Dehal的增高
和Thl7细胞,而Th2细胞无明显变化。慢阻肺患者痰中Treg和Thl7细胞均增加【l5|,稳定期和急性加重慢阻肺患者外周血中Treg细胞的比例明显升高,而Treg/IL一17比值无明显变化¨6I。本研究结果显示慢阻肺小鼠Thl、Thl7和Treg细胞分别较健康对照组升高64%、71%、58%,Th2细胞无明显改变,Thl/Th2的比值明显增加,而Thl7/Treg的比值变化不大,考虑慢阻肺小鼠Thl7和Treg细胞比例较健康对照小鼠均增加,但Thl7细胞增加的幅度较
虫堡笪篮塑唑咝苤查兰!!鱼生!!旦箜!!鲞箜!!翅£!也』!!!!丝垦!12生堕!:盟!!!塑堡!垫!鱼:!尘:翌:塑!:!!
・885・
明显,这和小鼠肺气肿样形态学变化和Thl占优势的炎症一致。本研究结果表明,GSI明显抑制慢阻肺组小鼠Thl和Thl7细胞,降低Thl/Th2和Thl7/Treg的比值,说明GSI阻断Notch信号通路减少促炎的Thl、Thl7细胞,改善Thl/Th2、Thl7/Treg比例,表明Notch信号通路可能部分参与调控慢阻肺小鼠Thl/Th2、Thl7/Treg免疫失衡。研究还发现慢阻肺小鼠脾源性T细胞Notchl及其下游HeslmRNA和蛋白的表达明显升高,且Notchl及HeslmRNA和蛋白的表达与Thl/CD;和Thl7/CD4+细胞呈正相关,与Th2/CD;和Treg/.CD4+细胞比例呈负相关,GSI能部分抑制Notchl、Hesl的表达和Thl及Thl7细胞,表明Notchl、Hesl的高表达与Thl和Th7细胞增加有关,与Th2和Treg细胞降低有关,Thl7信号通路可能通过调节Thl/Th2、Thl7/Treg失衡参与慢阻肺的免疫紊乱。
总之,慢阻肺小鼠存在T细胞亚群失衡,以Thl、Thl7等促炎细胞增多为主;Notchl及其下游
Hesl
mRNA及蛋白水平升高,且与T淋巴细胞亚群
失衡相关;GSI能部分抑制Notchl、Hesl的表达及Thl、Thl7细胞;Notch信号通路参与慢阻肺的免疫紊乱。
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(收稿日期:2016-03-04)
(本文编辑:蔡蜀菁)
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