蛋白质组学
【摘要】当今分子生物学领域内，蛋白质组已成为研究的热点。基因组相对较稳定，而且各种细胞或生物体的基因组结构有许多基本相似的特征；蛋白质组是动态的，随内外界刺激而变化。对蛋白质组的研究可以使我们更容易接近对生命过程的认识。蛋白质组学是在细胞的整体蛋白质水平上进行研究、从蛋白质整体活动的角度来认识生命活动规律的一门新学科，简要介绍蛋白质组学的科学背景及其最新发展。
【关键词】蛋白质组 实验技术 差异蛋白质组学 应用前景
【正文】1、蛋白质组学产生的科学背景
众所周知，始于20世纪90年代初的庞大的人类基因组计划业已取得了巨大的成就，几个物种（包括人类）的基因组序列已经或即将完成。生命科学已实质性地跨入了后基因组时代，研究重心已开始从揭示生命的所有遗传信息转移到在分子整体水平对功能的研究上。这种转向的第一个标志是产生了功能基因组学（functional genomics）这一新学科，即从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述_如在RNA水平上通过DNA芯片技术检测大量基因的表达模式。而第二个标志则是蛋白质组学的兴起。
蛋白质组（proteome）一词是澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams在1994首次提出，最早见诸于文献是在1995年7月的《Electrophoresis》杂志上
【1~4】。它是指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式。蛋白质组学旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式（修饰形式）、结构、功能和相互作用等_国内已有多篇综述文章介绍了蛋白质组学的产生背景与科学意义，从蛋白质组的定义上就可以清楚看出，蛋白质组学不同于传统的蛋白质学科之处在于它的研究是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的，它从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动的角度来揭示和阐明生命活动的基本规律。
2、概念及相关内容
蛋白质组用来描述一个细胞、组织或有机体表达的所有蛋白质，蛋白质组学（proteomics）则是研究特定时间或特定条件下这些蛋白质表达情况的科学【5】。
蛋白质组学从其研究目标方面可分为表达蛋白质组学和结构蛋白质组学。前者主要研究细胞或组织在不同条件如药物或疾病状态下蛋白质的表达和功能，这将有助于识别疾病特异蛋白、药物作用靶点、药物功效和毒性标记等, 目前蛋白
质组学的研究在这方面开展的最为广泛，其运用技术主要依赖双相凝胶电泳技术以及图像分析系统, 当对感兴趣的蛋白质进行分析时可能用到质谱。由于蛋白质发生修饰后其电泳特性将发生改变，这些技术可以直接测定蛋白质的含量，并有助于发现蛋白质翻译后的修饰，如糖基化和磷酸化等。
结构蛋白质组学的目标是识别蛋白质的结构并研究蛋白质间的相互作用。蛋白质之间的相互作用与控制细胞生长、复制等的代谢和信号通路有关，蛋白质之间相互作用的改变可能引起人类疾病，因此蛋白质之间的相互作用在识别新的药物干预靶点方面有很大的潜力【6】。近年来，酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用时常用的方法，同时研究者也将此方法不断改进。有研究者最近发现在研究蛋白质相互作用时通过纯化蛋白复合物并用质谱进行识别是很有价值的。
3、蛋白质组是基因组研究逻辑性的发展
人类基因组研究的兴起标志着生命科学进入一个从总体、综合角度理解生命活动分子基础的新阶段.2001 年2月参与人类基因组计划的各国科学家宣布人类基因组图谱基本绘制完成，但对其调节及功能等仍远未解读. 被赋予研究其表达调节及其产物功能任务的“后基因组学”也即因运而生. 基因的功能主要通过其编码的蛋白质来实现，蛋白质是生命活动的真正执行者. 蛋白质组学被认为是后基因组研究中的最主要部分，与基因组相比，蛋白质组的组成更为复杂，功能更为活跃，更直接切近生命活动的本质，其研究的应用前景也更广泛和直接【7】。
1. 蛋白质组的组成远比基因组庞大和复杂
分子生物学发展初期的一个知名的信条是“一个基因一个蛋白质”。但后来已证实这是不确的，1个基因可以生产出多于1个蛋白质。越是较高等的细胞，这种数量上的差异越明显。据估计，在E.cOIi 1个基因可编码1.3个蛋白；在
S.cerevisiae 1个基因可编码3个蛋白；人的1个基因大约可编码10种蛋白。这是由于1个基因可经过基因内重组或在转录中经过不同的剪接翻译成不同的蛋白质，而蛋白质在合成之后又可能进行不同的翻译后修饰，包括磷酸化、糖基化、硫基化、酰基化、甲基化等. 人类基因组的基因可能生产出几十万个蛋白。仅从这一个角度也可以看出，即使我们对基因组全部读出，仍然不足以对全部蛋白质的种类和数量加以描述和预测，更不足以对主要由蛋白质演绎的复杂生命活动加以描述和预测了。
2. 蛋白质具有相对独立的代谢过程
由DNA编码合成的蛋白质，在其运输、装配方式、降解时间和途径等方面对编码它的DNA具有相对的独立性。例如，在细胞周期调控中cycIin B在G1晚期开始表达并逐渐积累，到G2期后期阶段达到最大值并一直维持到M期中期段，然后特异性地迅速降解。目前已知的所有细胞周期调控蛋白及其他许多蛋白都具有各自严格的代谢途径和“生命”周期。
3. 蛋白质之间存在着活跃、广泛的相互作用
在很大程度上我们可以说“没有一个蛋白质是单独发挥其生物学作用的”，它需要与其他的分子相互作用才能完成其复杂的生理功能。蛋白质之间的相互作用不限于过去认识到的连锁反应或级联反应，它是一个复杂交错和具有精密调控的反应网络。蛋白质组学从多方位、多角度去研究蛋白质之间的相互作用和相互调控。相对来说，基因之间并不发生这种直接的相互作用。因此，只有通过对所有蛋白质的总和进行研究，即开展蛋白质组学研究，才能更加贴近地掌握生命的现象和本质，找到生命活动的规律。
4、蛋白质组学实验技术——二维聚丙烯酰胺凝胶电泳【8】
1．样品制备
样品制备是二维凝胶电泳成功的关键，直接影响到蛋白质组研究结果。其一般过程是：对细胞、组织等样品进行破碎、溶解、失活和还原，断开蛋白质之间的连接键，提取全部蛋白质，除去非蛋白质部分。为获得最佳双向电泳分离结果，样品应当用脲素、一种非离子去垢剂、IPG缓冲液和还原剂将其变性并充分溶解。
2．二维聚丙烯酰胺凝胶电泳
Farrell、Klose和Scheele(1975年)分别建立了二维凝胶电泳(two-
dimensional polyacry-lamide gel electrophoresis，2一D PAGE)。目前在一张凝胶上能同时分离几千个甚至上万个蛋白质点。二维凝胶电泳的第一向是等电聚焦(isoelectric fo—cusing，IEF)，根据蛋白质等电点(pI)不同而将之分离。最早采用载体两性电解质pH梯度等电聚焦。其中包括平衡pH梯度电泳(IS0一DALT)；非平衡pH梯度电泳(nonequilibri—UlTI pH gradients
electrophoresis，NEPHGE)。后者常用于分离碱性蛋白质，pI7 l1．5，电泳展开时间相对比较短。
Biellqvist(1982年)等发明了固相化pH梯度(immobilizedpH gradients，IPG)等电聚焦。它的优点是：不产生电极漂移；pH梯度稳定，pH相差1个pH单位的商品胶条已经上市；上样量大，可达几十毫克，因此常用于蛋白质微量制备；重复性好，使不同人、不同实验室之间的实验结果能够相互比较，这是它最突出的优点。
双向凝胶电泳的第二向是sDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据蛋白质分子质量不同而将之分离。一般采用垂直电泳或水平电泳，两种方法的实验结果没有明显的差别，均适用于分子质量在10～150ku蛋白质。判断双向凝胶电泳的好坏通过其图谱而获得。一张好的图谱必须低背景、少纹理、分辨率高、灵敏度高，而且图谱之间必须存在良好的重现性。为了达到上述目的，已经对双向凝 胶电泳进行了改进。市售的微型2-D PAGE系统，从IPG胶条的重泡胀到考马斯亮蓝染色，整个操作9小时内完成。另外Large Scale Biology公司(Rockville，MD，美国)开发研制了每周展开100块凝胶的仪器，还有Proteome公司(Beverley，MA，美国)已经开发了一种完全自动化的仪器一Proteomatron，6张大胶(40cm~40cm)从灌制、展开、染色全部实现自动化。从商业购买预制IPG胶条、sDS一聚丙烯酰胺垂直预制胶或水平预制胶。对样品采用同位素标记，以此提高检测灵敏度。对样品采用两种不同的同位素进行标记，如 125I、131 I，能在两种不同实验条件下，在同一块凝胶上进行双向凝胶电泳，根据标记的同位素不同，可得到二张凝胶电泳图谱，并能观察到不同的蛋白质表达。
为了获得一张包含细胞内表达的全部蛋白质图谱，有报道采用“蛋白质组重叠群”(proteome contigs)方法。该法与高灵敏度的质谱联用能检测出低丰度蛋白质。双向凝胶电泳蛋白质点的矢量图(vector map of the 2一D ge1)是专门用来研究蛋白质翻译后是否修饰的一种方法，通过此法能了解蛋白质翻译后修饰程度。
3．蛋白质点的染色
凝胶上的蛋白质点染色常用方法有银染色、考马斯亮蓝染色法，另外还采用以下染色试剂：丽春红S、氨基黑、印度墨、S硫脲银、胶态金、咪咪锌等。银染法广泛用于双向凝胶电泳分离后蛋白质点的染色，该法灵敏度为4ng，但对质谱测定有干扰，必须先脱银。考马斯亮蓝染色法可用于胶上或膜上蛋白质点染色，
该法操作方便、重现性好，同银染法一样，质谱测定时必须先脱色。
4．凝胶图像分析
凝胶图像分析首先是建立以向凝胶电泳图谱，可用图像扫描仪、激光光密度仪、磷光或荧光测定仪等，把双向凝胶电泳后凝胶上的蛋白质点数字化。
其次是对不同组织、不同细胞表达的蛋白质图谱进行比较。常用的软件有Amersham Pharmacia公司ImageMaster2-D、Bio-Red公司Pdquest，另外还有Tycho、Gellab、Kepler、GR42、Lips、Hermes、Elsie、Gemini和Melanie。运用软件对凝胶图谱去除纹理及背景，找出表达上差异的蛋白质点，并对其进行分析，发现有生物学意义的蛋白质。
5、差异蛋白质组研究
1. 差异蛋白质组学的研究在技术上有更高的可实现性
目前对蛋白质组学的研究仍采用传统技术，例如双向电泳、质谱。双向电泳虽然仍是目前可以分辨最多蛋白质种类的技术，并在技术上已有了很大的改进，使其重复性和灵敏度大大提高，但它无法检测疏水性蛋白、极端pH的酸性蛋白和碱性蛋白以及某些低丰度蛋白，因此远不能捕获细胞内的全部蛋白质。质谱在蛋白质分析方面虽然具有高分辨率和高灵敏度的优点，但它需要在检测之前对样品进行必要的纯化，因而无法实现高通量的蛋白质分析【9】。此外，质谱是通过分子的飞行时间和带电荷多少来计算分子的分子质量的，因而它无法区分分子和带电荷相同的同分异构体的质量。 上述这些技术的不完善都使得蛋白质组学建档式的研究在当前还难以大规模地迅速开展。
另一方面差异蛋白质组学研究由于并不要求捕获“全部”蛋白，而重在找出有意义的差异蛋白，因而有着高得多的可实现性。双向电泳在差异蛋白质组分析中如同在“完全”蛋白质分析中一样，仍然是一项重要的技术，适用于差异蛋白质的检出。美国Ciphergen 公司研发的基质辅助激光解析离子化系统（SELDI）集分离纯化和质谱检测于一身，虽然它不具有分辨率和灵敏度方面的特别优势，但它可以直接检测相对原始的生物样品，并可同时进行多样品、多蛋白的检测，从而提供了适合于差异蛋白质组学研究的可比较性系统。 此外，一些新的方法如稳定同位素标记技术等正在迅速发展，它们使质谱技术在蛋白质定量研究方面的能力大大提高了，这将会有力地促进差异蛋白质组学研究的进展。
2. 差异蛋白质组学反映了蛋白质的动态本质
一个生物体在经历生长、发育及各种生理过程，甚至病理过程中，其基因组通常是始终维持稳定不变的，也即它可能表达的全部蛋白质的总和也是不变的，而其蛋白质组的构成却在随时发生着严格而活跃的改变。实际上几乎没有任何一种细胞在任何一个时刻是表达“所有”蛋白质的。例如人类细胞大约有290 种左右分化的细胞，在每个细胞中约只有10 000 种蛋白质. 而每个细胞在它不同功能状态、细胞周期不同时相、接受不同条件因素刺激或药物作用下，其蛋白质组也会发生相应的变化。正是这种不同的蛋白质组构成了这一细胞这一时刻的特征性生命活动的基础。因此，对于这种蛋白质组的特有组成及其改变的研究，即差异蛋白质组研究，是认识生命活动本质的一个恰当而直接的途径.例如对细胞周期曾进行过形态的、生理的、动力学的大量观察与研究，而直到发现了CDK（它本身是蛋白质，又促进特定蛋白质的磷酸化）以及cyciin（周期蛋白）严格按照时限出现与消失，才算真正揭示了细胞周期运转的本质。毫无疑问，更多的生命现象将会在分子水平获得日益深入的解释. 而在差异蛋白质组学的推动下，这一进程会变得更加自觉和快速。
3. 差异蛋白质组学具有广泛和明确的应用前景
一个细胞的生命活动，基本上说就是构成其相应蛋白质组的蛋白质的相互装配及相互反应的表现和结果。只要能够获得它们在蛋白质组上的差别或变化的足够信息，就能够指证这个细胞或生物体所处的状态，以及它们的状态是正常或是异常，甚至常常可能找到其异常的原因。因此，差异蛋白质组学的研究在疾病的早期诊断、病程及疗效监测、环境因素影响分析等方面的应用价值是不言而喻的。例如目前对疾病特别是肿瘤的早期标志蛋白分子（biomarker）的筛选已在世界范围内形成热潮。以这类标志分子（主要是蛋白质）为依据的分子诊断技术将形成未来临床诊断的主流，而这又会有力地促进网络辅助医疗诊断的发展，使整个医疗事业的面貌发生巨大的变化，这种前景的到来已为时不远。此外，在农业育种、基因工程产物的鉴定、食品蛋白质评价等方面，差异蛋白质组学也有着广泛的应用前景。这除了样品的选取不同外，在研究方法上与上述的biomarker 筛选并没有什么不同。
7、蛋白质组学的应用
1. 蛋白质组学在细菌研究中的应用
蛋白质组学方法已广泛用于研究细菌在外界环境变化时其表达蛋白的变化情况。如对霍乱弧菌以及大肠杆菌在不同酸碱条件下蛋白表达的变化的研究，表明这些病原菌会随环境的改变而调节蛋白表达以使其达到最大的致病能力。
蛋白质组学可以与基因组学互补，它能识别某些基因的预测产物，尤其是膜蛋白，这些膜蛋白往往是疫苗的有效成分，如Deb N.Chakravarti 等研究了Hp疫苗的相关组分，加速了疫苗的开发。
蛋白组学研究也应用在细胞周期研究中，细菌在繁殖周期的每个阶段合成大量蛋白，表明周期性的蛋白表达有助于细菌充分利用能源，保持合适的细菌数量，对机体产生一定的作用。这种对细菌细胞周期调控蛋白表达和降解的研究有助于抗感染措施的制定。
对细菌某些特异抗原的识别可以为一些疾病提供诊断标记。
2. 蛋白质组学在真核生物研究中的应用
蛋白质组学研究已广泛应用于真核生物的研究中。Michel Perrot等用2DE及质谱、免疫杂交、微量测序等方法分离和鉴定了酿酒酵母的401种蛋白，309种以前曾报道过，剩余的92种是新发现的，从而拓展了酵母参考图谱，为研究细胞功能、酵母翻译因子靶点提供了条件【10】。
3. 蛋白质组学在植物研究中的应用
植物蛋白质组学虽然刚刚起步，但它的发展将对植物界有很大的冲击。H型硫氧还蛋白能减少靶蛋白的二硫键，促使种子发芽。为了更好地了解硫氧还蛋白在种子中的作用，应先了解其作用的靶蛋白。Hiroyuki Yano等运用蛋白组学方法分离了20多种靶蛋白，并鉴定了其中的5种，其中3种是变态反应原，2种与落叶及种子成熟有关
4. 蛋白质组学与肿瘤研究
肿瘤涉及到控制正常细胞增殖机制的破坏。对原癌基因的鉴定和描述已通过分子生物学方法完成。然而有些基因并不是自己单独作用，也不是典型地破坏正常细胞增殖机制。用传统的生物化学方法、基因、药物学方法都不能分析。蛋白组学技术可以比较正常组织与癌组织的变化，这种肿瘤相关的变化可以为医疗干预提供新的标记和位点。Mrtin.J.Page等用蛋白组学技术分离和研究了乳腺癌相
关蛋白。对肿瘤抗原或与其相关抗体的分离和鉴定给肿瘤的早期诊断和治疗提供了一种新的方案。Franck M.Brichery等运用蛋白组学方法研究了肺癌组织中引起体液免疫应答的蛋白及自身抗体。他们所研究的肺癌病人中多于一半的人血清中有针对AnnexinI或/和II的IgG1和IgM自身抗体，AnnexinII自身抗体仅在肺癌病人血清中出现，而AnnexinI自身抗体也在其他类型病人血清中出现。这些研究有助于推动针对肿瘤中某种蛋白的自身抗体的发展【11】。Shugo Nawata等用2DE及免疫杂交法研究了鳞状细胞癌肿瘤组织抗原-1、抗原-2，发现了鳞状细胞癌抗原新的酸性蛋白，有助于开发一种检测此蛋白的系统，为鉴别诊断提供依据。
8、展望
目前有约60种微生物的全基因组序列已经测出, DNA序列信息仅提供了细胞运用其基因的所有可能方式的一种静态瞬间快照, 蛋白质组学则研究基因编码的活动怎样发生和什么时候发生(如蛋白翻译), 以及非基因编码的活动之间的关系(如蛋白质翻译后的修饰或蛋白质、核酸、脂类、糖类之的相互作用)【12】。因为实际蛋白数量反映了翻译的能力和效率、翻译后的修饰和每个蛋白的转化比率，蛋白质组学分析给基因表达最终产物的研究提供了信息。因此它是对翻译水平等研究的一种补充，是全面了解基因组表达必不可少的一种手段，它的发展将给分子生物学领域带来革命性变化。
【参考文献】1 李伯良 功能蛋白质组学 生命的化学，1998，18（6）：1~4 2 王志珍，邹承鲁 后基因组-蛋白质组研究 生物化学与生物物理学报，1998，30（6）：533～539
3 李林，吴家睿，李伯良 蛋白质组学的产生及其重要意义 生命科学，1999,11(2):49～50
4 李林 蛋白质组学的进展 生物化学与生物物理进展，2000，27（3）：227 5 Walter P., Blackstock , Weir MP. Proteomics: quantitative and physical mapping of cellular proteins. Tibtech, March , 1999 , 17:121-127. 6 Figeys D, McBroom LD,. Moran MF. Masss Spectry for the Study of Protein-Protein Interactions. Methods , 2001, 24: 230-239
7 何大澄 肖雪媛 差异蛋白质组学及其应用 北京师范大学学报，2002，8（38） 8 张红 张卉 张晓 蛋白质组学实验技术研究进展 四川解剖学杂志，2004，12
（8）：133
9 韩宾.李轶女.易咏竹.张志芳.沈桂芳差异蛋白质组学在家蚕中的研究进展[期刊论文]-生物技术通
报 2010(6)
10 Perrot M, Saglicocco F, Mini T, et al. Two-dimensional gel protein database of Saccharomyces cerevisiae(update 1999).
Electrophoresis,August;1999 ,20(11):2280-98.
11 Brichory FM,. MisekDE, Yim AM, et al. An immune response manifested by the common occurrence of annexins I and II autoantibodies and high circulating levels of IL-6 in lung cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Aug 14;98 (17):9824-9829.
12 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室 蛋白质组学的相关技术及应用
蛋白质组学
【摘要】当今分子生物学领域内，蛋白质组已成为研究的热点。基因组相对较稳定，而且各种细胞或生物体的基因组结构有许多基本相似的特征；蛋白质组是动态的，随内外界刺激而变化。对蛋白质组的研究可以使我们更容易接近对生命过程的认识。蛋白质组学是在细胞的整体蛋白质水平上进行研究、从蛋白质整体活动的角度来认识生命活动规律的一门新学科，简要介绍蛋白质组学的科学背景及其最新发展。
【关键词】蛋白质组 实验技术 差异蛋白质组学 应用前景
【正文】1、蛋白质组学产生的科学背景
众所周知，始于20世纪90年代初的庞大的人类基因组计划业已取得了巨大的成就，几个物种（包括人类）的基因组序列已经或即将完成。生命科学已实质性地跨入了后基因组时代，研究重心已开始从揭示生命的所有遗传信息转移到在分子整体水平对功能的研究上。这种转向的第一个标志是产生了功能基因组学（functional genomics）这一新学科，即从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述_如在RNA水平上通过DNA芯片技术检测大量基因的表达模式。而第二个标志则是蛋白质组学的兴起。
蛋白质组（proteome）一词是澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams在1994首次提出，最早见诸于文献是在1995年7月的《Electrophoresis》杂志上
【1~4】。它是指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式。蛋白质组学旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式（修饰形式）、结构、功能和相互作用等_国内已有多篇综述文章介绍了蛋白质组学的产生背景与科学意义，从蛋白质组的定义上就可以清楚看出，蛋白质组学不同于传统的蛋白质学科之处在于它的研究是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的，它从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动的角度来揭示和阐明生命活动的基本规律。
2、概念及相关内容
蛋白质组用来描述一个细胞、组织或有机体表达的所有蛋白质，蛋白质组学（proteomics）则是研究特定时间或特定条件下这些蛋白质表达情况的科学【5】。
蛋白质组学从其研究目标方面可分为表达蛋白质组学和结构蛋白质组学。前者主要研究细胞或组织在不同条件如药物或疾病状态下蛋白质的表达和功能，这将有助于识别疾病特异蛋白、药物作用靶点、药物功效和毒性标记等, 目前蛋白
质组学的研究在这方面开展的最为广泛，其运用技术主要依赖双相凝胶电泳技术以及图像分析系统, 当对感兴趣的蛋白质进行分析时可能用到质谱。由于蛋白质发生修饰后其电泳特性将发生改变，这些技术可以直接测定蛋白质的含量，并有助于发现蛋白质翻译后的修饰，如糖基化和磷酸化等。
结构蛋白质组学的目标是识别蛋白质的结构并研究蛋白质间的相互作用。蛋白质之间的相互作用与控制细胞生长、复制等的代谢和信号通路有关，蛋白质之间相互作用的改变可能引起人类疾病，因此蛋白质之间的相互作用在识别新的药物干预靶点方面有很大的潜力【6】。近年来，酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用时常用的方法，同时研究者也将此方法不断改进。有研究者最近发现在研究蛋白质相互作用时通过纯化蛋白复合物并用质谱进行识别是很有价值的。
3、蛋白质组是基因组研究逻辑性的发展
人类基因组研究的兴起标志着生命科学进入一个从总体、综合角度理解生命活动分子基础的新阶段.2001 年2月参与人类基因组计划的各国科学家宣布人类基因组图谱基本绘制完成，但对其调节及功能等仍远未解读. 被赋予研究其表达调节及其产物功能任务的“后基因组学”也即因运而生. 基因的功能主要通过其编码的蛋白质来实现，蛋白质是生命活动的真正执行者. 蛋白质组学被认为是后基因组研究中的最主要部分，与基因组相比，蛋白质组的组成更为复杂，功能更为活跃，更直接切近生命活动的本质，其研究的应用前景也更广泛和直接【7】。
1. 蛋白质组的组成远比基因组庞大和复杂
分子生物学发展初期的一个知名的信条是“一个基因一个蛋白质”。但后来已证实这是不确的，1个基因可以生产出多于1个蛋白质。越是较高等的细胞，这种数量上的差异越明显。据估计，在E.cOIi 1个基因可编码1.3个蛋白；在
S.cerevisiae 1个基因可编码3个蛋白；人的1个基因大约可编码10种蛋白。这是由于1个基因可经过基因内重组或在转录中经过不同的剪接翻译成不同的蛋白质，而蛋白质在合成之后又可能进行不同的翻译后修饰，包括磷酸化、糖基化、硫基化、酰基化、甲基化等. 人类基因组的基因可能生产出几十万个蛋白。仅从这一个角度也可以看出，即使我们对基因组全部读出，仍然不足以对全部蛋白质的种类和数量加以描述和预测，更不足以对主要由蛋白质演绎的复杂生命活动加以描述和预测了。
2. 蛋白质具有相对独立的代谢过程
由DNA编码合成的蛋白质，在其运输、装配方式、降解时间和途径等方面对编码它的DNA具有相对的独立性。例如，在细胞周期调控中cycIin B在G1晚期开始表达并逐渐积累，到G2期后期阶段达到最大值并一直维持到M期中期段，然后特异性地迅速降解。目前已知的所有细胞周期调控蛋白及其他许多蛋白都具有各自严格的代谢途径和“生命”周期。
3. 蛋白质之间存在着活跃、广泛的相互作用
在很大程度上我们可以说“没有一个蛋白质是单独发挥其生物学作用的”，它需要与其他的分子相互作用才能完成其复杂的生理功能。蛋白质之间的相互作用不限于过去认识到的连锁反应或级联反应，它是一个复杂交错和具有精密调控的反应网络。蛋白质组学从多方位、多角度去研究蛋白质之间的相互作用和相互调控。相对来说，基因之间并不发生这种直接的相互作用。因此，只有通过对所有蛋白质的总和进行研究，即开展蛋白质组学研究，才能更加贴近地掌握生命的现象和本质，找到生命活动的规律。
4、蛋白质组学实验技术——二维聚丙烯酰胺凝胶电泳【8】
1．样品制备
样品制备是二维凝胶电泳成功的关键，直接影响到蛋白质组研究结果。其一般过程是：对细胞、组织等样品进行破碎、溶解、失活和还原，断开蛋白质之间的连接键，提取全部蛋白质，除去非蛋白质部分。为获得最佳双向电泳分离结果，样品应当用脲素、一种非离子去垢剂、IPG缓冲液和还原剂将其变性并充分溶解。
2．二维聚丙烯酰胺凝胶电泳
Farrell、Klose和Scheele(1975年)分别建立了二维凝胶电泳(two-
dimensional polyacry-lamide gel electrophoresis，2一D PAGE)。目前在一张凝胶上能同时分离几千个甚至上万个蛋白质点。二维凝胶电泳的第一向是等电聚焦(isoelectric fo—cusing，IEF)，根据蛋白质等电点(pI)不同而将之分离。最早采用载体两性电解质pH梯度等电聚焦。其中包括平衡pH梯度电泳(IS0一DALT)；非平衡pH梯度电泳(nonequilibri—UlTI pH gradients
electrophoresis，NEPHGE)。后者常用于分离碱性蛋白质，pI7 l1．5，电泳展开时间相对比较短。
Biellqvist(1982年)等发明了固相化pH梯度(immobilizedpH gradients，IPG)等电聚焦。它的优点是：不产生电极漂移；pH梯度稳定，pH相差1个pH单位的商品胶条已经上市；上样量大，可达几十毫克，因此常用于蛋白质微量制备；重复性好，使不同人、不同实验室之间的实验结果能够相互比较，这是它最突出的优点。
双向凝胶电泳的第二向是sDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据蛋白质分子质量不同而将之分离。一般采用垂直电泳或水平电泳，两种方法的实验结果没有明显的差别，均适用于分子质量在10～150ku蛋白质。判断双向凝胶电泳的好坏通过其图谱而获得。一张好的图谱必须低背景、少纹理、分辨率高、灵敏度高，而且图谱之间必须存在良好的重现性。为了达到上述目的，已经对双向凝 胶电泳进行了改进。市售的微型2-D PAGE系统，从IPG胶条的重泡胀到考马斯亮蓝染色，整个操作9小时内完成。另外Large Scale Biology公司(Rockville，MD，美国)开发研制了每周展开100块凝胶的仪器，还有Proteome公司(Beverley，MA，美国)已经开发了一种完全自动化的仪器一Proteomatron，6张大胶(40cm~40cm)从灌制、展开、染色全部实现自动化。从商业购买预制IPG胶条、sDS一聚丙烯酰胺垂直预制胶或水平预制胶。对样品采用同位素标记，以此提高检测灵敏度。对样品采用两种不同的同位素进行标记，如 125I、131 I，能在两种不同实验条件下，在同一块凝胶上进行双向凝胶电泳，根据标记的同位素不同，可得到二张凝胶电泳图谱，并能观察到不同的蛋白质表达。
为了获得一张包含细胞内表达的全部蛋白质图谱，有报道采用“蛋白质组重叠群”(proteome contigs)方法。该法与高灵敏度的质谱联用能检测出低丰度蛋白质。双向凝胶电泳蛋白质点的矢量图(vector map of the 2一D ge1)是专门用来研究蛋白质翻译后是否修饰的一种方法，通过此法能了解蛋白质翻译后修饰程度。
3．蛋白质点的染色
凝胶上的蛋白质点染色常用方法有银染色、考马斯亮蓝染色法，另外还采用以下染色试剂：丽春红S、氨基黑、印度墨、S硫脲银、胶态金、咪咪锌等。银染法广泛用于双向凝胶电泳分离后蛋白质点的染色，该法灵敏度为4ng，但对质谱测定有干扰，必须先脱银。考马斯亮蓝染色法可用于胶上或膜上蛋白质点染色，
该法操作方便、重现性好，同银染法一样，质谱测定时必须先脱色。
4．凝胶图像分析
凝胶图像分析首先是建立以向凝胶电泳图谱，可用图像扫描仪、激光光密度仪、磷光或荧光测定仪等，把双向凝胶电泳后凝胶上的蛋白质点数字化。
其次是对不同组织、不同细胞表达的蛋白质图谱进行比较。常用的软件有Amersham Pharmacia公司ImageMaster2-D、Bio-Red公司Pdquest，另外还有Tycho、Gellab、Kepler、GR42、Lips、Hermes、Elsie、Gemini和Melanie。运用软件对凝胶图谱去除纹理及背景，找出表达上差异的蛋白质点，并对其进行分析，发现有生物学意义的蛋白质。
5、差异蛋白质组研究
1. 差异蛋白质组学的研究在技术上有更高的可实现性
目前对蛋白质组学的研究仍采用传统技术，例如双向电泳、质谱。双向电泳虽然仍是目前可以分辨最多蛋白质种类的技术，并在技术上已有了很大的改进，使其重复性和灵敏度大大提高，但它无法检测疏水性蛋白、极端pH的酸性蛋白和碱性蛋白以及某些低丰度蛋白，因此远不能捕获细胞内的全部蛋白质。质谱在蛋白质分析方面虽然具有高分辨率和高灵敏度的优点，但它需要在检测之前对样品进行必要的纯化，因而无法实现高通量的蛋白质分析【9】。此外，质谱是通过分子的飞行时间和带电荷多少来计算分子的分子质量的，因而它无法区分分子和带电荷相同的同分异构体的质量。 上述这些技术的不完善都使得蛋白质组学建档式的研究在当前还难以大规模地迅速开展。
另一方面差异蛋白质组学研究由于并不要求捕获“全部”蛋白，而重在找出有意义的差异蛋白，因而有着高得多的可实现性。双向电泳在差异蛋白质组分析中如同在“完全”蛋白质分析中一样，仍然是一项重要的技术，适用于差异蛋白质的检出。美国Ciphergen 公司研发的基质辅助激光解析离子化系统（SELDI）集分离纯化和质谱检测于一身，虽然它不具有分辨率和灵敏度方面的特别优势，但它可以直接检测相对原始的生物样品，并可同时进行多样品、多蛋白的检测，从而提供了适合于差异蛋白质组学研究的可比较性系统。 此外，一些新的方法如稳定同位素标记技术等正在迅速发展，它们使质谱技术在蛋白质定量研究方面的能力大大提高了，这将会有力地促进差异蛋白质组学研究的进展。
2. 差异蛋白质组学反映了蛋白质的动态本质
一个生物体在经历生长、发育及各种生理过程，甚至病理过程中，其基因组通常是始终维持稳定不变的，也即它可能表达的全部蛋白质的总和也是不变的，而其蛋白质组的构成却在随时发生着严格而活跃的改变。实际上几乎没有任何一种细胞在任何一个时刻是表达“所有”蛋白质的。例如人类细胞大约有290 种左右分化的细胞，在每个细胞中约只有10 000 种蛋白质. 而每个细胞在它不同功能状态、细胞周期不同时相、接受不同条件因素刺激或药物作用下，其蛋白质组也会发生相应的变化。正是这种不同的蛋白质组构成了这一细胞这一时刻的特征性生命活动的基础。因此，对于这种蛋白质组的特有组成及其改变的研究，即差异蛋白质组研究，是认识生命活动本质的一个恰当而直接的途径.例如对细胞周期曾进行过形态的、生理的、动力学的大量观察与研究，而直到发现了CDK（它本身是蛋白质，又促进特定蛋白质的磷酸化）以及cyciin（周期蛋白）严格按照时限出现与消失，才算真正揭示了细胞周期运转的本质。毫无疑问，更多的生命现象将会在分子水平获得日益深入的解释. 而在差异蛋白质组学的推动下，这一进程会变得更加自觉和快速。
3. 差异蛋白质组学具有广泛和明确的应用前景
一个细胞的生命活动，基本上说就是构成其相应蛋白质组的蛋白质的相互装配及相互反应的表现和结果。只要能够获得它们在蛋白质组上的差别或变化的足够信息，就能够指证这个细胞或生物体所处的状态，以及它们的状态是正常或是异常，甚至常常可能找到其异常的原因。因此，差异蛋白质组学的研究在疾病的早期诊断、病程及疗效监测、环境因素影响分析等方面的应用价值是不言而喻的。例如目前对疾病特别是肿瘤的早期标志蛋白分子（biomarker）的筛选已在世界范围内形成热潮。以这类标志分子（主要是蛋白质）为依据的分子诊断技术将形成未来临床诊断的主流，而这又会有力地促进网络辅助医疗诊断的发展，使整个医疗事业的面貌发生巨大的变化，这种前景的到来已为时不远。此外，在农业育种、基因工程产物的鉴定、食品蛋白质评价等方面，差异蛋白质组学也有着广泛的应用前景。这除了样品的选取不同外，在研究方法上与上述的biomarker 筛选并没有什么不同。
7、蛋白质组学的应用
1. 蛋白质组学在细菌研究中的应用
蛋白质组学方法已广泛用于研究细菌在外界环境变化时其表达蛋白的变化情况。如对霍乱弧菌以及大肠杆菌在不同酸碱条件下蛋白表达的变化的研究，表明这些病原菌会随环境的改变而调节蛋白表达以使其达到最大的致病能力。
蛋白质组学可以与基因组学互补，它能识别某些基因的预测产物，尤其是膜蛋白，这些膜蛋白往往是疫苗的有效成分，如Deb N.Chakravarti 等研究了Hp疫苗的相关组分，加速了疫苗的开发。
蛋白组学研究也应用在细胞周期研究中，细菌在繁殖周期的每个阶段合成大量蛋白，表明周期性的蛋白表达有助于细菌充分利用能源，保持合适的细菌数量，对机体产生一定的作用。这种对细菌细胞周期调控蛋白表达和降解的研究有助于抗感染措施的制定。
对细菌某些特异抗原的识别可以为一些疾病提供诊断标记。
2. 蛋白质组学在真核生物研究中的应用
蛋白质组学研究已广泛应用于真核生物的研究中。Michel Perrot等用2DE及质谱、免疫杂交、微量测序等方法分离和鉴定了酿酒酵母的401种蛋白，309种以前曾报道过，剩余的92种是新发现的，从而拓展了酵母参考图谱，为研究细胞功能、酵母翻译因子靶点提供了条件【10】。
3. 蛋白质组学在植物研究中的应用
植物蛋白质组学虽然刚刚起步，但它的发展将对植物界有很大的冲击。H型硫氧还蛋白能减少靶蛋白的二硫键，促使种子发芽。为了更好地了解硫氧还蛋白在种子中的作用，应先了解其作用的靶蛋白。Hiroyuki Yano等运用蛋白组学方法分离了20多种靶蛋白，并鉴定了其中的5种，其中3种是变态反应原，2种与落叶及种子成熟有关
4. 蛋白质组学与肿瘤研究
肿瘤涉及到控制正常细胞增殖机制的破坏。对原癌基因的鉴定和描述已通过分子生物学方法完成。然而有些基因并不是自己单独作用，也不是典型地破坏正常细胞增殖机制。用传统的生物化学方法、基因、药物学方法都不能分析。蛋白组学技术可以比较正常组织与癌组织的变化，这种肿瘤相关的变化可以为医疗干预提供新的标记和位点。Mrtin.J.Page等用蛋白组学技术分离和研究了乳腺癌相
关蛋白。对肿瘤抗原或与其相关抗体的分离和鉴定给肿瘤的早期诊断和治疗提供了一种新的方案。Franck M.Brichery等运用蛋白组学方法研究了肺癌组织中引起体液免疫应答的蛋白及自身抗体。他们所研究的肺癌病人中多于一半的人血清中有针对AnnexinI或/和II的IgG1和IgM自身抗体，AnnexinII自身抗体仅在肺癌病人血清中出现，而AnnexinI自身抗体也在其他类型病人血清中出现。这些研究有助于推动针对肿瘤中某种蛋白的自身抗体的发展【11】。Shugo Nawata等用2DE及免疫杂交法研究了鳞状细胞癌肿瘤组织抗原-1、抗原-2，发现了鳞状细胞癌抗原新的酸性蛋白，有助于开发一种检测此蛋白的系统，为鉴别诊断提供依据。
8、展望
目前有约60种微生物的全基因组序列已经测出, DNA序列信息仅提供了细胞运用其基因的所有可能方式的一种静态瞬间快照, 蛋白质组学则研究基因编码的活动怎样发生和什么时候发生(如蛋白翻译), 以及非基因编码的活动之间的关系(如蛋白质翻译后的修饰或蛋白质、核酸、脂类、糖类之的相互作用)【12】。因为实际蛋白数量反映了翻译的能力和效率、翻译后的修饰和每个蛋白的转化比率，蛋白质组学分析给基因表达最终产物的研究提供了信息。因此它是对翻译水平等研究的一种补充，是全面了解基因组表达必不可少的一种手段，它的发展将给分子生物学领域带来革命性变化。
【参考文献】1 李伯良 功能蛋白质组学 生命的化学，1998，18（6）：1~4 2 王志珍，邹承鲁 后基因组-蛋白质组研究 生物化学与生物物理学报，1998，30（6）：533～539
3 李林，吴家睿，李伯良 蛋白质组学的产生及其重要意义 生命科学，1999,11(2):49～50
4 李林 蛋白质组学的进展 生物化学与生物物理进展，2000，27（3）：227 5 Walter P., Blackstock , Weir MP. Proteomics: quantitative and physical mapping of cellular proteins. Tibtech, March , 1999 , 17:121-127. 6 Figeys D, McBroom LD,. Moran MF. Masss Spectry for the Study of Protein-Protein Interactions. Methods , 2001, 24: 230-239
7 何大澄 肖雪媛 差异蛋白质组学及其应用 北京师范大学学报，2002，8（38） 8 张红 张卉 张晓 蛋白质组学实验技术研究进展 四川解剖学杂志，2004，12
（8）：133
9 韩宾.李轶女.易咏竹.张志芳.沈桂芳差异蛋白质组学在家蚕中的研究进展[期刊论文]-生物技术通
报 2010(6)
10 Perrot M, Saglicocco F, Mini T, et al. Two-dimensional gel protein database of Saccharomyces cerevisiae(update 1999).
Electrophoresis,August;1999 ,20(11):2280-98.
11 Brichory FM,. MisekDE, Yim AM, et al. An immune response manifested by the common occurrence of annexins I and II autoantibodies and high circulating levels of IL-6 in lung cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Aug 14;98 (17):9824-9829.
12 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所诊断室 蛋白质组学的相关技术及应用