实验六 平板划线法分离菌种
一、实验目的
1、了解平板划线法分离菌种的基本原理
2、练习平板划线法分离菌种的基本操作，掌握无菌操作技术
二、实验原理
平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。
平板划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行菌种的分离纯化。
具体的划线形式有多种，这里仅介绍一种经过长期实践并证明可获得良好实验效果的方法：将一个平板分成A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区，B和C区为经初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌落收获区，它的面积最大，出现单菌落的概率也最高。由此可知，这4个区的面积安排应做到D>C>B>A。 鉴别培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。（参考GB4789.38-2012食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数） 其配方中含有乳糖、伊红和美蓝，用以鉴别肠道病原菌及其他杂菌。伊红、美蓝作为指示剂，伊红系酸性染料，当大肠埃希氏菌或产气肠杆菌分解乳糖产酸时，由于细菌带正电荷，所以被伊红着色。在大肠埃希氏菌中因为伊红与美蓝结合，所以菌落不呈红色，而是蓝紫黑色，且具有绿色金属光泽；菌落呈棕色者为产气肠杆菌；不分解乳糖的肠道病原菌则不着色，有时因产生碱性物质较多，细菌带负电荷，被美蓝着色后，菌落并不呈蓝色，因美蓝与伊红结合，所以菌落为淡紫色。
三、材料和器皿
1、菌种：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的混合培养斜面菌种。
2、培养基：伊红美蓝琼脂培养基。
3、器皿：无菌培养皿，水浴锅，接种环，培养箱等。
四、实验步骤
1、融化培养基
将装有伊红美蓝琼脂培养基的三角瓶放入热水浴中加热至沸，直至充分融化。
2、倒平板
待培养基冷却至50℃左右后，按无菌操作法倒平板(每皿约倒15ml)，平置，待凝。 操作方法：右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用右手手掌和小指将瓶塞轻轻地拨出，瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一条稍大于瓶口的缝隙，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
3、作分区标志（操作熟练后此步骤可省略）
在皿底用记号划分成4个不同面积的区域，使A
图1 平板分区、线条和划线操作示范示意图
4、划线操作
1)挑取菌样：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌试样。
2)先划A区：将平板倒置于酒精灯火焰旁，用左手取出平板的皿底，使平板表面大致垂直于桌面，并让平板面向火焰。右手持含菌的接种环，先在A区轻巧地划3~4条连续的平行线当作初步稀释的菌源。烧去接种环上的残余菌样。
3)划其余区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转至划线位置，把接种环通过A区(菌源区)而移至B区，随即在B区轻巧地划上6~7条致密的平行线，接
着再以同样的操作在C区和D区划上更多的平行线，并使D区的线条与A区平行(但不能与A区或B区的线条接触！)，最后，将左手所持皿底放回皿盖中。烧去接种环上的残菌。
5、恒温培养
将划线后的平板至37℃倒置培养2~3天。
6、挑单菌落
良好的结果应在C区出现部分单菌落，而在D区出现较多独立分布的单菌落。然后从典型的单菌落中挑取少量菌体至试管斜面，经培养后即为初步分离的纯种。
7、清洗培养皿
将废弃的带菌平板作煮沸杀菌后进行清洗、晾干。
五、注意事项
1、平板不能倒得太薄，最好在使用前一天倒好。为防止平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基温度不能太高。
2、用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些（2%左右），否则会因平板太软而被划破。
3、用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm），环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板。
4、为了取得良好的划线效果，可事先用圆纸垫在空培养皿内画上4区，并用接种环练习划线动作，待通过模拟试验熟练操作和掌握划线要领后，再正式进行平板划线。
六、思考题
1、用平板划线法进行纯种分离的原理是什么？有何优点？
2、要防止平板被划破应采取哪些措施？
3、为什么在划完A区后要将环上的残菌烧死？划后面几区时是否也要经过同样的处理？
实验六 平板划线法分离菌种
一、实验目的
1、了解平板划线法分离菌种的基本原理
2、练习平板划线法分离菌种的基本操作，掌握无菌操作技术
二、实验原理
平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。
平板划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行菌种的分离纯化。
具体的划线形式有多种，这里仅介绍一种经过长期实践并证明可获得良好实验效果的方法：将一个平板分成A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区，B和C区为经初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌落收获区，它的面积最大，出现单菌落的概率也最高。由此可知，这4个区的面积安排应做到D>C>B>A。 鉴别培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。（参考GB4789.38-2012食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数） 其配方中含有乳糖、伊红和美蓝，用以鉴别肠道病原菌及其他杂菌。伊红、美蓝作为指示剂，伊红系酸性染料，当大肠埃希氏菌或产气肠杆菌分解乳糖产酸时，由于细菌带正电荷，所以被伊红着色。在大肠埃希氏菌中因为伊红与美蓝结合，所以菌落不呈红色，而是蓝紫黑色，且具有绿色金属光泽；菌落呈棕色者为产气肠杆菌；不分解乳糖的肠道病原菌则不着色，有时因产生碱性物质较多，细菌带负电荷，被美蓝着色后，菌落并不呈蓝色，因美蓝与伊红结合，所以菌落为淡紫色。
三、材料和器皿
1、菌种：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的混合培养斜面菌种。
2、培养基：伊红美蓝琼脂培养基。
3、器皿：无菌培养皿，水浴锅，接种环，培养箱等。
四、实验步骤
1、融化培养基
将装有伊红美蓝琼脂培养基的三角瓶放入热水浴中加热至沸，直至充分融化。
2、倒平板
待培养基冷却至50℃左右后，按无菌操作法倒平板(每皿约倒15ml)，平置，待凝。 操作方法：右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用右手手掌和小指将瓶塞轻轻地拨出，瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一条稍大于瓶口的缝隙，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
3、作分区标志（操作熟练后此步骤可省略）
在皿底用记号划分成4个不同面积的区域，使A
图1 平板分区、线条和划线操作示范示意图
4、划线操作
1)挑取菌样：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌试样。
2)先划A区：将平板倒置于酒精灯火焰旁，用左手取出平板的皿底，使平板表面大致垂直于桌面，并让平板面向火焰。右手持含菌的接种环，先在A区轻巧地划3~4条连续的平行线当作初步稀释的菌源。烧去接种环上的残余菌样。
3)划其余区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转至划线位置，把接种环通过A区(菌源区)而移至B区，随即在B区轻巧地划上6~7条致密的平行线，接
着再以同样的操作在C区和D区划上更多的平行线，并使D区的线条与A区平行(但不能与A区或B区的线条接触！)，最后，将左手所持皿底放回皿盖中。烧去接种环上的残菌。
5、恒温培养
将划线后的平板至37℃倒置培养2~3天。
6、挑单菌落
良好的结果应在C区出现部分单菌落，而在D区出现较多独立分布的单菌落。然后从典型的单菌落中挑取少量菌体至试管斜面，经培养后即为初步分离的纯种。
7、清洗培养皿
将废弃的带菌平板作煮沸杀菌后进行清洗、晾干。
五、注意事项
1、平板不能倒得太薄，最好在使用前一天倒好。为防止平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基温度不能太高。
2、用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些（2%左右），否则会因平板太软而被划破。
3、用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm），环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板。
4、为了取得良好的划线效果，可事先用圆纸垫在空培养皿内画上4区，并用接种环练习划线动作，待通过模拟试验熟练操作和掌握划线要领后，再正式进行平板划线。
六、思考题
1、用平板划线法进行纯种分离的原理是什么？有何优点？
2、要防止平板被划破应采取哪些措施？
3、为什么在划完A区后要将环上的残菌烧死？划后面几区时是否也要经过同样的处理？