实验5 细胞的传代培养
一、实验目的
熟练掌握动物细胞的传代培养法。
二、实验原理
哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。
三、仪器、材料与试剂
1仪器
CO2培养箱，倒置显微镜，超净台
2材料
培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，细胞。
3试剂
完全培养基（RPMLl640或DMEM），0.25%胰蛋白酶，D-Hanks液。
四、实验步骤
1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。
2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。
3.超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。
4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气。
5.点燃酒精灯,取出无菌试管，刻度吸管；安上橡皮头；插在无菌试管内。
6.打开细胞培养瓶，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。
7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。
8.加入胰酶消化液，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液。
9.加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10mL/大瓶，3-5mL/小瓶）制成细胞悬液，分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。
10.对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。
五、注意事项
1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。培养用液应严格分开。
2.每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。
3.如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。
六、实验报告
1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤？
2.细胞传代培养的目的是什么？
实验5 细胞的传代培养
一、实验目的
熟练掌握动物细胞的传代培养法。
二、实验原理
哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。
三、仪器、材料与试剂
1仪器
CO2培养箱，倒置显微镜，超净台
2材料
培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，细胞。
3试剂
完全培养基（RPMLl640或DMEM），0.25%胰蛋白酶，D-Hanks液。
四、实验步骤
1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。
2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。
3.超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。
4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气。
5.点燃酒精灯,取出无菌试管，刻度吸管；安上橡皮头；插在无菌试管内。
6.打开细胞培养瓶，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。
7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。
8.加入胰酶消化液，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液。
9.加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10mL/大瓶，3-5mL/小瓶）制成细胞悬液，分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。
10.对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。
五、注意事项
1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。培养用液应严格分开。
2.每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。
3.如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。
六、实验报告
1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤？
2.细胞传代培养的目的是什么？