摘要 开展了金鱼人工雌核发育的胚胎发育过程研究，用紫外线灭活的鲤鱼精子激活金鱼卵子，采用热休克处理卵子使其染色体加倍，获得雌核发育的二倍体金鱼苗。将假受精的金鱼卵放入室温（21±2）℃室内塑料盒里孵化，10 min后卵膜吸水膨胀，60 min后开始卵裂，8 h后出现囊胚期，29 h后出现原肠胚期，39 h后出现神经胚期，56.8 h后器官开始形成，3 d后孵化出小苗，受精率为65.16%；平均孵化率为50.28%；诱导率15.80%，正品率为67.90%。 关键词 金鱼；人工雌核发育；鲤鱼；胚胎发育 中图分类号 Q593+.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）13-0291-02 金鱼起源于中国，是很受人们喜爱的观赏鱼。目前大部分金鱼品种主要是通过杂交以及长期人工选育得到的，但变异大、纯度差，不能满足观赏和生产的需要。雌核发育是特殊的有性生殖方式，属于“染色体组工程”范畴，原理是人工遗传上失活的精子进入未受精的成熟卵，引起卵细胞的发育，是一种快速有效的遗传改良方法[1]。因此，雌核发育在金鱼选育和新品种开发研究方面具有重大意义。金鱼与鲫鱼同属于鲤科[2-3]，属不同，亲缘关系较近。本次试验用鲤鱼的精子诱导金鱼人工雌核发育的方法对金鱼进行遗传改良。 1 材料与方法 1.1 试验材料 供试雌金鱼购自湖南柳吉现代农业科技有限公司；雄性鲤鱼来自湖南农业大学水产教学基地。 1.2 试验方法 1.2.1 人工催产。在繁殖季节，选取已经达到性成熟的雌金鱼和雄性鲤鱼注射HCG与LHRH-A1合剂进行催熟，约10 h采集精液。催产药物注射时间与量根据当时水温、亲本成熟度、方便操作等诸多因素来确定，鲤鱼注射1次，用量为金鱼亲本的1/2。 1.2.2 精子灭活。人工挤出鲤鱼精子，立刻加Hanks液，精子∶Hanks液=1∶4，然后充分摇匀，在培养皿上铺成1 mm左右的液层，放距紫外线20 cm处垫有冰板的摇床处理15 min左右，显微镜下定期检查精子活性。当90%精子失去活性时停止紫外线照射，收集失活精子，储存在冰块中备用。 1.2.3 雌核发育。受精：捞取发情金鱼亲本，挤出成熟卵粒，快速加入失活精子，用消毒的干鸡毛搅拌，进行人工干法假授精。热休克：用21 ℃水尽量冲散卵粒，均匀粘附在直径20 cm的玻璃培养皿内，恒温5 min，然后逐步进入40 ℃水体，放置3min，再逐步回到21 ℃，放置3 min，其后放置室内孵化。胚胎发育观察：孵化水温和室内维持在（21±2）℃，孵化用水充分曝气，每隔2 h换水1次，定期剔除死卵，定期用显微镜观察与摄像记录胚胎发育过程，并统计受精、孵化等情况。 2 结果与分析 当水温为21 ℃时，受精卵经过60 min开始细胞分裂，18 h 48 min进入原肠期，29 h 40 min后进入神经胚期，40 h 40 min后进入眼基期，45 h 30 min进入眼囊期，49 h 10 min进入肌肉效应期，55 h 23 min进入心脏原期。 2.1 胚胎发育过程 2.1.1 卵裂。卵受精后，卵膜吸水膨胀开始出现第1次分裂，卵裂速度较快，2 h内完成16细胞期分裂，胚盘开始形成多层，卵裂球越来越小，规则地排列在配盘表面，逐渐向胚盘外表推移，并集中在胚盘处形成较为明显的隆起，4 h后形成多细胞期（图1a～d）。 2.1.2 囊胚期。受精6 h后，胚胎细胞界限开始模糊不清，胚盘在卵黄上呈高峰状，出现早期囊胚，进入高囊胚期（图1e）；9.8 h后，细胞界限消失，囊胚细胞开始向下方扩展，面积不断扩大，囊胚降低，囊胚细胞逐步平展于卵黄膜上，胚盘为弓形，形成低囊期（图1f）。 2.1.3 原肠胚期。受精18.67h后，胚层进一步向植物极扩张，约占整个胚胎的1/3（图1g）；受精20.17 h后，胚盘下包卵黄1/2（图1h），由于细胞的集中和内卷后造成一环带形的胚胎和一新月形的缺口，这就是背唇，也即原肠期形成的开始。21.33 h后，胚盘下包3/5，背唇处又内卷及增生的细胞向中央伸展集中形成球胚盾，前段头部隆起明显，形成原肠晚期胚胎（图1i）。原肠期统计受精率为56.54%。 2.1.4 神经胚期。受精39 h后，胚层细胞继续下包4/5，受精35 h后，囊胚层完全包围卵黄，胚孔闭合，胚体形成，呈弧形，胚盾中线形成神经索，脑部逐渐膨大，出现2个收缩部分，脑分为前、中、后3个部分，胚体上神经沟两侧可见5～6对短柱状体节，达到胚孔封闭期（图1k）。 2.1.5 器官形成期。受精45 h后，胚体前方两侧出现椭圆形突起的眼泡原基，出现体节，并随着时间的推迟，体节越来越明显，受精52 h后出现眼点，配体后部肌肉可以轻微扭动，可见神经索。受精60 h后，个别胚体心脏开始微弱跳动。 2.1.6 孵化期。受精75～90 h后，胚体活动明显减弱，然后胚体尾部出现剧烈扭动，甚至翻滚整个胚体，借助尾部摆动的力量冲破卵膜，从卵膜破裂到胚体完全脱落需要8～10 h。刚脱膜而出的鱼苗，腹部带有一椭圆形卵黄膜，2～3 d后消失，鱼苗能平游。 2.2 胚胎发育成活情况 对雌核发育的金鱼胚胎发育到囊胚期的成活率、孵化率以及正常鱼苗的比率进行统计，结果见表1。平均受精率为65.16%；平均孵化率为50.28%；诱导率15.80%，正品率为67.90%。 3 讨论 3.1 鲤鱼精子作为诱导源的可行性 热休克是一种常用的染色体加倍处理方法，用于雌核发育研究的不多，并且不同鱼类和不同染色体加倍处理阶段，热休克起始时间、所需强度、温度等均有所不同，孵化率和成活率较低[4-5]。本研究表明，遗传失活的鲤鱼精子能有效启动金鱼雌核发育，采用热休克处理染色体加倍，较其他学者研究结果来看，可能达到较高的受精率和孵化率，表明此方法进行金鱼雌核发育是有效可行的。 3.2 雌核发育技术在金鱼选种中的优势 雌核发育主要是通过人工染色体加倍处理，使雌核单体发育成为有正常生活力的个体[6]。染色体加倍可在不同发育阶段处理进行，受精受阻后阻止卵子的第2次成熟分裂，或卵子的第1次有丝分裂而使染色体加倍，不同染色体加倍处理，雌核发育后代基因纯度不同，实践中多采用第1次有丝分裂过程中染色体加倍处理[7]。 试验过程中，胚胎发育时间同其他学者研究上有所差异，笔者认为可能是以下原因：一是孵化水温和室温差异，导致胚胎发育速度有所改变。胚胎在培养皿发育过程，水温易受到环境影响，故孵化水温较难控制。二是雌核胚胎发育多放在室内进行，环境光照对其影响较大。三是不同品种鱼类，其胚胎发育时间会有所差异。 鲤鱼属鲤科，鲤亚科，鲤属，染色体数目2N=100，金鱼染色数目为2N=100，两者关系较近，外部形态较大，理论上早杂交个体不存活。在该研究中，用未曾遗传失活的鲤鱼精子与金鱼人工授精，有杂交个体产生，体色黑，外部形态与鲤鱼相似，其杂交出现成活个体的机理仍有待进一步研究。 4 参考文献 [1] 常华，翟建军，李冰冰.金鱼人工雌核发育的研究[J].水产科技情报，2010，37（1）：1-4. [2] 陈桢.金鱼的家化史与品种形成因素[J].动物学报，1954，6（2）：89-116. [3] 吴清江，陈容德，叶玉珍，等.鲤鱼人工雌核发育作为建立近交系新途径的研究[J].遗传学报，1981，8（1）：50-55. [4] 林莲英，宗琴仙，李永强.人工诱导雌核发育金鱼的研究[J].水产科技情报，1993，20（1）：15-19. [5] PANDIAN T J.Kotceswaran R.Ploidy induction and sex control in fish[J].Hydrobiologia，1998（384）：167-243. [6] 桂建芳，孙建明，梁绍昌，等.鱼类染色体组操作的研究Ⅱ.静水压处理和静水压与冷休克结合处理诱导水晶彩鲫四倍体[J].水生生物学报，1991，5（4）：333-342. [7] 邹曙明，李思发，蔡完其，等.团头鲂良种雌核发育群体的建立及其遗传变异[J].水产学报，2001，25（4）：311-316.
摘要 开展了金鱼人工雌核发育的胚胎发育过程研究，用紫外线灭活的鲤鱼精子激活金鱼卵子，采用热休克处理卵子使其染色体加倍，获得雌核发育的二倍体金鱼苗。将假受精的金鱼卵放入室温（21±2）℃室内塑料盒里孵化，10 min后卵膜吸水膨胀，60 min后开始卵裂，8 h后出现囊胚期，29 h后出现原肠胚期，39 h后出现神经胚期，56.8 h后器官开始形成，3 d后孵化出小苗，受精率为65.16%；平均孵化率为50.28%；诱导率15.80%，正品率为67.90%。 关键词 金鱼；人工雌核发育；鲤鱼；胚胎发育 中图分类号 Q593+.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）13-0291-02 金鱼起源于中国，是很受人们喜爱的观赏鱼。目前大部分金鱼品种主要是通过杂交以及长期人工选育得到的，但变异大、纯度差，不能满足观赏和生产的需要。雌核发育是特殊的有性生殖方式，属于“染色体组工程”范畴，原理是人工遗传上失活的精子进入未受精的成熟卵，引起卵细胞的发育，是一种快速有效的遗传改良方法[1]。因此，雌核发育在金鱼选育和新品种开发研究方面具有重大意义。金鱼与鲫鱼同属于鲤科[2-3]，属不同，亲缘关系较近。本次试验用鲤鱼的精子诱导金鱼人工雌核发育的方法对金鱼进行遗传改良。 1 材料与方法 1.1 试验材料 供试雌金鱼购自湖南柳吉现代农业科技有限公司；雄性鲤鱼来自湖南农业大学水产教学基地。 1.2 试验方法 1.2.1 人工催产。在繁殖季节，选取已经达到性成熟的雌金鱼和雄性鲤鱼注射HCG与LHRH-A1合剂进行催熟，约10 h采集精液。催产药物注射时间与量根据当时水温、亲本成熟度、方便操作等诸多因素来确定，鲤鱼注射1次，用量为金鱼亲本的1/2。 1.2.2 精子灭活。人工挤出鲤鱼精子，立刻加Hanks液，精子∶Hanks液=1∶4，然后充分摇匀，在培养皿上铺成1 mm左右的液层，放距紫外线20 cm处垫有冰板的摇床处理15 min左右，显微镜下定期检查精子活性。当90%精子失去活性时停止紫外线照射，收集失活精子，储存在冰块中备用。 1.2.3 雌核发育。受精：捞取发情金鱼亲本，挤出成熟卵粒，快速加入失活精子，用消毒的干鸡毛搅拌，进行人工干法假授精。热休克：用21 ℃水尽量冲散卵粒，均匀粘附在直径20 cm的玻璃培养皿内，恒温5 min，然后逐步进入40 ℃水体，放置3min，再逐步回到21 ℃，放置3 min，其后放置室内孵化。胚胎发育观察：孵化水温和室内维持在（21±2）℃，孵化用水充分曝气，每隔2 h换水1次，定期剔除死卵，定期用显微镜观察与摄像记录胚胎发育过程，并统计受精、孵化等情况。 2 结果与分析 当水温为21 ℃时，受精卵经过60 min开始细胞分裂，18 h 48 min进入原肠期，29 h 40 min后进入神经胚期，40 h 40 min后进入眼基期，45 h 30 min进入眼囊期，49 h 10 min进入肌肉效应期，55 h 23 min进入心脏原期。 2.1 胚胎发育过程 2.1.1 卵裂。卵受精后，卵膜吸水膨胀开始出现第1次分裂，卵裂速度较快，2 h内完成16细胞期分裂，胚盘开始形成多层，卵裂球越来越小，规则地排列在配盘表面，逐渐向胚盘外表推移，并集中在胚盘处形成较为明显的隆起，4 h后形成多细胞期（图1a～d）。 2.1.2 囊胚期。受精6 h后，胚胎细胞界限开始模糊不清，胚盘在卵黄上呈高峰状，出现早期囊胚，进入高囊胚期（图1e）；9.8 h后，细胞界限消失，囊胚细胞开始向下方扩展，面积不断扩大，囊胚降低，囊胚细胞逐步平展于卵黄膜上，胚盘为弓形，形成低囊期（图1f）。 2.1.3 原肠胚期。受精18.67h后，胚层进一步向植物极扩张，约占整个胚胎的1/3（图1g）；受精20.17 h后，胚盘下包卵黄1/2（图1h），由于细胞的集中和内卷后造成一环带形的胚胎和一新月形的缺口，这就是背唇，也即原肠期形成的开始。21.33 h后，胚盘下包3/5，背唇处又内卷及增生的细胞向中央伸展集中形成球胚盾，前段头部隆起明显，形成原肠晚期胚胎（图1i）。原肠期统计受精率为56.54%。 2.1.4 神经胚期。受精39 h后，胚层细胞继续下包4/5，受精35 h后，囊胚层完全包围卵黄，胚孔闭合，胚体形成，呈弧形，胚盾中线形成神经索，脑部逐渐膨大，出现2个收缩部分，脑分为前、中、后3个部分，胚体上神经沟两侧可见5～6对短柱状体节，达到胚孔封闭期（图1k）。 2.1.5 器官形成期。受精45 h后，胚体前方两侧出现椭圆形突起的眼泡原基，出现体节，并随着时间的推迟，体节越来越明显，受精52 h后出现眼点，配体后部肌肉可以轻微扭动，可见神经索。受精60 h后，个别胚体心脏开始微弱跳动。 2.1.6 孵化期。受精75～90 h后，胚体活动明显减弱，然后胚体尾部出现剧烈扭动，甚至翻滚整个胚体，借助尾部摆动的力量冲破卵膜，从卵膜破裂到胚体完全脱落需要8～10 h。刚脱膜而出的鱼苗，腹部带有一椭圆形卵黄膜，2～3 d后消失，鱼苗能平游。 2.2 胚胎发育成活情况 对雌核发育的金鱼胚胎发育到囊胚期的成活率、孵化率以及正常鱼苗的比率进行统计，结果见表1。平均受精率为65.16%；平均孵化率为50.28%；诱导率15.80%，正品率为67.90%。 3 讨论 3.1 鲤鱼精子作为诱导源的可行性 热休克是一种常用的染色体加倍处理方法，用于雌核发育研究的不多，并且不同鱼类和不同染色体加倍处理阶段，热休克起始时间、所需强度、温度等均有所不同，孵化率和成活率较低[4-5]。本研究表明，遗传失活的鲤鱼精子能有效启动金鱼雌核发育，采用热休克处理染色体加倍，较其他学者研究结果来看，可能达到较高的受精率和孵化率，表明此方法进行金鱼雌核发育是有效可行的。 3.2 雌核发育技术在金鱼选种中的优势 雌核发育主要是通过人工染色体加倍处理，使雌核单体发育成为有正常生活力的个体[6]。染色体加倍可在不同发育阶段处理进行，受精受阻后阻止卵子的第2次成熟分裂，或卵子的第1次有丝分裂而使染色体加倍，不同染色体加倍处理，雌核发育后代基因纯度不同，实践中多采用第1次有丝分裂过程中染色体加倍处理[7]。 试验过程中，胚胎发育时间同其他学者研究上有所差异，笔者认为可能是以下原因：一是孵化水温和室温差异，导致胚胎发育速度有所改变。胚胎在培养皿发育过程，水温易受到环境影响，故孵化水温较难控制。二是雌核胚胎发育多放在室内进行，环境光照对其影响较大。三是不同品种鱼类，其胚胎发育时间会有所差异。 鲤鱼属鲤科，鲤亚科，鲤属，染色体数目2N=100，金鱼染色数目为2N=100，两者关系较近，外部形态较大，理论上早杂交个体不存活。在该研究中，用未曾遗传失活的鲤鱼精子与金鱼人工授精，有杂交个体产生，体色黑，外部形态与鲤鱼相似，其杂交出现成活个体的机理仍有待进一步研究。 4 参考文献 [1] 常华，翟建军，李冰冰.金鱼人工雌核发育的研究[J].水产科技情报，2010，37（1）：1-4. [2] 陈桢.金鱼的家化史与品种形成因素[J].动物学报，1954，6（2）：89-116. [3] 吴清江，陈容德，叶玉珍，等.鲤鱼人工雌核发育作为建立近交系新途径的研究[J].遗传学报，1981，8（1）：50-55. [4] 林莲英，宗琴仙，李永强.人工诱导雌核发育金鱼的研究[J].水产科技情报，1993，20（1）：15-19. [5] PANDIAN T J.Kotceswaran R.Ploidy induction and sex control in fish[J].Hydrobiologia，1998（384）：167-243. [6] 桂建芳，孙建明，梁绍昌，等.鱼类染色体组操作的研究Ⅱ.静水压处理和静水压与冷休克结合处理诱导水晶彩鲫四倍体[J].水生生物学报，1991，5（4）：333-342. [7] 邹曙明，李思发，蔡完其，等.团头鲂良种雌核发育群体的建立及其遗传变异[J].水产学报，2001，25（4）：311-316.