第七部分 环境卫生学和物品器械消毒效果监测技术
一、科室空气消毒效果监测
（一）普通科室空气消毒效果监测
1、采样时间：消毒处理后医疗操作活动前。
2、采样方法（平板暴露法）：
（1）布点方法：室内面积小于等于30平方米 ，设内、中、外对角线三点，内外采样点均离墙壁1m ；室内面积大于30平方米 ,设四角和中央共五点，四角的四个采样点均离墙壁1m 。
（2）采样高度：距地面80-150cm 。
（3）采样方法（平板暴露法）：把装有普通营养琼脂培养基的平板（直径为9cm ）无菌操作放在各采样点，平板盖打开扣放于平板旁，暴露5min ，将盖子盖好，立即送至检验科细菌室。
（三）、检验方法
1、样品处理：将采有空气的培养皿放入37℃培养箱培养24—48h ，取出计算细菌总数并分离致病菌；
2、计算：cfu/m3=50000×N/A×T
N ：平均菌落数 ； A：平板面积（直径9cm ）；T ：采样时间（5min ）
3、报告：报告细菌总数（cfu/m3）和是否检出致病菌及致病菌菌种（金黄色葡萄球菌、β- 溶血性链球菌等）。
（四）、注意事项：
（1）、培养基的罢放：采样时培养皿底部在下，平时在上；
（2）、采样前在培养皿底部（背面）标明科室、房间名称和采样点编号（每个培养皿都要标明）；
（3）、整个操作必须严格遵守无菌技术操作规程，门窗关闭，动作轻柔，培养皿摆好后轻轻走出房间并关好门；
（4）、注意记时5min ；不准提前或延长；
（5）、培养基必须充分暴露于空气中。
（二）洁净手术室空气消毒效果监测
百级：布点：局部百级区5点（双对角线布点）、Ⅰ级周边区8点（每边2点） 第一手术间（13个平皿） 第二手术间（13个平皿） 千级：布点：Ⅱ级周边区6点（长边内2点，短边内1点）
第三手术间（6个平皿） 第四手术间（6个平皿） 万级：布点：Ⅲ（10万级）级周边区4点（每边内1点）
第五手术间（4个平皿） 第六手术间（4个平皿） 第七手术间（4个平皿） 第八手术间（4个平皿） 第九手术间（4个平皿） 第十手术间（4个平皿）
布点；Ⅳ（30万级）级周边区，面积＞30m 2，布4点（每边 内1点）；面积≤30m 2，布2点，均避开送风口正下方。
注意事项：
1、测点布置在距地面0.8m 的平面上，在手术区检测时应无手术台；当手术台已固定，测点高度在台面之上0.25m 。
2、在100级检测时，采样口应对着气流方向，在其他级别区域检测时，采样口均向上。
3、检测人员不得多于2人，都应该穿洁净工作服，处于测点下风向的位置，尽量少动作。
4、采样时间为30min 。
5、结果判定：
Ⅰ级洁净手术室≤10cfu/m3(特别洁净手术室) 用于关节置换、器官移植手术。
Ⅱ级洁净手术室≤25cfu/m3(标准洁净手术室) 用于胸外科、整形外科手
术。
Ⅲ级洁净手术室≤150cfu/m3(一般洁净手术室) 普通外科、妇产手术。 Ⅳ级洁净手术室≤175cfu/m3(准洁净手术室）肛肠手术。
二、物品和物体表面消毒效果监测
（一）、采样方法
1、采样时间：消毒处理后医疗操作前。
2、采样面积：被采表面小于100cm 2时，取全部表面；被采表面大于等于100cm 2时，取100 cm2。
3、采样方法：将5cm×5cm 灭菌规格板放在被检物体表面，用浸有含相应中和剂的无菌洗脱液（中和剂＋洗脱液）的棉试子一只，在规格板内横竖往返均匀涂擦各5次，并随之转动棉试子，剪去手接触部位，将棉试子放入装有10 ml 含相应中和剂的无菌洗脱液（中和剂＋洗脱液）的试管内，在试管上标明科室、检品所在房间和物品或物体表面的名称及采样面积，立即送至检验科细菌室。若采样面积大于等于100cm 2, 应连续采样四个点（即采样100cm 2）。
（二）检验方法
1、细菌总数检测〔cfu/cm2〕：
将试管内的棉试子用力振打80次, 无菌操作吸取1ml 接种于灭菌平皿内，加入溶化冷至45—48℃的营养琼脂15—18ml ，边倒入边摇匀，待凝固后放入37℃培养箱培养48h ，计数菌落数〔cfu/cm2〕。
计算：cfu/cm2=平板上菌落数 × 稀释倍数/采样面积（cm 2），不规则物品或物体表面报告单位为cfu /件。
2、致病菌检测
（1）检测原则：致病菌的检测依据污染情况进行相应指标的检测。
（2）金黄色葡萄球菌检测
取采样液 1ml，接种于 5ml SCDLP 液体培养基中→36℃±1℃增菌 24h→取 1 白金耳环上述增菌液，在血平板上作划线分离→36℃±1℃培养 24h→观察菌落特征→鉴定→报告。
（2）乙型溶血性链球菌检测
取样品 1ml，接种于1％葡萄糖肉汤→37℃增菌 24h→取 1 白金耳环增菌液在血平板上作划线分离→36℃±1℃培养 24h→观察菌落→鉴定→报告。
（3）沙门氏菌属、志贺氏菌属、非发酵菌群等致病菌的检测参照相关检测方法。
3、报告：报告细菌总数（cfu/cm2）和是否检出致病菌及致病菌菌种（金黄色葡萄球菌、β- 溶血性链球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、非发酵菌群等）。
（三）、注意事项
1、严格遵守无菌技术操作规程。
2、门把手等不规则的物体表面用浸有含相应中和剂的无菌洗脱液的棉试子直接涂擦采样。
三、手和皮肤黏膜消毒效果监测
（一）采样方法
1、采样时间:在消毒后立即采样。
2、手的采样:被检人五指并拢，用浸有含相应中和剂的无菌洗脱液（中和剂＋洗脱液）的棉拭子在双手指屈面从指根到指端往返涂擦 2 次（一只手涂擦面积约 30cm2），并随之转动采样棉拭子，剪去操作者手接触部位，将棉拭子投入 10ml 含相应中和剂的无菌洗脱液（中和剂＋洗脱液）试管内，在试管外壁标明科别、姓名，立即送检。
3、皮肤粘膜采样:用 5cm×5cm 的标准灭菌规格板，放在被检皮肤处，用浸有含相应中和剂的无菌洗脱液（中和剂＋洗脱液）的棉拭子 1 支，在规格板内横竖往返均匀涂擦各 5 次，并随之转动棉拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子投入 10ml 含相应中和剂的无菌洗脱液（中和剂＋洗脱液）的试管内，在试管外
壁标明科别、姓名、采样部位、采样面积，立即送检。
4、不规则的粘膜皮肤处可用有含相应中和剂的无菌洗脱液（中和剂＋洗脱液）棉拭子直接涂擦5 次，并随之转动棉拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子投入 10ml 含相应中和剂的无菌洗脱液（中和剂＋洗脱液）的试管内，在试管外壁标明科别、姓名、采样部部位，立即送检。
（二）检测方法
1、细菌总数检测
将采样管在混匀器上振荡20s 或用力振打 80 次，用无菌吸管吸取 1.0ml 待检样品接种于灭菌平皿，每一样本接种2个平皿，内加入已溶化的 45℃～48℃ 的营养琼脂 15ml～18ml ，边倾注边摇匀，待琼脂凝固，置 36℃±1℃温箱培养 48h，计数菌落数。
计算：细菌总数（cfu/cm2）＝平板上菌落数 × 稀释倍数/采样面积 不规则粘膜皮肤报告单位为细菌总数（cfu/件）
2、 致病菌检测
按照物品和物体表面消毒效果监测中的致病菌检测方法操作。
3、报告
报告细菌总数〔cfu/cm2〕和是否检出致病菌〔金黄色葡萄球菌、β—溶血性链球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属等〕。若检出致病菌，需报告菌种。
（三）注意事项
1、严格遵守无菌技术操作规程。
2、两只手采样面积约60cm 2 。
四、使用中的消毒剂和灭菌剂细菌污染监测
（一）采样方法
把被检样品充分混匀，用无菌吸管吸取消毒液 1.0ml，加入到 9.0ml 含相应中和剂的无菌生理盐水采样管中混匀，在试管上标明科别、样品所在室、样
品名科（含浓度）、用途，立即送检。
报告细菌总数（cfu/ml）和是否检出致病菌〔金黄色葡萄球菌、β—溶血性链球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属等〕。若检出致病菌，需报告菌种。
（二）检测方法
1、细菌总数检测
（1）、涂抹法：把待检样品充分混匀，用无菌吸管吸取上述溶液 0.2ml，滴于干燥普通琼脂平板，每份样品同时做2个平行样，一平板置 20℃ 培养 7d，观察霉菌生长情况，另一个平板置35℃温箱培养 72h记数菌落数。
（2）倾注法：把待检样品充分混匀，用无菌吸管吸取消毒液 1.0ml，加入到 9.0ml 含相应中和剂的无菌生理盐水采样管中混匀，分别取 0.5ml 放入 2 只灭菌平皿内，加入已熔化的 45℃～48℃ 的营养琼脂 15ml～18ml ，边倾注边摇匀，待琼脂凝固，一平板置 20℃培养 7d，观察霉菌生长情况; 另一个平板置36℃±1℃培养 72h，计数菌落数。
计算：倾注法 消毒灭菌剂染菌量(cfu/ml)＝每个平板上的菌落数 × 20 涂沫法 消毒灭菌剂染菌量(cfu/ml)＝每个平板上的菌落数 × 50
2、致病菌检测
按照物品和物体表面消毒效果监测中的致病菌检测方法操作。
3、报告
报告细菌总数（cfu/ml）和是否检出致病菌〔金黄色葡萄球菌、β- 溶血性链球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属等〕。若检出致病菌，需报告菌种。
（三）注意事项
严格遵守无菌技术操作规程。
五、内镜消毒灭菌效果的监测
（一）采样方法
1、采样时间：在消毒灭菌后、使用前进行采样。
2、采样方法：
（1）有内腔的内镜：用无菌注射器抽取10ml 含相应中和剂的缓冲液，从待检内镜活检口注入，用15ml 无菌试管从活检出口收集，标明科别、样品所在室、样品名称，立即送检。
（2）无内腔的内镜：用沾有含相应中和剂的缓冲液的棉拭子，在被检内镜上从镜头至镜身反复涂擦，剪去手接触部位，将棉拭子投入到 5ml 含相应中和剂的生理盐水采样管中，标明科别、样品所在室、样品名称，立即送检。
（二）检测方法
（1）细菌总数：将送检液用旋涡器充分震荡，取0.5ml ，加入2只直径90mm 无菌平皿，每个平皿分别加入已经熔化的45℃-48℃营养琼脂15ml-18ml ，边倾注边摇匀，待琼脂凝固，于35℃培养48小时后计数。
计算：细菌总数/镜=2个平皿菌落数平均值×20
（2）致病菌检测：将送检液用旋涡器充分震荡，取0.2ml 分别接种90mm 血平皿、中国兰平皿和SS 平皿，均匀涂布，35℃培养48小时，观察有无致病菌生长。
（三）报告
报告细菌总数（cfu/镜）和是否检出致病菌〔金黄色葡萄球菌、β- 溶血性链球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属等〕。若检出致病菌，需报告菌种。
（四）注意事项
严格遵守无菌技术操作规程。
六、医疗器械灭菌效果的监测—无菌检验
无菌检验是指检查经灭菌的敷料、缝线、一次性使用的医疗用品、无菌器械以及适合于无菌检查的其它品种是否无菌的一种方法。
无菌检验应在洁净度为100级单向流空气区域内进行，应严格遵守无菌操作，避免微生物污染；对单向流空气区域及工作台面，必须进行洁净度验证。
（一）无菌检验前准备
1、洗脱液与培养基无菌性试验:无菌试验前 3d，于需-厌养培养基与霉菌培养基内各接种 1ml 洗脱液，分别置 30℃～35℃与 20℃～25℃培养 72h，应无菌生长。
2、阳性对照管菌液制备:
（1）在试验前一天取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的普通琼脂斜面新鲜培养物，接种1环至需-厌氧培养基内，在 30℃～35℃培养 16h～18h 后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10 cfu/ml～100cfu/ml;
（2）取生孢梭菌[CMCC(B)64941]的需氧菌、厌氧菌培养基新鲜培养物1接种环种于相同培养基内，于30℃～35℃培养 18h～24h 后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10 cfu/ml～100cfu/ml;
（3）取白色念珠菌[CMCC（F ）98001]真菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1接种环种于相同培养基内，于20℃～25℃培养 24h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10cfu/ml～100cfu/ml。
（二）无菌操作:
1、缝合针、针头、刀片等小件医疗器械：分别取5件被检样品直接浸入6管需-厌氧培养管(其中一管作阳性对照) 与 4 管霉菌培养管。培养基用量为 15ml/管。标明科别、样品所在室、样品名称和灭菌日期及灭菌方法。
2、注射器、输液器、输液袋：取5付被检样品分别在5ml 洗脱液中反复抽吸5 次，洗下管内细菌，混和后接种需-厌养菌培养管(共 6 管，其中 1 管作阳性对照) 与霉菌培养管(共 4 管) 。 接种量：1ml 注射器为 0.5ml，2ml 注射器为 1ml ，5ml ～10ml 注射器为 2ml，20ml ～50ml 注射器为 5ml，培养基用量：接种量为 2ml 以下为 15ml/管，接种量5ml 为 40ml/管。标明科别、样品所在室、样品名称和灭菌日期及灭菌方法。
3、手术钳、镊子等大件医疗器械：取2件被检样品分别用沾有无菌洗脱液的棉
拭子分别反复涂抹采样，将棉拭子投入 5ml 无菌洗脱液中，将采样液混匀，接种于需-厌氧培养管(共 6 管，其中 1 管作阳性对照) 与霉菌培养基(共 4 管) 。接种量为 1ml/管，培养基用量为 15ml/管。标明科别、样品所在室、样品名称和灭菌日期及灭菌方法。
（三）培养：在待检样品的需-厌氧培养管中，接种预先准备的金黄色葡萄球菌阳性对照管液 1:1000 稀释 1ml，将需-厌氧培养管以及阳性与阴性对照管均于 30℃～35℃培养 5d，霉菌培养管与阴性对照管于 20℃～25℃培养 7d，培养期间逐日检查是否有菌生长，如加入供试品后培养基出现混浊或沉淀，经培养后不能从外观上判断时，可取培养液转种入另一支相同的培养基中或斜面培养基上，培养 48h～72h 后，观察是否再现混浊或在斜面上有无菌落生长，并在转种的同时，取培养液少量，涂片染色，用显微镜观察是否有菌生长。
（四）结果判定：阳性对照在 24h 内应有菌生长，阴性对照在培养期间应无菌生长，如需-厌氧菌及霉菌培养管内均为澄清或虽显混浊但经证明并非有菌生长，判为灭菌合格；如需-厌氧菌及霉菌培养管中任何1管显混浊并证实有菌生长，应重新取样，分别同法复试 2 次，除阳性对照外，其他各管均不得有菌生长，否则判为灭菌不合格。
第七部分 环境卫生学和物品器械消毒效果监测技术
一、科室空气消毒效果监测
（一）普通科室空气消毒效果监测
1、采样时间：消毒处理后医疗操作活动前。
2、采样方法（平板暴露法）：
（1）布点方法：室内面积小于等于30平方米 ，设内、中、外对角线三点，内外采样点均离墙壁1m ；室内面积大于30平方米 ,设四角和中央共五点，四角的四个采样点均离墙壁1m 。
（2）采样高度：距地面80-150cm 。
（3）采样方法（平板暴露法）：把装有普通营养琼脂培养基的平板（直径为9cm ）无菌操作放在各采样点，平板盖打开扣放于平板旁，暴露5min ，将盖子盖好，立即送至检验科细菌室。
（三）、检验方法
1、样品处理：将采有空气的培养皿放入37℃培养箱培养24—48h ，取出计算细菌总数并分离致病菌；
2、计算：cfu/m3=50000×N/A×T
N ：平均菌落数 ； A：平板面积（直径9cm ）；T ：采样时间（5min ）
3、报告：报告细菌总数（cfu/m3）和是否检出致病菌及致病菌菌种（金黄色葡萄球菌、β- 溶血性链球菌等）。
（四）、注意事项：
（1）、培养基的罢放：采样时培养皿底部在下，平时在上；
（2）、采样前在培养皿底部（背面）标明科室、房间名称和采样点编号（每个培养皿都要标明）；
（3）、整个操作必须严格遵守无菌技术操作规程，门窗关闭，动作轻柔，培养皿摆好后轻轻走出房间并关好门；
（4）、注意记时5min ；不准提前或延长；
（5）、培养基必须充分暴露于空气中。
（二）洁净手术室空气消毒效果监测
百级：布点：局部百级区5点（双对角线布点）、Ⅰ级周边区8点（每边2点） 第一手术间（13个平皿） 第二手术间（13个平皿） 千级：布点：Ⅱ级周边区6点（长边内2点，短边内1点）
第三手术间（6个平皿） 第四手术间（6个平皿） 万级：布点：Ⅲ（10万级）级周边区4点（每边内1点）
第五手术间（4个平皿） 第六手术间（4个平皿） 第七手术间（4个平皿） 第八手术间（4个平皿） 第九手术间（4个平皿） 第十手术间（4个平皿）
布点；Ⅳ（30万级）级周边区，面积＞30m 2，布4点（每边 内1点）；面积≤30m 2，布2点，均避开送风口正下方。
注意事项：
1、测点布置在距地面0.8m 的平面上，在手术区检测时应无手术台；当手术台已固定，测点高度在台面之上0.25m 。
2、在100级检测时，采样口应对着气流方向，在其他级别区域检测时，采样口均向上。
3、检测人员不得多于2人，都应该穿洁净工作服，处于测点下风向的位置，尽量少动作。
4、采样时间为30min 。
5、结果判定：
Ⅰ级洁净手术室≤10cfu/m3(特别洁净手术室) 用于关节置换、器官移植手术。
Ⅱ级洁净手术室≤25cfu/m3(标准洁净手术室) 用于胸外科、整形外科手
术。
Ⅲ级洁净手术室≤150cfu/m3(一般洁净手术室) 普通外科、妇产手术。 Ⅳ级洁净手术室≤175cfu/m3(准洁净手术室）肛肠手术。
二、物品和物体表面消毒效果监测
（一）、采样方法
1、采样时间：消毒处理后医疗操作前。
2、采样面积：被采表面小于100cm 2时，取全部表面；被采表面大于等于100cm 2时，取100 cm2。
3、采样方法：将5cm×5cm 灭菌规格板放在被检物体表面，用浸有含相应中和剂的无菌洗脱液（中和剂＋洗脱液）的棉试子一只，在规格板内横竖往返均匀涂擦各5次，并随之转动棉试子，剪去手接触部位，将棉试子放入装有10 ml 含相应中和剂的无菌洗脱液（中和剂＋洗脱液）的试管内，在试管上标明科室、检品所在房间和物品或物体表面的名称及采样面积，立即送至检验科细菌室。若采样面积大于等于100cm 2, 应连续采样四个点（即采样100cm 2）。
（二）检验方法
1、细菌总数检测〔cfu/cm2〕：
将试管内的棉试子用力振打80次, 无菌操作吸取1ml 接种于灭菌平皿内，加入溶化冷至45—48℃的营养琼脂15—18ml ，边倒入边摇匀，待凝固后放入37℃培养箱培养48h ，计数菌落数〔cfu/cm2〕。
计算：cfu/cm2=平板上菌落数 × 稀释倍数/采样面积（cm 2），不规则物品或物体表面报告单位为cfu /件。
2、致病菌检测
（1）检测原则：致病菌的检测依据污染情况进行相应指标的检测。
（2）金黄色葡萄球菌检测
取采样液 1ml，接种于 5ml SCDLP 液体培养基中→36℃±1℃增菌 24h→取 1 白金耳环上述增菌液，在血平板上作划线分离→36℃±1℃培养 24h→观察菌落特征→鉴定→报告。
（2）乙型溶血性链球菌检测
取样品 1ml，接种于1％葡萄糖肉汤→37℃增菌 24h→取 1 白金耳环增菌液在血平板上作划线分离→36℃±1℃培养 24h→观察菌落→鉴定→报告。
（3）沙门氏菌属、志贺氏菌属、非发酵菌群等致病菌的检测参照相关检测方法。
3、报告：报告细菌总数（cfu/cm2）和是否检出致病菌及致病菌菌种（金黄色葡萄球菌、β- 溶血性链球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、非发酵菌群等）。
（三）、注意事项
1、严格遵守无菌技术操作规程。
2、门把手等不规则的物体表面用浸有含相应中和剂的无菌洗脱液的棉试子直接涂擦采样。
三、手和皮肤黏膜消毒效果监测
（一）采样方法
1、采样时间:在消毒后立即采样。
2、手的采样:被检人五指并拢，用浸有含相应中和剂的无菌洗脱液（中和剂＋洗脱液）的棉拭子在双手指屈面从指根到指端往返涂擦 2 次（一只手涂擦面积约 30cm2），并随之转动采样棉拭子，剪去操作者手接触部位，将棉拭子投入 10ml 含相应中和剂的无菌洗脱液（中和剂＋洗脱液）试管内，在试管外壁标明科别、姓名，立即送检。
3、皮肤粘膜采样:用 5cm×5cm 的标准灭菌规格板，放在被检皮肤处，用浸有含相应中和剂的无菌洗脱液（中和剂＋洗脱液）的棉拭子 1 支，在规格板内横竖往返均匀涂擦各 5 次，并随之转动棉拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子投入 10ml 含相应中和剂的无菌洗脱液（中和剂＋洗脱液）的试管内，在试管外
壁标明科别、姓名、采样部位、采样面积，立即送检。
4、不规则的粘膜皮肤处可用有含相应中和剂的无菌洗脱液（中和剂＋洗脱液）棉拭子直接涂擦5 次，并随之转动棉拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子投入 10ml 含相应中和剂的无菌洗脱液（中和剂＋洗脱液）的试管内，在试管外壁标明科别、姓名、采样部部位，立即送检。
（二）检测方法
1、细菌总数检测
将采样管在混匀器上振荡20s 或用力振打 80 次，用无菌吸管吸取 1.0ml 待检样品接种于灭菌平皿，每一样本接种2个平皿，内加入已溶化的 45℃～48℃ 的营养琼脂 15ml～18ml ，边倾注边摇匀，待琼脂凝固，置 36℃±1℃温箱培养 48h，计数菌落数。
计算：细菌总数（cfu/cm2）＝平板上菌落数 × 稀释倍数/采样面积 不规则粘膜皮肤报告单位为细菌总数（cfu/件）
2、 致病菌检测
按照物品和物体表面消毒效果监测中的致病菌检测方法操作。
3、报告
报告细菌总数〔cfu/cm2〕和是否检出致病菌〔金黄色葡萄球菌、β—溶血性链球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属等〕。若检出致病菌，需报告菌种。
（三）注意事项
1、严格遵守无菌技术操作规程。
2、两只手采样面积约60cm 2 。
四、使用中的消毒剂和灭菌剂细菌污染监测
（一）采样方法
把被检样品充分混匀，用无菌吸管吸取消毒液 1.0ml，加入到 9.0ml 含相应中和剂的无菌生理盐水采样管中混匀，在试管上标明科别、样品所在室、样
品名科（含浓度）、用途，立即送检。
报告细菌总数（cfu/ml）和是否检出致病菌〔金黄色葡萄球菌、β—溶血性链球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属等〕。若检出致病菌，需报告菌种。
（二）检测方法
1、细菌总数检测
（1）、涂抹法：把待检样品充分混匀，用无菌吸管吸取上述溶液 0.2ml，滴于干燥普通琼脂平板，每份样品同时做2个平行样，一平板置 20℃ 培养 7d，观察霉菌生长情况，另一个平板置35℃温箱培养 72h记数菌落数。
（2）倾注法：把待检样品充分混匀，用无菌吸管吸取消毒液 1.0ml，加入到 9.0ml 含相应中和剂的无菌生理盐水采样管中混匀，分别取 0.5ml 放入 2 只灭菌平皿内，加入已熔化的 45℃～48℃ 的营养琼脂 15ml～18ml ，边倾注边摇匀，待琼脂凝固，一平板置 20℃培养 7d，观察霉菌生长情况; 另一个平板置36℃±1℃培养 72h，计数菌落数。
计算：倾注法 消毒灭菌剂染菌量(cfu/ml)＝每个平板上的菌落数 × 20 涂沫法 消毒灭菌剂染菌量(cfu/ml)＝每个平板上的菌落数 × 50
2、致病菌检测
按照物品和物体表面消毒效果监测中的致病菌检测方法操作。
3、报告
报告细菌总数（cfu/ml）和是否检出致病菌〔金黄色葡萄球菌、β- 溶血性链球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属等〕。若检出致病菌，需报告菌种。
（三）注意事项
严格遵守无菌技术操作规程。
五、内镜消毒灭菌效果的监测
（一）采样方法
1、采样时间：在消毒灭菌后、使用前进行采样。
2、采样方法：
（1）有内腔的内镜：用无菌注射器抽取10ml 含相应中和剂的缓冲液，从待检内镜活检口注入，用15ml 无菌试管从活检出口收集，标明科别、样品所在室、样品名称，立即送检。
（2）无内腔的内镜：用沾有含相应中和剂的缓冲液的棉拭子，在被检内镜上从镜头至镜身反复涂擦，剪去手接触部位，将棉拭子投入到 5ml 含相应中和剂的生理盐水采样管中，标明科别、样品所在室、样品名称，立即送检。
（二）检测方法
（1）细菌总数：将送检液用旋涡器充分震荡，取0.5ml ，加入2只直径90mm 无菌平皿，每个平皿分别加入已经熔化的45℃-48℃营养琼脂15ml-18ml ，边倾注边摇匀，待琼脂凝固，于35℃培养48小时后计数。
计算：细菌总数/镜=2个平皿菌落数平均值×20
（2）致病菌检测：将送检液用旋涡器充分震荡，取0.2ml 分别接种90mm 血平皿、中国兰平皿和SS 平皿，均匀涂布，35℃培养48小时，观察有无致病菌生长。
（三）报告
报告细菌总数（cfu/镜）和是否检出致病菌〔金黄色葡萄球菌、β- 溶血性链球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属等〕。若检出致病菌，需报告菌种。
（四）注意事项
严格遵守无菌技术操作规程。
六、医疗器械灭菌效果的监测—无菌检验
无菌检验是指检查经灭菌的敷料、缝线、一次性使用的医疗用品、无菌器械以及适合于无菌检查的其它品种是否无菌的一种方法。
无菌检验应在洁净度为100级单向流空气区域内进行，应严格遵守无菌操作，避免微生物污染；对单向流空气区域及工作台面，必须进行洁净度验证。
（一）无菌检验前准备
1、洗脱液与培养基无菌性试验:无菌试验前 3d，于需-厌养培养基与霉菌培养基内各接种 1ml 洗脱液，分别置 30℃～35℃与 20℃～25℃培养 72h，应无菌生长。
2、阳性对照管菌液制备:
（1）在试验前一天取金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的普通琼脂斜面新鲜培养物，接种1环至需-厌氧培养基内，在 30℃～35℃培养 16h～18h 后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10 cfu/ml～100cfu/ml;
（2）取生孢梭菌[CMCC(B)64941]的需氧菌、厌氧菌培养基新鲜培养物1接种环种于相同培养基内，于30℃～35℃培养 18h～24h 后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10 cfu/ml～100cfu/ml;
（3）取白色念珠菌[CMCC（F ）98001]真菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1接种环种于相同培养基内，于20℃～25℃培养 24h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10cfu/ml～100cfu/ml。
（二）无菌操作:
1、缝合针、针头、刀片等小件医疗器械：分别取5件被检样品直接浸入6管需-厌氧培养管(其中一管作阳性对照) 与 4 管霉菌培养管。培养基用量为 15ml/管。标明科别、样品所在室、样品名称和灭菌日期及灭菌方法。
2、注射器、输液器、输液袋：取5付被检样品分别在5ml 洗脱液中反复抽吸5 次，洗下管内细菌，混和后接种需-厌养菌培养管(共 6 管，其中 1 管作阳性对照) 与霉菌培养管(共 4 管) 。 接种量：1ml 注射器为 0.5ml，2ml 注射器为 1ml ，5ml ～10ml 注射器为 2ml，20ml ～50ml 注射器为 5ml，培养基用量：接种量为 2ml 以下为 15ml/管，接种量5ml 为 40ml/管。标明科别、样品所在室、样品名称和灭菌日期及灭菌方法。
3、手术钳、镊子等大件医疗器械：取2件被检样品分别用沾有无菌洗脱液的棉
拭子分别反复涂抹采样，将棉拭子投入 5ml 无菌洗脱液中，将采样液混匀，接种于需-厌氧培养管(共 6 管，其中 1 管作阳性对照) 与霉菌培养基(共 4 管) 。接种量为 1ml/管，培养基用量为 15ml/管。标明科别、样品所在室、样品名称和灭菌日期及灭菌方法。
（三）培养：在待检样品的需-厌氧培养管中，接种预先准备的金黄色葡萄球菌阳性对照管液 1:1000 稀释 1ml，将需-厌氧培养管以及阳性与阴性对照管均于 30℃～35℃培养 5d，霉菌培养管与阴性对照管于 20℃～25℃培养 7d，培养期间逐日检查是否有菌生长，如加入供试品后培养基出现混浊或沉淀，经培养后不能从外观上判断时，可取培养液转种入另一支相同的培养基中或斜面培养基上，培养 48h～72h 后，观察是否再现混浊或在斜面上有无菌落生长，并在转种的同时，取培养液少量，涂片染色，用显微镜观察是否有菌生长。
（四）结果判定：阳性对照在 24h 内应有菌生长，阴性对照在培养期间应无菌生长，如需-厌氧菌及霉菌培养管内均为澄清或虽显混浊但经证明并非有菌生长，判为灭菌合格；如需-厌氧菌及霉菌培养管中任何1管显混浊并证实有菌生长，应重新取样，分别同法复试 2 次，除阳性对照外，其他各管均不得有菌生长，否则判为灭菌不合格。