2014学年研究生课程“细胞工程”读书指导提纲（）
1， 植物组织培养的理论基础和技术支撑是什么？
理论基础：植物细胞全能性 技术支撑:细胞工程
2， 植物组织培养的优点和缺点是哪些？
优点：不携带病毒，提高植物品质与产量
培养周期短
可短时间大量繁殖，用于拯救濒危植物
不受生长季节限制地繁殖植物
可用组培中的愈伤组织制取特殊的生化制品
可诱导之分化成需要的的器官，如根和芽
外植体材料来源单一，无性系遗传特性一致
缺点： （1）和常规营养体繁殖比生产成本高
（2）组培苗炼苗难、移栽成活率较低
（3）植物组织培养没有变异的过程，所以如果代数过多就会出现产量、生殖能力、生活力下降。
3， 植物细胞与微生物细胞在细胞特点、培养基需求方面有什么区别？
细胞特点：
（1）植物细胞内含有叶绿体，液泡等细胞器，
（2）植物细胞有细胞壁，大多数微生物也有细胞壁，但其成分与植物不同。比如说细菌，其细胞壁成分为肽聚糖。而植物细胞壁成分主要是纤维素，果胶。
（3）很多微生物细胞没有成型的细胞核即它们的细胞核无核膜，其DNA分子也不与蛋白质结合成染色体。
培养基需求方面：
微生物培养基根据不同的需要，成分变化非常之大，总的来说有：牛肉膏、蛋白胨、按需要加不同的糖类、无机盐、指示剂、选择性物质、固体培养基还得加琼脂等等。
植物养基中常常添加植物激素，微生物培养基中不需要
植物培养基中的碳源和能源是蔗糖，微生物培养基中的碳源和能源主要是葡萄糖
植物培养基中需提供植物生长必需的大量元素、微量元素、维生素
4， 植物细胞分化需要的条件、再生的途径。
条件：①无菌条件；②一定浓度的植物激素；③适宜的温度和湿度；④充足的养料。
再生途径：（1）器官发生途径：
外植体 愈伤组织 器官（根、芽） 再生植株
（2
外植体 愈伤组织 胚状体 再生植株
5，
（1）外源激素种类和浓度 (2)基本培养基及其PH值（3）继代培养次数及长短（4）培养条件（温度、湿度、光照强度、光周期）
（5）外植体来源、大小、取材季节、生理状态、发育年龄
常见问题：
①污染问题（外植体、培养基、操作方法）、②玻璃化、③褐化、④生根难、⑤炼苗难
6， 分析一些植物很难通过组织培养再生的原因。
从理论上讲，植物细胞都具有全能性，若条件适宜，都能再生成完整植株，任何组织、器官都可以作为外植体。但实际上，植物种类不同，同一植物不同器官，同一器官不同生理状态，对外界诱导反应的能力及分化再生能力是不同的。外植体来源、大小、取材季节、生理状态、发育年龄都影响植物的再生能力。
7， 植物脱毒培养的步骤和应用意义（举例说明）。
马铃薯茎尖培养脱毒步骤：
（1） 取材和消毒
将欲脱毒的品种块茎催芽，芽长4-5cm时，剪芽并剥去外叶，自来水下冲洗20-30min，再用75%乙醇溶液今蘸一下，然后放入无菌杯内用0.1%氯化汞溶液浸泡5min，再用无菌水冲洗2-3次。
（2） 剥离茎尖和接种
在无菌室内，于30-40X解剖镜下，剥取带1个叶原基的茎尖（0.1-0.3mm），接种于MS茎尖培养基的试管中，每瓶接种1个茎尖。
（3） 培养基和培养条件
接种的茎尖培养于22-25℃，2000-3000lx光照条件下的培养室内，100-120天则长成3-4片叶的小植株。在无菌条件下，进行切段扩繁一次，取部分苗进行病毒检测。
（4） 病毒检测
用ELISA法进行检验，无阳性反应后再用指示植物法鉴定，无任何反应的茎尖苗即脱毒苗可用作大棚温室快速繁殖
（5） 原种的扩繁
一般在温室上覆40-45目尼龙纱网，将脱毒苗种于蛭石、珍珠岩及草炭土制成的基质中培养。
意义：脱除植物病毒，使作物恢复种性，增强抗性，生长健壮，光合作用增强，明显提高了作物的产量和品质，最高可达300%，大量减少了生化农药的使用，防治了土壤有机质的下降，有效地维护了土壤的生态环境。
8， 设计组建一座年产1千万组培苗工厂的平面图，并说明各部分的功能。
（1）准备室（化学实验室）
功能：又叫化学实验室，进行一切与实验有关的准备工作：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、器皿洗涤、培养基配制与分装、培
养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等。
（2）洗涤灭菌室
功能：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。
（3）缓冲间
功能：是进入无菌室前的一个缓冲场地，减少人体从外界带入的尘埃等污染物。工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能进入无菌
室和培养室。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。
（4）无菌操作室（接种室）
功能：也叫接种室，主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程
序，是植物离体培养研究或生产中最关键的一步。
（5）培养室
功能：对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养，无论是研究性实验室还是生产性实验材料进行培养的场所。
（6）温室大棚 功能：用于对培养苗的炼苗与移栽
9， 动物体外受精培育试管动物的步骤。
(1)卵母细胞的采集和成熟培养
(2)精子的采集和获能处理
(3)卵子与精子的体外受精
(4)受精卵体外培养：受精卵需要在培养液或输卵管中发育到桑椹胚或囊胚阶段
(5)胚胎移植：选择繁殖性能强，体格健壮的母畜受体中
10， 动物体外受精培育试管动物的繁殖技术的关键问题有哪些？
体外受精和早期胚胎培养
11， 通过多莉羊的产生给细胞工程带来了哪些启示？
在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性，在分化过程中细胞核中的遗传物质没有不可逆变化；在实践上证明了，利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的，将有无数相同的细胞可用来作为供体进行核移植，并且在与卵细胞相融合前可对这些供体细胞进行一系列复杂的遗传操作，从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法
12， 哪些因素影响培养物的遗传变异？如何诱导和选择体细胞无性系变异。
影响因素：（1）外植体的来源（2）培养基的组成（3）继代培养时间
（4）再生植株的方式（5）外植体细胞中的预先存在的变异
诱导：（1）物理诱变：X、γ、β射线、紫外线等
（2）化学诱变：碱基类似物、烷化剂
（3）复合因子诱变
（4）转座子插入诱变
选择：（1）直接筛选法
用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，而非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。
（2）间接筛选法
间接选择法是一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。当缺乏直接选择表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时，可考虑采用间接筛选法。
13， 高等动植物的生殖发育规律对于快速繁殖动植物优良品种有什么样的意义？
有利于保持植物的优良性状、加快植物的繁殖，有助于更快更有效地繁殖动植物的优良品种
14， 为什么组织培养的关键是保证操作环境的无菌？
植物组织培养中用到的培养基含有丰富的营养成分，有利于培养物的生长，然而各种杂菌同样也可以在上面迅速生长，所以植物组织培养过程中污染现象经常发生。培养基一旦被污染，迅速生长的各种杂菌不但会和培养物争夺营养，而且这些杂菌生长的过程中会生成大量对培养物有害的物质，导致培养物迅速死亡。
15， 细胞纯化及细胞分离有什么意义？
方便研究 分离变量 提高实验结果准确性
16， 你认为细胞生物学是如何促进细胞工程的发展。
细胞工程以细胞为对象，借助细胞生物学所研究和揭示的细胞结构、功能和各种生命规律，应用生命科学理论有目的的改造生物遗传的特性来获得特定细胞。
17， 植物单细胞培养方法有哪些?通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？
培养方法：（1）液体浅层培养法（2）固体平板培养法（3）看护培养法（4）微室培养法
途径：（1）花粉、花药培养；（2）未受精的胚珠和子房；（3）裸子植物的胚乳。
18， 植物细胞大规模培养体系的建立程序是怎样的?生产植物次生产物过程存在什么问题，如何解决？
建立程序：诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬浮细胞系→筛选高产细胞系(株)→在生物反应器中进行细胞系大规模培养→鉴定和提取，获得所需次生代谢物
问题：细胞系不稳定、细胞生长缓慢、不耐剪切力及代谢产量低
提高途径：（1）筛选高产细胞系（2）优化培养基组成（3）添加前体物质（4）使用诱导子（5）使用抑制剂（6）优化培养环境（7）改进培养技术：①两步培养法②固定化培养技术③两相培养技术
19， 原生质体提取、培养方法及特点。
原生质体提取：（1）机械分离法：采用渗透方法使细胞发生质壁分离，然后切开细胞壁释放出原生质体
（2）酶法分离：采用果胶酶、纤维素酶等酶类对植物细胞壁进行酶解，得到原生质体
培养方法：
（1）液体培养。
①液体浅层培养法。优点：操作简便，对原生质体伤害小，易添加新鲜培养基和转移培养物，且有利于通气。缺点：原生质体分散不均匀，易发生互相粘连，聚集，导致原生质体破坏；且难于定点观察和监测单个原生质体的发育过程。
②液体微滴培养法。优点：小滴的体积小，在一个培养皿上可做很多培养基的对照试验，同时也容易添加新鲜培养液。缺点：原生质体分布不均匀，容易集中在小滴中央，培养液易蒸发，造成培养基成分浓度的提高。
（2）固体培养法。
①看护培养。优点：常用于低密度的原生质体培养。缺点：较高温度和相对剧烈振动的培养基，对原生质体容易造成伤害。琼脂本身对原生质体是有害的。
②琼脂糖包埋培养法。优点：易对培养的原生质体进行定点定位观察，追踪其单细胞的发育过程，也便于基因操作。
缺点：琼脂糖凝固前温度较高，对原生质体有一定损伤。
（3）固—液双层培养。优点：液层较浅，有利于通气，固体培养基中养分可以释放到液层中，以补充培养物对养分的消耗。代谢产物被固体所吸收，降低或消除毒害。
20．原生质体培养方法及特点。原生质体融合有哪几种方法？
原生质体融合方法：
（1）自发融合：由于去壁的罗细胞具有彼此融合的能力，在制备原生质体的酶解保温处理过程中，相邻的原生质体能彼此融合形成含有多个细胞核的融合体，这种方式就是自发融合，仅限于同一物种内
（2）诱发融合：通过诱发剂是两个彼此相邻的原生质体相互融合的过程
主要方式有：①NaNO3诱导融合②高PH、高钙离子诱导融合③聚乙二醇（PEG）诱导融合④PEG与高PH、高钙离子相结合的融合法⑤电击融合
2014学年研究生课程“细胞工程”读书指导提纲（）
1， 植物组织培养的理论基础和技术支撑是什么？
理论基础：植物细胞全能性 技术支撑:细胞工程
2， 植物组织培养的优点和缺点是哪些？
优点：不携带病毒，提高植物品质与产量
培养周期短
可短时间大量繁殖，用于拯救濒危植物
不受生长季节限制地繁殖植物
可用组培中的愈伤组织制取特殊的生化制品
可诱导之分化成需要的的器官，如根和芽
外植体材料来源单一，无性系遗传特性一致
缺点： （1）和常规营养体繁殖比生产成本高
（2）组培苗炼苗难、移栽成活率较低
（3）植物组织培养没有变异的过程，所以如果代数过多就会出现产量、生殖能力、生活力下降。
3， 植物细胞与微生物细胞在细胞特点、培养基需求方面有什么区别？
细胞特点：
（1）植物细胞内含有叶绿体，液泡等细胞器，
（2）植物细胞有细胞壁，大多数微生物也有细胞壁，但其成分与植物不同。比如说细菌，其细胞壁成分为肽聚糖。而植物细胞壁成分主要是纤维素，果胶。
（3）很多微生物细胞没有成型的细胞核即它们的细胞核无核膜，其DNA分子也不与蛋白质结合成染色体。
培养基需求方面：
微生物培养基根据不同的需要，成分变化非常之大，总的来说有：牛肉膏、蛋白胨、按需要加不同的糖类、无机盐、指示剂、选择性物质、固体培养基还得加琼脂等等。
植物养基中常常添加植物激素，微生物培养基中不需要
植物培养基中的碳源和能源是蔗糖，微生物培养基中的碳源和能源主要是葡萄糖
植物培养基中需提供植物生长必需的大量元素、微量元素、维生素
4， 植物细胞分化需要的条件、再生的途径。
条件：①无菌条件；②一定浓度的植物激素；③适宜的温度和湿度；④充足的养料。
再生途径：（1）器官发生途径：
外植体 愈伤组织 器官（根、芽） 再生植株
（2
外植体 愈伤组织 胚状体 再生植株
5，
（1）外源激素种类和浓度 (2)基本培养基及其PH值（3）继代培养次数及长短（4）培养条件（温度、湿度、光照强度、光周期）
（5）外植体来源、大小、取材季节、生理状态、发育年龄
常见问题：
①污染问题（外植体、培养基、操作方法）、②玻璃化、③褐化、④生根难、⑤炼苗难
6， 分析一些植物很难通过组织培养再生的原因。
从理论上讲，植物细胞都具有全能性，若条件适宜，都能再生成完整植株，任何组织、器官都可以作为外植体。但实际上，植物种类不同，同一植物不同器官，同一器官不同生理状态，对外界诱导反应的能力及分化再生能力是不同的。外植体来源、大小、取材季节、生理状态、发育年龄都影响植物的再生能力。
7， 植物脱毒培养的步骤和应用意义（举例说明）。
马铃薯茎尖培养脱毒步骤：
（1） 取材和消毒
将欲脱毒的品种块茎催芽，芽长4-5cm时，剪芽并剥去外叶，自来水下冲洗20-30min，再用75%乙醇溶液今蘸一下，然后放入无菌杯内用0.1%氯化汞溶液浸泡5min，再用无菌水冲洗2-3次。
（2） 剥离茎尖和接种
在无菌室内，于30-40X解剖镜下，剥取带1个叶原基的茎尖（0.1-0.3mm），接种于MS茎尖培养基的试管中，每瓶接种1个茎尖。
（3） 培养基和培养条件
接种的茎尖培养于22-25℃，2000-3000lx光照条件下的培养室内，100-120天则长成3-4片叶的小植株。在无菌条件下，进行切段扩繁一次，取部分苗进行病毒检测。
（4） 病毒检测
用ELISA法进行检验，无阳性反应后再用指示植物法鉴定，无任何反应的茎尖苗即脱毒苗可用作大棚温室快速繁殖
（5） 原种的扩繁
一般在温室上覆40-45目尼龙纱网，将脱毒苗种于蛭石、珍珠岩及草炭土制成的基质中培养。
意义：脱除植物病毒，使作物恢复种性，增强抗性，生长健壮，光合作用增强，明显提高了作物的产量和品质，最高可达300%，大量减少了生化农药的使用，防治了土壤有机质的下降，有效地维护了土壤的生态环境。
8， 设计组建一座年产1千万组培苗工厂的平面图，并说明各部分的功能。
（1）准备室（化学实验室）
功能：又叫化学实验室，进行一切与实验有关的准备工作：完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、器皿洗涤、培养基配制与分装、培
养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等。
（2）洗涤灭菌室
功能：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、培养基的灭菌等。
（3）缓冲间
功能：是进入无菌室前的一个缓冲场地，减少人体从外界带入的尘埃等污染物。工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能进入无菌
室和培养室。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入接种室杂菌。
（4）无菌操作室（接种室）
功能：也叫接种室，主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程
序，是植物离体培养研究或生产中最关键的一步。
（5）培养室
功能：对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养，无论是研究性实验室还是生产性实验材料进行培养的场所。
（6）温室大棚 功能：用于对培养苗的炼苗与移栽
9， 动物体外受精培育试管动物的步骤。
(1)卵母细胞的采集和成熟培养
(2)精子的采集和获能处理
(3)卵子与精子的体外受精
(4)受精卵体外培养：受精卵需要在培养液或输卵管中发育到桑椹胚或囊胚阶段
(5)胚胎移植：选择繁殖性能强，体格健壮的母畜受体中
10， 动物体外受精培育试管动物的繁殖技术的关键问题有哪些？
体外受精和早期胚胎培养
11， 通过多莉羊的产生给细胞工程带来了哪些启示？
在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性，在分化过程中细胞核中的遗传物质没有不可逆变化；在实践上证明了，利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的，将有无数相同的细胞可用来作为供体进行核移植，并且在与卵细胞相融合前可对这些供体细胞进行一系列复杂的遗传操作，从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法
12， 哪些因素影响培养物的遗传变异？如何诱导和选择体细胞无性系变异。
影响因素：（1）外植体的来源（2）培养基的组成（3）继代培养时间
（4）再生植株的方式（5）外植体细胞中的预先存在的变异
诱导：（1）物理诱变：X、γ、β射线、紫外线等
（2）化学诱变：碱基类似物、烷化剂
（3）复合因子诱变
（4）转座子插入诱变
选择：（1）直接筛选法
用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，而非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。
（2）间接筛选法
间接选择法是一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。当缺乏直接选择表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时，可考虑采用间接筛选法。
13， 高等动植物的生殖发育规律对于快速繁殖动植物优良品种有什么样的意义？
有利于保持植物的优良性状、加快植物的繁殖，有助于更快更有效地繁殖动植物的优良品种
14， 为什么组织培养的关键是保证操作环境的无菌？
植物组织培养中用到的培养基含有丰富的营养成分，有利于培养物的生长，然而各种杂菌同样也可以在上面迅速生长，所以植物组织培养过程中污染现象经常发生。培养基一旦被污染，迅速生长的各种杂菌不但会和培养物争夺营养，而且这些杂菌生长的过程中会生成大量对培养物有害的物质，导致培养物迅速死亡。
15， 细胞纯化及细胞分离有什么意义？
方便研究 分离变量 提高实验结果准确性
16， 你认为细胞生物学是如何促进细胞工程的发展。
细胞工程以细胞为对象，借助细胞生物学所研究和揭示的细胞结构、功能和各种生命规律，应用生命科学理论有目的的改造生物遗传的特性来获得特定细胞。
17， 植物单细胞培养方法有哪些?通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？
培养方法：（1）液体浅层培养法（2）固体平板培养法（3）看护培养法（4）微室培养法
途径：（1）花粉、花药培养；（2）未受精的胚珠和子房；（3）裸子植物的胚乳。
18， 植物细胞大规模培养体系的建立程序是怎样的?生产植物次生产物过程存在什么问题，如何解决？
建立程序：诱导植物产生旺盛生长的愈伤组织和悬浮细胞系→筛选高产细胞系(株)→在生物反应器中进行细胞系大规模培养→鉴定和提取，获得所需次生代谢物
问题：细胞系不稳定、细胞生长缓慢、不耐剪切力及代谢产量低
提高途径：（1）筛选高产细胞系（2）优化培养基组成（3）添加前体物质（4）使用诱导子（5）使用抑制剂（6）优化培养环境（7）改进培养技术：①两步培养法②固定化培养技术③两相培养技术
19， 原生质体提取、培养方法及特点。
原生质体提取：（1）机械分离法：采用渗透方法使细胞发生质壁分离，然后切开细胞壁释放出原生质体
（2）酶法分离：采用果胶酶、纤维素酶等酶类对植物细胞壁进行酶解，得到原生质体
培养方法：
（1）液体培养。
①液体浅层培养法。优点：操作简便，对原生质体伤害小，易添加新鲜培养基和转移培养物，且有利于通气。缺点：原生质体分散不均匀，易发生互相粘连，聚集，导致原生质体破坏；且难于定点观察和监测单个原生质体的发育过程。
②液体微滴培养法。优点：小滴的体积小，在一个培养皿上可做很多培养基的对照试验，同时也容易添加新鲜培养液。缺点：原生质体分布不均匀，容易集中在小滴中央，培养液易蒸发，造成培养基成分浓度的提高。
（2）固体培养法。
①看护培养。优点：常用于低密度的原生质体培养。缺点：较高温度和相对剧烈振动的培养基，对原生质体容易造成伤害。琼脂本身对原生质体是有害的。
②琼脂糖包埋培养法。优点：易对培养的原生质体进行定点定位观察，追踪其单细胞的发育过程，也便于基因操作。
缺点：琼脂糖凝固前温度较高，对原生质体有一定损伤。
（3）固—液双层培养。优点：液层较浅，有利于通气，固体培养基中养分可以释放到液层中，以补充培养物对养分的消耗。代谢产物被固体所吸收，降低或消除毒害。
20．原生质体培养方法及特点。原生质体融合有哪几种方法？
原生质体融合方法：
（1）自发融合：由于去壁的罗细胞具有彼此融合的能力，在制备原生质体的酶解保温处理过程中，相邻的原生质体能彼此融合形成含有多个细胞核的融合体，这种方式就是自发融合，仅限于同一物种内
（2）诱发融合：通过诱发剂是两个彼此相邻的原生质体相互融合的过程
主要方式有：①NaNO3诱导融合②高PH、高钙离子诱导融合③聚乙二醇（PEG）诱导融合④PEG与高PH、高钙离子相结合的融合法⑤电击融合