淀粉酶活力的测定
摘要：本实验以萌发的种子为材料，以麦芽糖为辅助材料，测定其中
α-淀粉酶和β-淀粉酶活性及其之间的差异；了解722分光光度计
的应用。熟悉缓冲溶液的配置；通过对两种淀粉酶的测定得出α-淀
粉酶的活力为1.368；（α+β）淀粉酶的活力为17.415，R2=
关键词：α-淀粉酶；B-淀粉酶；麦芽糖标准曲线；淀粉酶 几乎所有的植物种子中都含有淀粉酶，特别是萌发的禾谷类种子，其淀粉酶的活力最强。淀粉酶主要分为a-淀粉酶和B-淀粉酶。种子萌发时，淀粉酶的活性会随着萌发时间的推移而迅速增加，其作用是将淀粉水解为小分子糖类，供幼苗生长。a-淀粉酶随机水解a-1-4糖苷键，作为淀粉分解的起始酶而起主要作用，其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等；B-淀粉酶水解非还原端的第二个a-1-4糖苷键，水解产物为麦芽糖。
原理：这两种淀粉酶有不同的理化性质，a-淀粉酶不耐酸，在PH3.6以下迅速钝化；B-淀粉酶在70℃下15min被钝化。据此。可以在钝化其中之一，来测定另一个酶的活力。该试验通过先钝化B-淀粉酶来测定a-淀粉酶的活力，在与非钝化条件下测的的总淀粉酶活力比较，从而求出B-淀粉酶的活力。淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原糖能与3，5-二硝基水杨酸试剂反映，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖或者葡萄糖浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还
原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量
表示酶活力。 实验仪器及试剂
722分光光度计；离心机；恒温水浴器；研钵；具刻度试管25ml13支；刻度吸管1ml、2ml、5ml各1支；容量瓶50ml2支
(1)麦芽糖标准液（1mg/ml）；(2)DNS试剂；（4）0.1mol/Lph5.6柠檬酸缓冲液(3)1%淀粉溶液 1、 试剂的配置
（1） 称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100ml （2） 称取3，5-二硝基水杨,1g，溶于20ml 12mol/L NaoH
溶液中，加入50ml蒸馏水，在加入30g酒石酸钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。塞紧瓶塞，防止CO2进入。
（3） A液：称取分析纯柠檬酸21.01g，用蒸馏水溶解并定
容至1L B液：称取柠檬酸钠29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L,取A液55ml与B液145ml混匀，即可制成
（4） 称取1g淀粉溶于100ml/LPH5.6的柠檬酸缓冲液中 2、选取饱满的小麦种子数粒，于培养皿中用自来水培养3~4天，小麦长1.0~1.5CM 3、麦芽糖表准曲线制作
取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表3-1加入试剂。
表3-1 制作麦芽糖标准曲线配方表
麦芽糖标准液（ml) 蒸馏水（ml) 麦芽糖含量（mg) 3,5-二硝基水杨酸（ml)
1
2
3
4
5
6
7 2 0 2
0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6
2 2 2 2 2 2 2
4、酶活力测定
（1）酶液提取：称取25℃下萌发3~4天的小麦种子1.0g（芽长1.0~1.5CM），置于研钵中，加少量石英砂和2Ml蒸馏水，研磨成匀浆后转入离心管中，用7Ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管中，提取液在适温下放置提取15~20Min,每隔数分钟搅动一次，使其充分提取。然后在3000r/ Min转速下离心10Min,将上清液倒入50ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。汲取上述淀粉酶原液5ml，放入50Ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶稀释液。 （2）酶活力的测定：取6支干净的具塞刻度试管,编号,按表3-2进行操作。
表3-2 配活力的测定配方表
管号 淀粉酶原液（Ml）
I-1 1
I-2 1
I-3 1
II-1 0
II-2 0
II-3 0
钝化β-淀粉酶 置70℃水浴中15min，取出后在流水中冷却
管号 淀粉酶稀释液（Ml） DNS试剂（ml)
I-1 0 2
I-2 0 0
I-3 0 0
II-1 1 2
II-2 1 0
II-3 1 0
预保温 40℃恒温水浴中保温10min
管号
1%淀粉溶液（ml）40℃
I-1 1
I-2 1
I-3 1
II-1 1
II-2 1
II-3 1
保温 40℃恒温水浴中准确保温5min 5、结果计算
用Ⅰ-2、Ⅰ-3吸光度平均值与Ⅰ-1吸光度值之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg)，再按下式计算α-淀粉酶的活力(Aα)，淀粉酶活性以每克鲜重所含麦芽糖毫克数(Mg／
g·Min)表示：
Aα＝CαVTFW×t×V1（18-1）
Ⅱ-2、Ⅱ-3吸光度平均值与Ⅱ-1吸光度值之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg)，按式18-1计算(α＋β)-淀粉酶的活性AT AT＝CT×VTFW×t×V1
式中A:淀粉酶活性，Aα为α-淀粉酶的活性，AT为淀粉酶总活性，主要是α、β-淀粉酶的活性；
Cα:α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量(查标准曲线求值，以下同)；
CT:(α＋β)淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量； V1:显色所用酶液体积(Ml)； T:酶作用时间(Min)；
VT:样品稀释液总体积(α-淀粉酶为50Ml，α＋β淀粉酶为500Ml)； FW:样品鲜重(g) 6、结果与分析
根据所得曲线及所需要的数据得到α-淀粉酶的活力为1.368；
（α+β）淀粉酶的活力为17.415，已知淀粉酶中α-淀粉酶在水解
淀粉过程当中其主要作用，从实验结果可以看出，该试验有很大的误差。原因可能有：①在酶活力测定这一环节中，沸水浴5min冷却定容后，没有摇匀，用来比色的样品液只是
试管中的上清液，导致所测的的吸光值偏大②在加入淀粉溶液前，没有将盛有淀粉溶液的仪器摇匀，因为淀粉溶液在静止时会形成沉淀，使得每试管中的淀粉溶液含量多少不一③比色读数时，没有等到数值稳定就开始读数
淀粉酶活力的测定
摘要：本实验以萌发的种子为材料，以麦芽糖为辅助材料，测定其中
α-淀粉酶和β-淀粉酶活性及其之间的差异；了解722分光光度计
的应用。熟悉缓冲溶液的配置；通过对两种淀粉酶的测定得出α-淀
粉酶的活力为1.368；（α+β）淀粉酶的活力为17.415，R2=
关键词：α-淀粉酶；B-淀粉酶；麦芽糖标准曲线；淀粉酶 几乎所有的植物种子中都含有淀粉酶，特别是萌发的禾谷类种子，其淀粉酶的活力最强。淀粉酶主要分为a-淀粉酶和B-淀粉酶。种子萌发时，淀粉酶的活性会随着萌发时间的推移而迅速增加，其作用是将淀粉水解为小分子糖类，供幼苗生长。a-淀粉酶随机水解a-1-4糖苷键，作为淀粉分解的起始酶而起主要作用，其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等；B-淀粉酶水解非还原端的第二个a-1-4糖苷键，水解产物为麦芽糖。
原理：这两种淀粉酶有不同的理化性质，a-淀粉酶不耐酸，在PH3.6以下迅速钝化；B-淀粉酶在70℃下15min被钝化。据此。可以在钝化其中之一，来测定另一个酶的活力。该试验通过先钝化B-淀粉酶来测定a-淀粉酶的活力，在与非钝化条件下测的的总淀粉酶活力比较，从而求出B-淀粉酶的活力。淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原糖能与3，5-二硝基水杨酸试剂反映，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖或者葡萄糖浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还
原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量
表示酶活力。 实验仪器及试剂
722分光光度计；离心机；恒温水浴器；研钵；具刻度试管25ml13支；刻度吸管1ml、2ml、5ml各1支；容量瓶50ml2支
(1)麦芽糖标准液（1mg/ml）；(2)DNS试剂；（4）0.1mol/Lph5.6柠檬酸缓冲液(3)1%淀粉溶液 1、 试剂的配置
（1） 称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100ml （2） 称取3，5-二硝基水杨,1g，溶于20ml 12mol/L NaoH
溶液中，加入50ml蒸馏水，在加入30g酒石酸钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。塞紧瓶塞，防止CO2进入。
（3） A液：称取分析纯柠檬酸21.01g，用蒸馏水溶解并定
容至1L B液：称取柠檬酸钠29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L,取A液55ml与B液145ml混匀，即可制成
（4） 称取1g淀粉溶于100ml/LPH5.6的柠檬酸缓冲液中 2、选取饱满的小麦种子数粒，于培养皿中用自来水培养3~4天，小麦长1.0~1.5CM 3、麦芽糖表准曲线制作
取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表3-1加入试剂。
表3-1 制作麦芽糖标准曲线配方表
麦芽糖标准液（ml) 蒸馏水（ml) 麦芽糖含量（mg) 3,5-二硝基水杨酸（ml)
1
2
3
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7 2 0 2
0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6
2 2 2 2 2 2 2
4、酶活力测定
（1）酶液提取：称取25℃下萌发3~4天的小麦种子1.0g（芽长1.0~1.5CM），置于研钵中，加少量石英砂和2Ml蒸馏水，研磨成匀浆后转入离心管中，用7Ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管中，提取液在适温下放置提取15~20Min,每隔数分钟搅动一次，使其充分提取。然后在3000r/ Min转速下离心10Min,将上清液倒入50ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。汲取上述淀粉酶原液5ml，放入50Ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶稀释液。 （2）酶活力的测定：取6支干净的具塞刻度试管,编号,按表3-2进行操作。
表3-2 配活力的测定配方表
管号 淀粉酶原液（Ml）
I-1 1
I-2 1
I-3 1
II-1 0
II-2 0
II-3 0
钝化β-淀粉酶 置70℃水浴中15min，取出后在流水中冷却
管号 淀粉酶稀释液（Ml） DNS试剂（ml)
I-1 0 2
I-2 0 0
I-3 0 0
II-1 1 2
II-2 1 0
II-3 1 0
预保温 40℃恒温水浴中保温10min
管号
1%淀粉溶液（ml）40℃
I-1 1
I-2 1
I-3 1
II-1 1
II-2 1
II-3 1
保温 40℃恒温水浴中准确保温5min 5、结果计算
用Ⅰ-2、Ⅰ-3吸光度平均值与Ⅰ-1吸光度值之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg)，再按下式计算α-淀粉酶的活力(Aα)，淀粉酶活性以每克鲜重所含麦芽糖毫克数(Mg／
g·Min)表示：
Aα＝CαVTFW×t×V1（18-1）
Ⅱ-2、Ⅱ-3吸光度平均值与Ⅱ-1吸光度值之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(Mg)，按式18-1计算(α＋β)-淀粉酶的活性AT AT＝CT×VTFW×t×V1
式中A:淀粉酶活性，Aα为α-淀粉酶的活性，AT为淀粉酶总活性，主要是α、β-淀粉酶的活性；
Cα:α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量(查标准曲线求值，以下同)；
CT:(α＋β)淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量； V1:显色所用酶液体积(Ml)； T:酶作用时间(Min)；
VT:样品稀释液总体积(α-淀粉酶为50Ml，α＋β淀粉酶为500Ml)； FW:样品鲜重(g) 6、结果与分析
根据所得曲线及所需要的数据得到α-淀粉酶的活力为1.368；
（α+β）淀粉酶的活力为17.415，已知淀粉酶中α-淀粉酶在水解
淀粉过程当中其主要作用，从实验结果可以看出，该试验有很大的误差。原因可能有：①在酶活力测定这一环节中，沸水浴5min冷却定容后，没有摇匀，用来比色的样品液只是
试管中的上清液，导致所测的的吸光值偏大②在加入淀粉溶液前，没有将盛有淀粉溶液的仪器摇匀，因为淀粉溶液在静止时会形成沉淀，使得每试管中的淀粉溶液含量多少不一③比色读数时，没有等到数值稳定就开始读数