长期以来,对于各种原发的和继发的软组织缺损的治疗一直是困扰整形外科医生的难题之一。自体脂肪作为一种软组织填充物,由于其诸多的并发症曾一度被人们放弃,但随着组织工程技术及细胞生物学的不断发展,自体脂肪移植又逐渐被人们认可。现将脂肪干细胞在脂肪移植中的作用及其临床应用现状综述如下。
1脂肪移植的发展概况
20世纪初,自体颗粒脂肪移植开始应用于临床,由于其吸收率高、存活率低,且并发症较多,限制了其在临床中的应用。21世纪初,通过改进脂肪获取技术,加速了脂肪血管化,提高了脂肪颗粒移植的成活率。但是坏死、吸收仍然是颗粒脂肪移植的主要并发症。1998年,Coleman发明了结构脂肪(liposuction)移植技术,即在脂肪移植的整个过程中保证脂肪细胞具有更多的完整性和活性,也就是后来所说的Coleman技术,使脂肪移植的存活率有了很大的提高。而自Zuk等[1]首次从自体脂肪组织中分离获得具有多向分化潜能的细胞―脂肪来源干细胞(Adipose-derived stem cells,ASCs)以来,其研究越来越深入,因为其来源丰富,取材方便,且组织中干细胞含量丰富,因而ASC被认为是组织再生和修复的理想细胞来源,可为多种疾病的治疗提供充足的种子细胞[2]。近年来,随着组织工程技术的迅速发展,为克服常规注射颗粒脂肪移植的问题,如吸收、囊肿、硬结等,Yoshimura等[4]又发明了细胞辅助的脂肪移植术(cell-assisted lipotransfer,CAL),为脂肪移植提供了一种更为可靠的方法。该技术是将自体脂肪来源干细胞(Adipose-derived stem cells,ASCs)与脂肪细胞混合,联合注射移植。
2脂肪移植中的细胞基础
脂肪组织通常被认为是贮存能量及内分泌器官,是软组织填充和吸脂处理的必要组织。同时还被认为是成体干细胞的有效来源,因为脂肪组织含有多种的祖细胞,可分化为多种谱系[3]。脂肪组织中主要包含脂肪细胞、ASCs、血管内皮细胞、壁细胞、成纤维细胞、巨噬细胞及细胞外基质等[4],其中脂肪细胞和ASCs是近年来研究的热点。脂肪细胞是脂肪组织的基础,其体积占总体积的90%以上,但数量却少于50%[5-6]。ASCs被认为是一种表现脂肪细胞和血管细胞的祖细胞[7],它位于脂肪细胞之间、血管周围或细胞外基质中,可促进脂肪组织的转归[8]。但脂肪组织的转归是一个很漫长的过程,成年人平均每年大约有10%左右的脂肪细胞被更新[8-9],而ASCs又存在于脂肪组织的间质血管碎片中(stromal vascular fraction,SVF)[10]。间质血管碎片(SVF)是干细胞辅助脂肪移植中最重要的组分。通过胶原酶消化,从脂肪组织中分离的多种细胞混合物形成的细胞团就叫做间质血管碎片(SVF)。间质血管碎片中含有丰富的间充质细胞,可分化为多种谱系的细胞,是再生医学、组织工程等最理想的种子细胞。获取SVF的方法主要是[5]将吸脂后的脂肪用PBS (phosphate-buffered saline)反复冲洗两次,然后在37℃条件下用0.075%的胶原酶消化30min,再用含10%胎牛血清的DMEM终止消化,1200g离心10min后就会获得高密度的SVF碎片[1]。其中主要包括间质细胞、血管内皮细胞和壁细胞。另外, SVF中也包括一些血管来源的细胞,如白细胞和红细胞等,而血管来源细胞的比率主要取决于个体出血的多少。在CAL中,不需经过人工的分选及培养,直接将分离的新鲜的自体SVF用来做脂肪移植补充物[11-12]。另外,有研究指出新鲜分离的脂肪干细胞与培养增殖的干细胞相比可能在治疗方面更具有安全性和有效性[4,13]。现在正在进行的一些临床试验也经常应用新鲜分离的SVF,而不是纯化或培养的ASCs。因为SVF包含其他细胞,如血管内皮细胞或巨噬细胞等,许多研究发现它们之间有一种协同效应[14-16]。
3ASCs在脂肪移植中的作用
脂肪移植后脂肪组织的存活和萎缩的机制并未得到证明。移植后无微血管的脂肪组织被安置于异位组织中―相对缺血区,最初几天的营养灌注来自于宿主组织周围组织,直到形成新的微血管。对于损伤的反应,损伤的宿主组织,特别是细胞外基质和死亡的细胞会释放FGF[16]。在修复过程中,脂肪细胞(对缺氧很敏感)在氧压低于其阈值的情况下24h内可能死亡。但是ASCs更能耐受缺氧,其在缺氧情况下可保持功能72h[17]。在动物模型的缺血再灌注损伤的脂肪组织中,ASCs在脂肪移植的修复过程中及在脂肪化和血管化中起着重要的作用[18],其可调节周围组织中生长激素及细胞因子的释放[19],并通过分泌各种生长因子如VEGF,IGF-1防止细胞凋亡[20],使脂肪组织的再生和凋亡达到平衡。
ASCs存在于脂肪细胞之间、血管壁、结缔组织中,但大部分聚集在血管周围。其在缺氧条件下可释放血管形成因子[21-22],并可分化为血管内皮细胞[23-24],表现为成血管特性,成为治疗局部缺血性疾病血管发生的最理想细胞来源。一些研究表明存在血管壁的细胞群落可分化为血管[25-26]。最近发现大鼠的脂肪祖细胞像血管管壁细胞一样存在于脂肪组织的血管中[27]。因此,ASCs被认为是一种脂肪细胞和血管细胞的双重祖细胞。ASCs可为脂肪组织的转归和下一代的再生提供原始细胞,脂肪组织细胞凋亡后可被ASCs来源的下一代细胞取代[6-7]。脂肪组织会随着发育、肥胖而增殖,也会随着老龄化、缺血而发生萎缩,还可在损伤后修复、缺血再灌注的损伤及脂肪移植后起到塑形作用。发生这些塑形过程可能是因为脂肪细胞的凋亡坏死和ASCs引起的脂肪化之间的失衡,在这些变化过程中同时也伴随着微血管的重塑。同时,Caplan[28]也指出脂肪组织随着年龄的增长而萎缩可能由于ASCs的减少,凋亡和再生失去了平衡。一些前期的研究还发现即使存活的脂肪细胞在移植的最初几个月内也会发生死亡并被下一代细胞所取代,其原因可能由于局部缺血。因此,有功能的ASCs的数量可能在组织修复和塑形中具有重要作用。
4ASCs在细胞辅助的脂肪移植术(CAL)中的作用
CAL技术是将新抽取脂肪分成两份:一份用来提取SVF,另一份作为提取的细胞外基质,两部分联合注射于受区[12]。Sterodimas[10]指出吸脂的脂肪组织与完整脂肪组织相比, ASCs的数量只有原来的一半。其原因可能是因为一部分ASCs停留在大血管周围或留在受体组织中,一部分ASCs释放入吸脂脂肪的液体成分中[12]。这种低ASCs比率可能是移植的脂肪组织长时间后萎缩的主要原因。最近的研究表明[10,29-30]脂肪来源干细胞辅助治疗可提高存活脂肪组织的体积和质地。在CAL中[31-32],脂肪组织可作为有活力的生物支架,使新鲜的包含ASCs的SVF粘附于脂肪组织上,不仅增加了前体细胞的数量,还有利于组织血管的形成和ASCs向脂肪组织的转归,提高了脂肪组织的成活率。Yoshimura[32]认为ASCs在CAL中的作用可能是:①分化成脂肪细胞并促进脂肪再生;②分化成血管内皮细胞和壁细胞,以促进血管化作用;③在缺氧、损伤等条件下可促进血管生长因子释放,如肝细胞生长因子(HGF), 基质细胞衍生因子-1(SDF-1);④最有可能的就是ASCs作为原始的ASCs而成活。
5ASCs的临床应用现状
Ogawa[33]指出干细胞在临床上的应用应考虑三方面的因素:①如何在无损伤的条件下获取、处理及增殖细胞,操作的简单性及高效性等;②如何使干细胞分化成所需细胞及如何建立起有效的三维组织结构;③如何保证分化后细胞的存活及组织的再生,因为组织再生必须具有一定的脉管系统来保证组织和分化后细胞的存活。而脂肪来源干细胞可分化为内皮细胞和脂肪细胞,促进血管和脂肪组织的形成,并且来源丰富、操作简单,可满足软组织填充的基本要求。临床前研究及早期的临床研究也指出ASCs复合可注射型支架材料可作为软组织填充物应用于整形外科中[30]。目前,欧洲和亚洲已有许多国家已经开始利用人类ASCs构建组织工程脂肪组织,用于修复软组织的缺损。
Yoshimura[32]是首位将ASCs的临床经验公布的作者,2003～2008年,Yoshimura 等[34]利用细胞辅助的吸脂术进行了临床研究,共做了307例患者(女性303例、男性4例),乳房手术269例(177例隆胸术,52例乳房植入物替代术和40例乳房切除术后再造)面部手术48例(3例红斑狼疮,2例Romberg病和1例硬皮病),臀部4例,手部3例。结果显示患者对移植后皮肤的自然纹理、柔软度、软组织填充后的塑形等都很满意。3D检测显示隆胸后移植物存活率在40%～80%[31],CT及MRI显示脂肪组织存活很好,在乳房腺体周围及腺体和胸肌之间形成了一定厚度的脂肪层。在面部脂肪萎缩的治疗中,其有效性得到了充分的证实,另外,CAL在治疗半侧颜面萎缩及深部红斑狼疮中也有明显的效果[34]。但是在临床试验中,有2例患者注射SVF后3个月发生了异位的纤维组织形成,CT显示皮下脂肪层中有纤维组织形成。这种结果可能由于微环境的变化使ASCs产生了非必要的细胞分化,Yoshimura [35]指出为了避免这种情况,ASCs尽量与脂肪组织充分粘附,使其向必需细胞方向转化。在临床上,ASCs也被应用于治疗其他疾病,如急性心肌梗死、周围血管疾病、软组织及骨骼的缺损、皮肤损伤等,结果表明都有很好的治疗效果[38]。CAL也被应用于放疗后并发症的治疗,临床结果显示所有患者的症状都有明显的改善,其原因可能是由于组织血管的形成和器官功能的恢复[37]。
综上所述,新鲜分离的SVF含有丰富的脂肪来源干细胞,血管内皮细胞等前体细胞。在CAL中它与其他细胞相互影响并通过自分泌,分泌多种促血管化的细胞因子,可增加组织的血管化程度,改善移植物的质地,极大地提高了脂肪移植的存活率。虽然自体脂肪移植的安全性和长期有效性等有待进一步的评估,其作用机制也有待进一步的研究,但笔者相信由于SVF复合自体脂肪移植独特的优越性,其必将在整形美容外科领域成为一种理想的软组织填充物。
[参考文献]
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[收稿日期]2010-05-09[修回日期]2010-06-30
编辑/李阳利
长期以来,对于各种原发的和继发的软组织缺损的治疗一直是困扰整形外科医生的难题之一。自体脂肪作为一种软组织填充物,由于其诸多的并发症曾一度被人们放弃,但随着组织工程技术及细胞生物学的不断发展,自体脂肪移植又逐渐被人们认可。现将脂肪干细胞在脂肪移植中的作用及其临床应用现状综述如下。
1脂肪移植的发展概况
20世纪初,自体颗粒脂肪移植开始应用于临床,由于其吸收率高、存活率低,且并发症较多,限制了其在临床中的应用。21世纪初,通过改进脂肪获取技术,加速了脂肪血管化,提高了脂肪颗粒移植的成活率。但是坏死、吸收仍然是颗粒脂肪移植的主要并发症。1998年,Coleman发明了结构脂肪(liposuction)移植技术,即在脂肪移植的整个过程中保证脂肪细胞具有更多的完整性和活性,也就是后来所说的Coleman技术,使脂肪移植的存活率有了很大的提高。而自Zuk等[1]首次从自体脂肪组织中分离获得具有多向分化潜能的细胞―脂肪来源干细胞(Adipose-derived stem cells,ASCs)以来,其研究越来越深入,因为其来源丰富,取材方便,且组织中干细胞含量丰富,因而ASC被认为是组织再生和修复的理想细胞来源,可为多种疾病的治疗提供充足的种子细胞[2]。近年来,随着组织工程技术的迅速发展,为克服常规注射颗粒脂肪移植的问题,如吸收、囊肿、硬结等,Yoshimura等[4]又发明了细胞辅助的脂肪移植术(cell-assisted lipotransfer,CAL),为脂肪移植提供了一种更为可靠的方法。该技术是将自体脂肪来源干细胞(Adipose-derived stem cells,ASCs)与脂肪细胞混合,联合注射移植。
2脂肪移植中的细胞基础
脂肪组织通常被认为是贮存能量及内分泌器官,是软组织填充和吸脂处理的必要组织。同时还被认为是成体干细胞的有效来源,因为脂肪组织含有多种的祖细胞,可分化为多种谱系[3]。脂肪组织中主要包含脂肪细胞、ASCs、血管内皮细胞、壁细胞、成纤维细胞、巨噬细胞及细胞外基质等[4],其中脂肪细胞和ASCs是近年来研究的热点。脂肪细胞是脂肪组织的基础,其体积占总体积的90%以上,但数量却少于50%[5-6]。ASCs被认为是一种表现脂肪细胞和血管细胞的祖细胞[7],它位于脂肪细胞之间、血管周围或细胞外基质中,可促进脂肪组织的转归[8]。但脂肪组织的转归是一个很漫长的过程,成年人平均每年大约有10%左右的脂肪细胞被更新[8-9],而ASCs又存在于脂肪组织的间质血管碎片中(stromal vascular fraction,SVF)[10]。间质血管碎片(SVF)是干细胞辅助脂肪移植中最重要的组分。通过胶原酶消化,从脂肪组织中分离的多种细胞混合物形成的细胞团就叫做间质血管碎片(SVF)。间质血管碎片中含有丰富的间充质细胞,可分化为多种谱系的细胞,是再生医学、组织工程等最理想的种子细胞。获取SVF的方法主要是[5]将吸脂后的脂肪用PBS (phosphate-buffered saline)反复冲洗两次,然后在37℃条件下用0.075%的胶原酶消化30min,再用含10%胎牛血清的DMEM终止消化,1200g离心10min后就会获得高密度的SVF碎片[1]。其中主要包括间质细胞、血管内皮细胞和壁细胞。另外, SVF中也包括一些血管来源的细胞,如白细胞和红细胞等,而血管来源细胞的比率主要取决于个体出血的多少。在CAL中,不需经过人工的分选及培养,直接将分离的新鲜的自体SVF用来做脂肪移植补充物[11-12]。另外,有研究指出新鲜分离的脂肪干细胞与培养增殖的干细胞相比可能在治疗方面更具有安全性和有效性[4,13]。现在正在进行的一些临床试验也经常应用新鲜分离的SVF,而不是纯化或培养的ASCs。因为SVF包含其他细胞,如血管内皮细胞或巨噬细胞等,许多研究发现它们之间有一种协同效应[14-16]。
3ASCs在脂肪移植中的作用
脂肪移植后脂肪组织的存活和萎缩的机制并未得到证明。移植后无微血管的脂肪组织被安置于异位组织中―相对缺血区,最初几天的营养灌注来自于宿主组织周围组织,直到形成新的微血管。对于损伤的反应,损伤的宿主组织,特别是细胞外基质和死亡的细胞会释放FGF[16]。在修复过程中,脂肪细胞(对缺氧很敏感)在氧压低于其阈值的情况下24h内可能死亡。但是ASCs更能耐受缺氧,其在缺氧情况下可保持功能72h[17]。在动物模型的缺血再灌注损伤的脂肪组织中,ASCs在脂肪移植的修复过程中及在脂肪化和血管化中起着重要的作用[18],其可调节周围组织中生长激素及细胞因子的释放[19],并通过分泌各种生长因子如VEGF,IGF-1防止细胞凋亡[20],使脂肪组织的再生和凋亡达到平衡。
ASCs存在于脂肪细胞之间、血管壁、结缔组织中,但大部分聚集在血管周围。其在缺氧条件下可释放血管形成因子[21-22],并可分化为血管内皮细胞[23-24],表现为成血管特性,成为治疗局部缺血性疾病血管发生的最理想细胞来源。一些研究表明存在血管壁的细胞群落可分化为血管[25-26]。最近发现大鼠的脂肪祖细胞像血管管壁细胞一样存在于脂肪组织的血管中[27]。因此,ASCs被认为是一种脂肪细胞和血管细胞的双重祖细胞。ASCs可为脂肪组织的转归和下一代的再生提供原始细胞,脂肪组织细胞凋亡后可被ASCs来源的下一代细胞取代[6-7]。脂肪组织会随着发育、肥胖而增殖,也会随着老龄化、缺血而发生萎缩,还可在损伤后修复、缺血再灌注的损伤及脂肪移植后起到塑形作用。发生这些塑形过程可能是因为脂肪细胞的凋亡坏死和ASCs引起的脂肪化之间的失衡,在这些变化过程中同时也伴随着微血管的重塑。同时,Caplan[28]也指出脂肪组织随着年龄的增长而萎缩可能由于ASCs的减少,凋亡和再生失去了平衡。一些前期的研究还发现即使存活的脂肪细胞在移植的最初几个月内也会发生死亡并被下一代细胞所取代,其原因可能由于局部缺血。因此,有功能的ASCs的数量可能在组织修复和塑形中具有重要作用。
4ASCs在细胞辅助的脂肪移植术(CAL)中的作用
CAL技术是将新抽取脂肪分成两份:一份用来提取SVF,另一份作为提取的细胞外基质,两部分联合注射于受区[12]。Sterodimas[10]指出吸脂的脂肪组织与完整脂肪组织相比, ASCs的数量只有原来的一半。其原因可能是因为一部分ASCs停留在大血管周围或留在受体组织中,一部分ASCs释放入吸脂脂肪的液体成分中[12]。这种低ASCs比率可能是移植的脂肪组织长时间后萎缩的主要原因。最近的研究表明[10,29-30]脂肪来源干细胞辅助治疗可提高存活脂肪组织的体积和质地。在CAL中[31-32],脂肪组织可作为有活力的生物支架,使新鲜的包含ASCs的SVF粘附于脂肪组织上,不仅增加了前体细胞的数量,还有利于组织血管的形成和ASCs向脂肪组织的转归,提高了脂肪组织的成活率。Yoshimura[32]认为ASCs在CAL中的作用可能是:①分化成脂肪细胞并促进脂肪再生;②分化成血管内皮细胞和壁细胞,以促进血管化作用;③在缺氧、损伤等条件下可促进血管生长因子释放,如肝细胞生长因子(HGF), 基质细胞衍生因子-1(SDF-1);④最有可能的就是ASCs作为原始的ASCs而成活。
5ASCs的临床应用现状
Ogawa[33]指出干细胞在临床上的应用应考虑三方面的因素:①如何在无损伤的条件下获取、处理及增殖细胞,操作的简单性及高效性等;②如何使干细胞分化成所需细胞及如何建立起有效的三维组织结构;③如何保证分化后细胞的存活及组织的再生,因为组织再生必须具有一定的脉管系统来保证组织和分化后细胞的存活。而脂肪来源干细胞可分化为内皮细胞和脂肪细胞,促进血管和脂肪组织的形成,并且来源丰富、操作简单,可满足软组织填充的基本要求。临床前研究及早期的临床研究也指出ASCs复合可注射型支架材料可作为软组织填充物应用于整形外科中[30]。目前,欧洲和亚洲已有许多国家已经开始利用人类ASCs构建组织工程脂肪组织,用于修复软组织的缺损。
Yoshimura[32]是首位将ASCs的临床经验公布的作者,2003～2008年,Yoshimura 等[34]利用细胞辅助的吸脂术进行了临床研究,共做了307例患者(女性303例、男性4例),乳房手术269例(177例隆胸术,52例乳房植入物替代术和40例乳房切除术后再造)面部手术48例(3例红斑狼疮,2例Romberg病和1例硬皮病),臀部4例,手部3例。结果显示患者对移植后皮肤的自然纹理、柔软度、软组织填充后的塑形等都很满意。3D检测显示隆胸后移植物存活率在40%～80%[31],CT及MRI显示脂肪组织存活很好,在乳房腺体周围及腺体和胸肌之间形成了一定厚度的脂肪层。在面部脂肪萎缩的治疗中,其有效性得到了充分的证实,另外,CAL在治疗半侧颜面萎缩及深部红斑狼疮中也有明显的效果[34]。但是在临床试验中,有2例患者注射SVF后3个月发生了异位的纤维组织形成,CT显示皮下脂肪层中有纤维组织形成。这种结果可能由于微环境的变化使ASCs产生了非必要的细胞分化,Yoshimura [35]指出为了避免这种情况,ASCs尽量与脂肪组织充分粘附,使其向必需细胞方向转化。在临床上,ASCs也被应用于治疗其他疾病,如急性心肌梗死、周围血管疾病、软组织及骨骼的缺损、皮肤损伤等,结果表明都有很好的治疗效果[38]。CAL也被应用于放疗后并发症的治疗,临床结果显示所有患者的症状都有明显的改善,其原因可能是由于组织血管的形成和器官功能的恢复[37]。
综上所述,新鲜分离的SVF含有丰富的脂肪来源干细胞,血管内皮细胞等前体细胞。在CAL中它与其他细胞相互影响并通过自分泌,分泌多种促血管化的细胞因子,可增加组织的血管化程度,改善移植物的质地,极大地提高了脂肪移植的存活率。虽然自体脂肪移植的安全性和长期有效性等有待进一步的评估,其作用机制也有待进一步的研究,但笔者相信由于SVF复合自体脂肪移植独特的优越性,其必将在整形美容外科领域成为一种理想的软组织填充物。
[参考文献]
[1]Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,et al.Multilineage Cells from Human Adipose Tissue:Implications for Cell-Based Therapies[J].Tissue Eng,2001,7(2):211-226.
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[收稿日期]2010-05-09[修回日期]2010-06-30
编辑/李阳利