EXPERI MENT &TECHNOLO GY
几种海洋微藻的无菌化培养*
AXENIZATIO N OF SEVERAL MARINE MICR OAL GAL CU LTURES
林伟
(中国科学院海洋研究所青岛266071)
关键词海洋微藻, 抗生素, 除菌
纯种培养对研究海洋微藻的营养学、
物化学等是必不可少的。, , 无菌纯藻种的获得, 。笔者利用微藻比细菌具有更强的抗生素耐受性的特点, 以抗生素为工具排除微藻培养液中的细菌, 成功获得了几种无菌海洋微藻纯藻种, 并对除菌中应注意的问题进行了初步探讨。
, 取0. 1m l 涂布于2216E 平板,
15d 。从涂布每种微藻的平板上挑取具有
不同形态特征的菌落划线纯化后于2216E 斜面培养
) 。将这些菌株以无菌海水制成菌悬液(约48h (22℃
10个/m l ) , 取0. 1m l 涂布于2216E 平板, 将各含青
7
霉素、链霉素、庆大霉素及卡那霉素的纸片(直径5. 5
mm , 抗生素浓度为25IU/片) 平贴于平板表面, 平板
置于15℃过夜。22℃培养3d 。记录纸片周围抑菌圈直径。选择抑菌圈直径≥20mm 的抗生素为除菌工具。
1. 2. 2抗生素除菌
1
1. 1
材料与方法
藻种来源及培养方法
供除菌用藻种于1994年7月至1999月3月取
根据1. 2. 1, 选取合适的抗
生素按两种程序对各微藻进行无菌化处理。(1) 抗生素逐种加入:100m l 处于指数生长后期的各微藻培养液内加入青霉素(藻培养液内最终浓度为1000IU/
m l ) , 培养3d ; 将10m l 青霉素处理过的微藻加入90m l 无菌L 1培养液内, 按藻培养液内1000IU/m l 加入
自本所种质库及环保室, 系中肋骨条藻(Skeletonema
costatum ) 、微小原甲藻(Pr or ocentrum minimum ) 、锥状斯
克利普藻(Scr i pp siella tr ochoidea ) 、褐胞藻(Phaeoc y stis
p ouchetii ) 、前沟藻
(Am p hidinium s p . )
[2]
及扁藻
庆大霉素, 培养3d ; 将10m l 经上述两种抗生素处理过的微藻加入90m l 无菌L 1培养液内, 按藻培养液内
1000IU/m l 加入卡那霉素, 培养3d ; 然后转无菌L 1
(Plat y monas s p . ) 1040品系。
微藻培养液为L 1, 灭菌后备用。培养温度为
20±1℃, 光照度为30001x , 光暗比为L ∶D =14h ∶10h 。在藻种传代及培养过程中, 均严格遵循无菌操
培养液培养, 观察微藻生长状况。在每种抗生素处理3
d 后, 取1m l 微藻培养液加入5m l 2216E 内作细菌培(2) 抗生素混和加入:将青霉
养检测(20℃培养30d ) 。
作规则。
1. 2微藻培养液中细菌排除方法
1. 2. 1
素、庆大霉素及卡那霉素同时加入100m l 处于指数生长后期的各微藻中(各种抗生素最终浓度均为500
IU/m l
) , 培养3d ; 将10m l 经抗生素处理过的微藻加
抗生素选择(1) 抗生素对待除菌微藻
生长影响的实验:将青霉素、氯霉素、链霉素、庆大霉素及卡那霉素以藻培养液内50,100,500,1000IU/m l 的浓度分别加入各为50m l 的处于生长初期的待除菌微藻培养液内, 培养6d 。利用血球计数器计数藻细胞密度。同时以未加抗生素的微藻为对照。选取对微藻生长无明显影响的进行下一步实验。(2) 微藻培养液中细菌对抗生素敏感性实验:将处于指数生长后期
*国家自然科学基金资助项目39870574号, 农业部重点科
研项目渔[1**********]206号;
中国科学院海洋研究所调查研究报告第4012号。收稿日期:2000204212; 修回日期:2000204229
海洋科学/2000年/第24卷/第10期
入90m l 无菌L 1培养液内, 追加上述组合抗生素一次, 培养3d ; 3d 后转无菌L 1培养液培养, 观察微藻生长状况。每次抗生素处理3d 后, 做细菌培养检测
(方法同上) 。
1. 4. 1细菌检测培养基2216E 固、液体培
养基; 改进L 1培养基:蛋白胨1g , 酵母膏0. 2g ,L 1培养液1000m l 。
1. 4. 2
真菌检测培养基葡萄糖酵母膏固、液
1. 3无菌检验
经两种除菌程序处理的各微藻通过细菌培养初
体培养基[3]。
步认定无菌后, 再经5次传代培养(按1∶9接种, 各代培养10d ) , 彻底消除残留抗生素影响, 进行无菌检验。
1. 3. 1
2
2. 1
结果与讨论
微藻除菌
2. 1. 1
, 氯霉素在
培养法(1) 取已排除抗生素影响的微
50m l 时, 6(藻
藻培养液0. 1m l 涂布2216E 及真菌培养基平板(每种微藻涂布三板) , 密封平板, 20℃培养30d , 无细菌及真菌菌落出现。(2) m l 加入各为5m l 基内,20℃, (同未加藻) 1. 3. 2
10; 而其他4种抗生素时也对各待除菌微藻的生长影响(75%以上) , 可用于微藻除菌中。通过平板分离纯化方法, 获得26株与微藻共存的细菌, 其中扁藻1040培养液内4株(A1～A4) , 中肋骨条藻培养液内4株(B1～B4) , 微小原甲藻培养内5株(C1～C5) , 锥状斯克利普藻培养液内4株
(D1～D4) , 前沟藻培养液内4株(E1～E4) , 褐胞藻培
取1m l 已排除抗生素影响的
微藻培养液用吖啶橙染色3m in (吖啶橙最终浓度为
0. 01%) , 抽滤于直径25mm 孔径为0. 2μm 的无菌无
养液内5株(F1～F5) 。它们对抗生素的药敏测试的结果表明(见表1) , 链霉素抑菌圈直径无一超过20mm , 弃之。而青霉素、庆大霉素及卡那霉素均可对每种微藻培养液内至少一株细菌具有明显的抑制作用(抑菌圈直径≥20
mm ) , 选择它们做为排除微藻培养液内细菌的工具。
颗粒的黑色核孔滤膜上。将滤膜置于载玻片上, 滴加一滴无自发荧光的显微镜油, 加盖玻片, 以落射荧光显微镜镜检有无细菌及真菌存在迹象。
1. 4微生物检测培养基
2. 1. 2细菌排除(1) 抗生素逐种加入
:实验结内仍有细菌存在;6种微藻生长良好。(2) 抗生素混和加入:实验结果表明混合抗生素只处理一次, 6种微藻培养液内都有细菌存在; 处理两次后, 经细菌培养检测初步认定扁藻1040、中肋骨条藻、锥状斯克利普藻、微小原甲藻及前沟藻已无菌化; 微小原甲藻生长受到严重抑制(培养40d , 未发现藻生长迹象) , 其他5种微藻生长良好。褐胞藻在混和抗生素连续处理3次
果表明, 仅经青霉素、庆大霉素处理的6种微藻内都有细菌存在(褐胞藻加入庆大霉素3d 后立刻进行细菌培养检测, 发现无细菌存在迹象; 传代3次后, 细菌培养检测却表明藻培养液内又出现了细菌) ; 只有在加入卡那霉素后, 经细菌培养才可初步认为微小原甲藻、前沟藻及褐胞藻已无菌化, 其他3种微藻培养液
M arine S ciences/V ol. 24,N o. 10/2000
后(每隔3d 加混和抗生素于未传代的同一培养液) , 其培养液内细菌仍未有效排除。以上情况表明, 高浓度的抗生素合用后对微小原甲藻的生长影响很大(虽然抗生素逐种加入过程中, 微藻细胞也会遭遇不止一种抗生素, 但先加入的抗生素经微藻传代而被稀释, 且已过了数日, 可能使抗生素协同抑制藻生长的能力大大下降) ; 抗生素的合用也使排除褐胞藻培养液内细菌的能力下降, 后经过补充实验发现各为1000IU/
m l 的上述3种抗生素合用不能将褐胞藻培养液中的
的抗生素; 而干扰细菌蛋白质合成的, 如庆大霉素及卡那霉素等氨基环醇类抗生素应后加。根据这一技术路线, 他们成功获得无菌的微藻Micr omonas p usilla 藻种。虽然如此, 仍有许多文献报道不同作用机制的抗生素合用也可以有效地排除微藻培养液内的细菌(如
Droo p , 1967; Divan 等, 1982; Boczar 等, 1988; Dou g las 等,1993;Chinain 等,1995所报道的) 。因此, 当抗生素
逐种加入法除菌效果不理想时, 合用法。, 。但抗生素合用于某些微藻, 。另外, 微小原甲藻对合用抗生素耐受性的下降, 也表明这种方法有其不足之外。总之, 由于各微藻间以及以微藻为基础的各细菌群落间存在的差异, 表明不可能有一种应用于所有微藻的有效除菌方法, 具体情况应具体分析。
2. 3. 3
细菌完全排除, 进一步表明抗生素间确实存在相互拮抗; 只有前沟藻可以经两种除菌程序处理为无菌藻种。
2. 2无菌检验
, 6, 种微藻无菌化获得成功, (真菌培养基中加入浓度各为100
IU/m l 的青霉素及庆大霉素) , 结果表明6种微藻培养
液中均无真菌, 否则要利用制霉菌素或两性霉素B 等排除真菌。
关于无菌检验目前尚无一种通用的
无菌检验方法。在做微生物培养检验时, 应采用多种培养基同时进行, 以增加发现未除掉的微生物的机率。最新研究结果表明, 抗生素可“钝化”微藻培养液内某些细菌, 使其处于一种不可培养状态; 当消除抗生素的影响后, 这类细菌会恢复生长
M. J. et al. . In :Harm ful Al g al Blooms T asm ania , 2000, 115
F er g uson G . (Abstracts ) .
2. 3微藻无菌化中应注意的问题
2. 3. 1
关于除菌用抗生素理想的抗生素应
具备两个特征:(1) 具有高效抑(杀) 菌活性; (2) 对微藻细胞毒性低。由于抗生素的抗菌谱存在差异以及各微藻液中细菌群落结构特征不同, 决定了不可能存在一种可用于所有微藻除菌的抗生素。因此为了提高除菌效果, 尽量降低耐药菌株出现的机率, 有必要采用药敏测试方法选择除菌抗生素。其次, 还应该进行待除菌微藻对除菌抗生素耐受性实验, 否则在除菌过程中会发生微藻细胞受到损伤及其生长被抑制的情况。总之, 要选择合适的抗生素浓度及处理时间, 如作者在此次微藻除菌实验时即采用藻细胞可耐受的较高的抗生素浓度(500～1000IU/m l ) 及较短的处理时
间(3d ) 以免出现耐药菌株和影响微藻生长。
2. 3. 2
。作者在对褐胞藻除菌时也发
现了类似情况, 因此, 在无菌检测前应通过多次传代培养以完全排除残留抗生素, 为可能存在的已“钝化”的细菌恢复生长创造条件。即便如此, 经抗生素处理后的微藻培养液中仍然可能存在着不能培养的细菌, 还必须进行镜检。荧光显微镜因能有效地检测出经吖啶橙染色后水样中的细菌, 成为无菌镜检的首选。总之, 应采取多种方法进行无菌检验
, 确保实验结果准确可靠参考文献
12
关于抗生素除菌方法青霉素通过抑
制细胞壁的合成引起溶菌, 它对生长旺盛的细菌有明显效果, 而对静息细胞不明显; 庆大霉素及卡那霉素则通过干扰蛋白质合成抑制细菌生长, 此类抗生素在高浓度时也具有杀菌效果[1]。C ottrell 等1993年认为作用机制的不同可能导致合用抗生素间产生拮抗, 因此他们在微藻除菌中采用了逐种抗生素加入法:根据青霉素的作用特性, 将其做为第1种加入微藻培养液
王岳、方金瑞。抗生素。北京:科学出版社,1988。76～116
G uillar d , R. R. L. . Culture m ethods. In :H alle g raeff , G . M. , et al., M anual on H arm ful M arine M icroal g ae. P aris :UNESCO’s W orksho p s , 1995. 45～62
3K ohlm e y er , J. an d K ohlm e y er , E. . M arine M y colo gy . New Y ork :Academ ic Press , 1979. 20
(本文编辑:张培新)
海洋科学/2000年/第24卷/第10期
EXPERI MENT &TECHNOLO GY
几种海洋微藻的无菌化培养*
AXENIZATIO N OF SEVERAL MARINE MICR OAL GAL CU LTURES
林伟
(中国科学院海洋研究所青岛266071)
关键词海洋微藻, 抗生素, 除菌
纯种培养对研究海洋微藻的营养学、
物化学等是必不可少的。, , 无菌纯藻种的获得, 。笔者利用微藻比细菌具有更强的抗生素耐受性的特点, 以抗生素为工具排除微藻培养液中的细菌, 成功获得了几种无菌海洋微藻纯藻种, 并对除菌中应注意的问题进行了初步探讨。
, 取0. 1m l 涂布于2216E 平板,
15d 。从涂布每种微藻的平板上挑取具有
不同形态特征的菌落划线纯化后于2216E 斜面培养
) 。将这些菌株以无菌海水制成菌悬液(约48h (22℃
10个/m l ) , 取0. 1m l 涂布于2216E 平板, 将各含青
7
霉素、链霉素、庆大霉素及卡那霉素的纸片(直径5. 5
mm , 抗生素浓度为25IU/片) 平贴于平板表面, 平板
置于15℃过夜。22℃培养3d 。记录纸片周围抑菌圈直径。选择抑菌圈直径≥20mm 的抗生素为除菌工具。
1. 2. 2抗生素除菌
1
1. 1
材料与方法
藻种来源及培养方法
供除菌用藻种于1994年7月至1999月3月取
根据1. 2. 1, 选取合适的抗
生素按两种程序对各微藻进行无菌化处理。(1) 抗生素逐种加入:100m l 处于指数生长后期的各微藻培养液内加入青霉素(藻培养液内最终浓度为1000IU/
m l ) , 培养3d ; 将10m l 青霉素处理过的微藻加入90m l 无菌L 1培养液内, 按藻培养液内1000IU/m l 加入
自本所种质库及环保室, 系中肋骨条藻(Skeletonema
costatum ) 、微小原甲藻(Pr or ocentrum minimum ) 、锥状斯
克利普藻(Scr i pp siella tr ochoidea ) 、褐胞藻(Phaeoc y stis
p ouchetii ) 、前沟藻
(Am p hidinium s p . )
[2]
及扁藻
庆大霉素, 培养3d ; 将10m l 经上述两种抗生素处理过的微藻加入90m l 无菌L 1培养液内, 按藻培养液内
1000IU/m l 加入卡那霉素, 培养3d ; 然后转无菌L 1
(Plat y monas s p . ) 1040品系。
微藻培养液为L 1, 灭菌后备用。培养温度为
20±1℃, 光照度为30001x , 光暗比为L ∶D =14h ∶10h 。在藻种传代及培养过程中, 均严格遵循无菌操
培养液培养, 观察微藻生长状况。在每种抗生素处理3
d 后, 取1m l 微藻培养液加入5m l 2216E 内作细菌培(2) 抗生素混和加入:将青霉
养检测(20℃培养30d ) 。
作规则。
1. 2微藻培养液中细菌排除方法
1. 2. 1
素、庆大霉素及卡那霉素同时加入100m l 处于指数生长后期的各微藻中(各种抗生素最终浓度均为500
IU/m l
) , 培养3d ; 将10m l 经抗生素处理过的微藻加
抗生素选择(1) 抗生素对待除菌微藻
生长影响的实验:将青霉素、氯霉素、链霉素、庆大霉素及卡那霉素以藻培养液内50,100,500,1000IU/m l 的浓度分别加入各为50m l 的处于生长初期的待除菌微藻培养液内, 培养6d 。利用血球计数器计数藻细胞密度。同时以未加抗生素的微藻为对照。选取对微藻生长无明显影响的进行下一步实验。(2) 微藻培养液中细菌对抗生素敏感性实验:将处于指数生长后期
*国家自然科学基金资助项目39870574号, 农业部重点科
研项目渔[1**********]206号;
中国科学院海洋研究所调查研究报告第4012号。收稿日期:2000204212; 修回日期:2000204229
海洋科学/2000年/第24卷/第10期
入90m l 无菌L 1培养液内, 追加上述组合抗生素一次, 培养3d ; 3d 后转无菌L 1培养液培养, 观察微藻生长状况。每次抗生素处理3d 后, 做细菌培养检测
(方法同上) 。
1. 4. 1细菌检测培养基2216E 固、液体培
养基; 改进L 1培养基:蛋白胨1g , 酵母膏0. 2g ,L 1培养液1000m l 。
1. 4. 2
真菌检测培养基葡萄糖酵母膏固、液
1. 3无菌检验
经两种除菌程序处理的各微藻通过细菌培养初
体培养基[3]。
步认定无菌后, 再经5次传代培养(按1∶9接种, 各代培养10d ) , 彻底消除残留抗生素影响, 进行无菌检验。
1. 3. 1
2
2. 1
结果与讨论
微藻除菌
2. 1. 1
, 氯霉素在
培养法(1) 取已排除抗生素影响的微
50m l 时, 6(藻
藻培养液0. 1m l 涂布2216E 及真菌培养基平板(每种微藻涂布三板) , 密封平板, 20℃培养30d , 无细菌及真菌菌落出现。(2) m l 加入各为5m l 基内,20℃, (同未加藻) 1. 3. 2
10; 而其他4种抗生素时也对各待除菌微藻的生长影响(75%以上) , 可用于微藻除菌中。通过平板分离纯化方法, 获得26株与微藻共存的细菌, 其中扁藻1040培养液内4株(A1～A4) , 中肋骨条藻培养液内4株(B1～B4) , 微小原甲藻培养内5株(C1～C5) , 锥状斯克利普藻培养液内4株
(D1～D4) , 前沟藻培养液内4株(E1～E4) , 褐胞藻培
取1m l 已排除抗生素影响的
微藻培养液用吖啶橙染色3m in (吖啶橙最终浓度为
0. 01%) , 抽滤于直径25mm 孔径为0. 2μm 的无菌无
养液内5株(F1～F5) 。它们对抗生素的药敏测试的结果表明(见表1) , 链霉素抑菌圈直径无一超过20mm , 弃之。而青霉素、庆大霉素及卡那霉素均可对每种微藻培养液内至少一株细菌具有明显的抑制作用(抑菌圈直径≥20
mm ) , 选择它们做为排除微藻培养液内细菌的工具。
颗粒的黑色核孔滤膜上。将滤膜置于载玻片上, 滴加一滴无自发荧光的显微镜油, 加盖玻片, 以落射荧光显微镜镜检有无细菌及真菌存在迹象。
1. 4微生物检测培养基
2. 1. 2细菌排除(1) 抗生素逐种加入
:实验结内仍有细菌存在;6种微藻生长良好。(2) 抗生素混和加入:实验结果表明混合抗生素只处理一次, 6种微藻培养液内都有细菌存在; 处理两次后, 经细菌培养检测初步认定扁藻1040、中肋骨条藻、锥状斯克利普藻、微小原甲藻及前沟藻已无菌化; 微小原甲藻生长受到严重抑制(培养40d , 未发现藻生长迹象) , 其他5种微藻生长良好。褐胞藻在混和抗生素连续处理3次
果表明, 仅经青霉素、庆大霉素处理的6种微藻内都有细菌存在(褐胞藻加入庆大霉素3d 后立刻进行细菌培养检测, 发现无细菌存在迹象; 传代3次后, 细菌培养检测却表明藻培养液内又出现了细菌) ; 只有在加入卡那霉素后, 经细菌培养才可初步认为微小原甲藻、前沟藻及褐胞藻已无菌化, 其他3种微藻培养液
M arine S ciences/V ol. 24,N o. 10/2000
后(每隔3d 加混和抗生素于未传代的同一培养液) , 其培养液内细菌仍未有效排除。以上情况表明, 高浓度的抗生素合用后对微小原甲藻的生长影响很大(虽然抗生素逐种加入过程中, 微藻细胞也会遭遇不止一种抗生素, 但先加入的抗生素经微藻传代而被稀释, 且已过了数日, 可能使抗生素协同抑制藻生长的能力大大下降) ; 抗生素的合用也使排除褐胞藻培养液内细菌的能力下降, 后经过补充实验发现各为1000IU/
m l 的上述3种抗生素合用不能将褐胞藻培养液中的
的抗生素; 而干扰细菌蛋白质合成的, 如庆大霉素及卡那霉素等氨基环醇类抗生素应后加。根据这一技术路线, 他们成功获得无菌的微藻Micr omonas p usilla 藻种。虽然如此, 仍有许多文献报道不同作用机制的抗生素合用也可以有效地排除微藻培养液内的细菌(如
Droo p , 1967; Divan 等, 1982; Boczar 等, 1988; Dou g las 等,1993;Chinain 等,1995所报道的) 。因此, 当抗生素
逐种加入法除菌效果不理想时, 合用法。, 。但抗生素合用于某些微藻, 。另外, 微小原甲藻对合用抗生素耐受性的下降, 也表明这种方法有其不足之外。总之, 由于各微藻间以及以微藻为基础的各细菌群落间存在的差异, 表明不可能有一种应用于所有微藻的有效除菌方法, 具体情况应具体分析。
2. 3. 3
细菌完全排除, 进一步表明抗生素间确实存在相互拮抗; 只有前沟藻可以经两种除菌程序处理为无菌藻种。
2. 2无菌检验
, 6, 种微藻无菌化获得成功, (真菌培养基中加入浓度各为100
IU/m l 的青霉素及庆大霉素) , 结果表明6种微藻培养
液中均无真菌, 否则要利用制霉菌素或两性霉素B 等排除真菌。
关于无菌检验目前尚无一种通用的
无菌检验方法。在做微生物培养检验时, 应采用多种培养基同时进行, 以增加发现未除掉的微生物的机率。最新研究结果表明, 抗生素可“钝化”微藻培养液内某些细菌, 使其处于一种不可培养状态; 当消除抗生素的影响后, 这类细菌会恢复生长
M. J. et al. . In :Harm ful Al g al Blooms T asm ania , 2000, 115
F er g uson G . (Abstracts ) .
2. 3微藻无菌化中应注意的问题
2. 3. 1
关于除菌用抗生素理想的抗生素应
具备两个特征:(1) 具有高效抑(杀) 菌活性; (2) 对微藻细胞毒性低。由于抗生素的抗菌谱存在差异以及各微藻液中细菌群落结构特征不同, 决定了不可能存在一种可用于所有微藻除菌的抗生素。因此为了提高除菌效果, 尽量降低耐药菌株出现的机率, 有必要采用药敏测试方法选择除菌抗生素。其次, 还应该进行待除菌微藻对除菌抗生素耐受性实验, 否则在除菌过程中会发生微藻细胞受到损伤及其生长被抑制的情况。总之, 要选择合适的抗生素浓度及处理时间, 如作者在此次微藻除菌实验时即采用藻细胞可耐受的较高的抗生素浓度(500～1000IU/m l ) 及较短的处理时
间(3d ) 以免出现耐药菌株和影响微藻生长。
2. 3. 2
。作者在对褐胞藻除菌时也发
现了类似情况, 因此, 在无菌检测前应通过多次传代培养以完全排除残留抗生素, 为可能存在的已“钝化”的细菌恢复生长创造条件。即便如此, 经抗生素处理后的微藻培养液中仍然可能存在着不能培养的细菌, 还必须进行镜检。荧光显微镜因能有效地检测出经吖啶橙染色后水样中的细菌, 成为无菌镜检的首选。总之, 应采取多种方法进行无菌检验
, 确保实验结果准确可靠参考文献
12
关于抗生素除菌方法青霉素通过抑
制细胞壁的合成引起溶菌, 它对生长旺盛的细菌有明显效果, 而对静息细胞不明显; 庆大霉素及卡那霉素则通过干扰蛋白质合成抑制细菌生长, 此类抗生素在高浓度时也具有杀菌效果[1]。C ottrell 等1993年认为作用机制的不同可能导致合用抗生素间产生拮抗, 因此他们在微藻除菌中采用了逐种抗生素加入法:根据青霉素的作用特性, 将其做为第1种加入微藻培养液
王岳、方金瑞。抗生素。北京:科学出版社,1988。76～116
G uillar d , R. R. L. . Culture m ethods. In :H alle g raeff , G . M. , et al., M anual on H arm ful M arine M icroal g ae. P aris :UNESCO’s W orksho p s , 1995. 45～62
3K ohlm e y er , J. an d K ohlm e y er , E. . M arine M y colo gy . New Y ork :Academ ic Press , 1979. 20
(本文编辑:张培新)
海洋科学/2000年/第24卷/第10期