实验11 柑橘皮化学成分分析
一、实验目的
1．掌握水溶性性和脂溶性成分的提取方法。
2．掌握碘量法测定维生素C 含量。
3．掌握建立HPLC 混合物分离的色谱条件，并以外标法测定相关物质的含量。
4．掌握建立GC 混合物分离的色谱条件，并以外标法测定相关物质的含量。
二、实验原理
柑橘皮是柑橘果实加工后余留的最大比例副产品，其内含丰富的生理活性成分以及磷、钙、铁、锌等微量元素。中医观点认为：柑橘皮味辛、苦、性温，其功能主要为化痰止咳、理气止痛，可入药。其所含营养成分除氨基酸外，其余均高于果肉，尤其是富含具有一定生理活性成分如维生素C 、类黄酮、类胡萝卜素等物质，使柑橘皮及其提取物具有多重生理功效。
维生素C 是可溶于水的无色结晶，是一种分子结构最简单的维生素。维生素C 有防治坏血病的功能，所以在医药上常把它叫做抗坏血酸。滴定法是维生素C 含量测定最主要的方法，滴定法主要有2，6一二氯靛酚滴定法和碘量法，前者更加简便。染料2,6－二氯靛酚的颜色反应表现两种特性：一是取决于其氧化还原状态，氧化态为深蓝色，还原态变为无色；二是受其介质的酸度影响, 在碱性溶液中呈深蓝色，在酸性介质中呈浅红色。用蓝色的碱性染料标准溶液，对含维生素C 的酸性浸出液进行氧化还原滴定，染料被还原为无色, 当到达滴定终点时，多余的染料在酸性介质中则表现为浅红色，由染料用量计算样品中还原型抗坏血酸的含量。
柑橘皮中的微量金属元素主要有钾、钙、铁、锌等，这些金属离子的含量测定可以原子吸收光谱法测定。待测的柑橘皮的提取液在空气-乙炔火焰中原子化，在光路中分别测定钾、钙、铁、锌等对特定波长谱线的吸收。含量计算需要先建
立各个金属的标准工作曲线。在测定钙离子时，需要加入镧作释放剂，以消除磷酸等的干扰。
黄酮类化合物是一类具有C6一C3一C6 结构的酚类化合物的总称，目前已从柑橘中鉴定出来的黄酮类化合物有6O 余种，最常见的为橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素芸香苷等二氢黄酮类。橙皮苷是目前柑橘属黄酮中最主要的研究对象，橙皮苷（又称陈皮苷或桔皮苷）为二氢黄酮苷类化合物，是橙皮素与葡萄糖和鼠李糖结合形成的苷类。由于橙皮苷和Al(NO3) 3溶液在80℃反应15min 后能形成黄色络合物，通过波长扫描，可测其420nm 有最大吸收，通过橙皮苷对照品的系列溶液得到工作曲线后，进行样品中橙皮苷含量的测定。
柑橘皮中含有多种香精油，其中含量最大的4种香精油分别是：柠檬烯，beta-蒎烯，芳樟醇，乙酸芳樟醇。这四种成分沸点不高，受热基本稳定，可用GC 进行含量测定。
上述四种成分的标准品可在GC-FID 上得到有效分离和检测，可通过外标法对被测溶液中的上述四种成分进行定量计算。
柑橘皮中含量最大的一种类胡萝卜素是叶黄素，其化学结构如下表所示。这种类胡萝卜素可在HPLC 上进行有效的分离，并用对照品通过外标法进行柑橘皮中的含量测定。
三、实验步骤
3.1 2%HCl 萃取维生素C 及以及金属离子：
柑橘皮晒干研碎，称量，加2%HCl成浆状，定容，纱布过滤，抽滤，滤液用白陶土吸附色素后，用于维生素C 含量测定以及金属离子的含量测定。
3.2 维生素C 含量测定：
抗坏血酸标准溶液(1mg/ml):称取 100mg(准确至 0.1mg)抗坏血酸, 溶于2% HCl 中并稀至100ml 。现配现用。
2,6－二氯靛酚溶液:称取碳酸氢钠 52mg溶解在200ml 热蒸馏水中, 然后称取 2,6－二氯靛酚50mg 溶解在上述碳酸氢钠溶液中。冷却定容至250ml, 过滤至棕色瓶内, 保存在冰箱中。每次使用前, 用标准抗坏血酸标定其滴定度。即吸取1ml 抗坏血酸标准溶液于50ml 锥形瓶中, 加入10ml 浸提剂, 摇匀, 用2 ,6－二氯靛酚溶液滴定至溶液呈粉红色15s 不褪色为止。同时, 另取 10ml 浸提剂做空白试验。
滴定度 T(mg/ml)＝C·V/（V1－V2）
式中: T—每毫升2,6－二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数;
C —抗坏血酸的浓度,mg/ml; V—─吸取抗坏血酸的体积, ml;
V1—滴定抗坏血酸溶液所用 2,6－二氯靛酚溶液的体积,ml;
V2—滴定空白所用2,6－二氯靛酚溶液的体积,ml 。
滴定：吸取10ml 滤液放入50ml 锥形瓶中, 用已标定过的 2,6－二氯靛酚溶液滴定, 直至溶液呈粉红色 15s 不褪色为止。同时做空白试验。
计算：
C(mg/100g)＝(V－V0)·T·A·100/W
式中: V—滴定样液时消耗染料溶液的体积,ml;
V0—滴定空白时消耗染料溶液的体积,ml;
T —2,6－二氯靛酚染料滴定度,mg/ml;
A —稀释倍数; W—样品重量,g 。
结果评价：用算术平均值表示，取三位有效数字，含量低的保留小数点后两位数字。平行测定结果的相对相差，在维生素C 含量大于 20mg/100g时, 不得超过 2%,小于20mg/100g时，不得超过 5%。
3.3 钾、铁、锌含量的测定：
铁标准贮备液（质量浓度1mg/mL）：称取金属铁粉（光谱纯）0.1g ，用1:1硝酸4ml 溶解，用水定容于100ml 的容量瓶中。
锌标准贮备液（质量浓度1mg/mL）：称取金属锌粉（光谱纯）0.1g ，用1:1硝酸4ml 溶解，用水定容于100ml 的容量瓶中。
钙标准贮备液（质量浓度1mg/mL）：称取干燥的碳酸钙(光谱纯)0.25g ，用1:4的盐酸10mL 溶解，并定容于100mL 容量瓶中。
标准工作曲线的绘制：选用灵敏吸收线Fe 248.3nm;Zn213.9nm;Ca422.7nm.用毛细管吸喷2%的盐酸溶液，测定钙时用含镧1mg/ml的体积分数为2%的盐酸调零。分别测定混合标准溶液中各离子的透光率，对各元素含量绘制标准曲线。
样品测定：
铁、锌的测定：将待测液用2%盐酸稀释到一定浓度，直接上机测定。
钙的测定：将待测液用2%盐酸稀释到一定浓度，并加入一定量的镧溶液后上机测定。
计算：
样品中元素含量（mg/100g）=(C1-C 2) ×V ×A ×100/(m×1000)
C 1---- 测定液中元素的浓度（µg/ml）
C 2---- 测定空白液中元素的浓度（µg/ml）
V ---- 样液体积，ml
A --- 稀释倍数
m ---样品的质量，g
结果评价：两次平行测定结果之差不得超过两次测定平均值的 5%。
3.4 乙醇回流提取橙皮苷：
定量橘皮在乙醇中50℃下回流4小时，过滤浓缩，加入饱和的氢氧化钙水溶液，静置过滤，加盐酸调节PH=5-6，静置，离心，沉淀以乙醇和水洗涤后，干燥得到橙皮苷粗品，用于UV 测定橙皮苷的含量。
3.5 橙皮苷含量的测定：
对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的橙皮苷标准品20mg ，用无水乙醇溶解，定容至100ml ，配制成浓度为0.2mg ／ml 的对照品溶液。
最大吸收波长的选择：精密吸取橙皮苷标准液3ml ，加入无水乙醇9ml ，振摇溶解，置于50ml 容量瓶中，静置5min ，再加入5％的 NaNO2溶液2ml ，振摇，静置6min ，加入10％的AI(NO3)3溶液2ml ，振摇，静置6min ，最后加入5％的NaOH 溶液20ml ，振摇，静置15min ．用无水乙醇定容至刻度．以没加入橙皮苷且按照上述相同方法配制的乙醇溶液为空白溶液．在200nm ～700nm 的波长范围内扫描，确定最大吸收波长。
标准曲线的绘制：分别精密量取0．0ml 、2．0ml 、3．0ml 、4．0ml 、5．0ml 、6．0ml 的橙皮苷标准品(0．2mg/m1)储备溶液，按照上述操作方法进行操作．以第一瓶为空白液．在最大波长处测定吸光度值，以 值(y)为横坐标、橙皮苷的含量(x，mg ／m1) 为纵坐标作线性回归，得标准曲线。
样品含量的测定：精密称取供试品浸膏2mg ，加入无水乙醇1 0ml溶解，按上述方法操作，在最大吸收波长处测定吸光度。同时扣除空白。
结果评价：两次平行测定结果之差不得超过两次测定平均值的 5%。
3.6 水蒸气蒸馏提取橘皮香精油:
定量的柑橘皮进行水蒸气蒸馏，得到的油层用无水硫酸钠干燥，以GC-FID 检测其中的4种精油含量。
3.7 GC-FID测定香精油的含量：
柑橘皮中含量最大的4种香精油分别是：柠檬烯，beta-蒎烯，芳樟醇，乙酸芳樟醇。将上述4中对照品配成标准溶液在GC 上分离得到对照品的色谱图，样品进样，按照外标法测定含量。
GC-FID 的色谱条件：
DB-1 非极性毛细管柱，FID 检测器
进样温度：150℃; 检测器温度：250℃;
炉温：80℃停留5min, 8℃/min升温到250℃，停留5min （ 需调整）
3.8 丙酮-乙醚提取类胡萝卜素:
柑橘皮晒干研碎, 称量, 加含0.1%BHT的丙酮提取, 离心, 沉淀用0.1％BHT 的丙酮分2～3次重复提取，至样品无色，合并上清液，减压蒸干，溶于乙醚(含0.1％ BHT) 后，再加10％K0H-甲醇溶液皂化反应3 h；加入10％NaC1使之分层萃取，水相再用乙醚萃取2次，合并乙醚相，蒸馏水反复洗至中性，用无水硫酸钠脱水后, 减压蒸干；用甲醇定容，以高压液相色谱检测3种类胡萝素。
3.9 HPLC测定类胡萝卜素
柑橘皮中含量最大的一种类胡萝卜素是叶黄素。
将上述3中对照品配成标准溶液在HPLC 上分离得到对照品的色谱图，样品进样，按照外标法测定含量。
HPLC 的色谱条件：
C18柱，紫外460nm
甲醇/乙腈/水/磷酸作流动相（ 需调整）
4．参考文献
[1]. 邵伟，熊泽，李昕. 光谱实验室,2005,22(5)
[2]. 陶俊, 张上隆, 中国农业科学2003,36(10)：1202-1208
[3] Bouzouita Nabiha,E1 Omri Abdelfatteh. Journal of Chemistry and Chemical Engineering,2010,29(4); 60-64
[4] 国家药典委员会编．中华人民共和国药典(2005年版) 一部[M]．北京：化学工业出版
[5] GB/T 5413.21-1997
[6] GB/T 821-3-1986
实验11 柑橘皮化学成分分析
一、实验目的
1．掌握水溶性性和脂溶性成分的提取方法。
2．掌握碘量法测定维生素C 含量。
3．掌握建立HPLC 混合物分离的色谱条件，并以外标法测定相关物质的含量。
4．掌握建立GC 混合物分离的色谱条件，并以外标法测定相关物质的含量。
二、实验原理
柑橘皮是柑橘果实加工后余留的最大比例副产品，其内含丰富的生理活性成分以及磷、钙、铁、锌等微量元素。中医观点认为：柑橘皮味辛、苦、性温，其功能主要为化痰止咳、理气止痛，可入药。其所含营养成分除氨基酸外，其余均高于果肉，尤其是富含具有一定生理活性成分如维生素C 、类黄酮、类胡萝卜素等物质，使柑橘皮及其提取物具有多重生理功效。
维生素C 是可溶于水的无色结晶，是一种分子结构最简单的维生素。维生素C 有防治坏血病的功能，所以在医药上常把它叫做抗坏血酸。滴定法是维生素C 含量测定最主要的方法，滴定法主要有2，6一二氯靛酚滴定法和碘量法，前者更加简便。染料2,6－二氯靛酚的颜色反应表现两种特性：一是取决于其氧化还原状态，氧化态为深蓝色，还原态变为无色；二是受其介质的酸度影响, 在碱性溶液中呈深蓝色，在酸性介质中呈浅红色。用蓝色的碱性染料标准溶液，对含维生素C 的酸性浸出液进行氧化还原滴定，染料被还原为无色, 当到达滴定终点时，多余的染料在酸性介质中则表现为浅红色，由染料用量计算样品中还原型抗坏血酸的含量。
柑橘皮中的微量金属元素主要有钾、钙、铁、锌等，这些金属离子的含量测定可以原子吸收光谱法测定。待测的柑橘皮的提取液在空气-乙炔火焰中原子化，在光路中分别测定钾、钙、铁、锌等对特定波长谱线的吸收。含量计算需要先建
立各个金属的标准工作曲线。在测定钙离子时，需要加入镧作释放剂，以消除磷酸等的干扰。
黄酮类化合物是一类具有C6一C3一C6 结构的酚类化合物的总称，目前已从柑橘中鉴定出来的黄酮类化合物有6O 余种，最常见的为橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素芸香苷等二氢黄酮类。橙皮苷是目前柑橘属黄酮中最主要的研究对象，橙皮苷（又称陈皮苷或桔皮苷）为二氢黄酮苷类化合物，是橙皮素与葡萄糖和鼠李糖结合形成的苷类。由于橙皮苷和Al(NO3) 3溶液在80℃反应15min 后能形成黄色络合物，通过波长扫描，可测其420nm 有最大吸收，通过橙皮苷对照品的系列溶液得到工作曲线后，进行样品中橙皮苷含量的测定。
柑橘皮中含有多种香精油，其中含量最大的4种香精油分别是：柠檬烯，beta-蒎烯，芳樟醇，乙酸芳樟醇。这四种成分沸点不高，受热基本稳定，可用GC 进行含量测定。
上述四种成分的标准品可在GC-FID 上得到有效分离和检测，可通过外标法对被测溶液中的上述四种成分进行定量计算。
柑橘皮中含量最大的一种类胡萝卜素是叶黄素，其化学结构如下表所示。这种类胡萝卜素可在HPLC 上进行有效的分离，并用对照品通过外标法进行柑橘皮中的含量测定。
三、实验步骤
3.1 2%HCl 萃取维生素C 及以及金属离子：
柑橘皮晒干研碎，称量，加2%HCl成浆状，定容，纱布过滤，抽滤，滤液用白陶土吸附色素后，用于维生素C 含量测定以及金属离子的含量测定。
3.2 维生素C 含量测定：
抗坏血酸标准溶液(1mg/ml):称取 100mg(准确至 0.1mg)抗坏血酸, 溶于2% HCl 中并稀至100ml 。现配现用。
2,6－二氯靛酚溶液:称取碳酸氢钠 52mg溶解在200ml 热蒸馏水中, 然后称取 2,6－二氯靛酚50mg 溶解在上述碳酸氢钠溶液中。冷却定容至250ml, 过滤至棕色瓶内, 保存在冰箱中。每次使用前, 用标准抗坏血酸标定其滴定度。即吸取1ml 抗坏血酸标准溶液于50ml 锥形瓶中, 加入10ml 浸提剂, 摇匀, 用2 ,6－二氯靛酚溶液滴定至溶液呈粉红色15s 不褪色为止。同时, 另取 10ml 浸提剂做空白试验。
滴定度 T(mg/ml)＝C·V/（V1－V2）
式中: T—每毫升2,6－二氯靛酚溶液相当于抗坏血酸的毫克数;
C —抗坏血酸的浓度,mg/ml; V—─吸取抗坏血酸的体积, ml;
V1—滴定抗坏血酸溶液所用 2,6－二氯靛酚溶液的体积,ml;
V2—滴定空白所用2,6－二氯靛酚溶液的体积,ml 。
滴定：吸取10ml 滤液放入50ml 锥形瓶中, 用已标定过的 2,6－二氯靛酚溶液滴定, 直至溶液呈粉红色 15s 不褪色为止。同时做空白试验。
计算：
C(mg/100g)＝(V－V0)·T·A·100/W
式中: V—滴定样液时消耗染料溶液的体积,ml;
V0—滴定空白时消耗染料溶液的体积,ml;
T —2,6－二氯靛酚染料滴定度,mg/ml;
A —稀释倍数; W—样品重量,g 。
结果评价：用算术平均值表示，取三位有效数字，含量低的保留小数点后两位数字。平行测定结果的相对相差，在维生素C 含量大于 20mg/100g时, 不得超过 2%,小于20mg/100g时，不得超过 5%。
3.3 钾、铁、锌含量的测定：
铁标准贮备液（质量浓度1mg/mL）：称取金属铁粉（光谱纯）0.1g ，用1:1硝酸4ml 溶解，用水定容于100ml 的容量瓶中。
锌标准贮备液（质量浓度1mg/mL）：称取金属锌粉（光谱纯）0.1g ，用1:1硝酸4ml 溶解，用水定容于100ml 的容量瓶中。
钙标准贮备液（质量浓度1mg/mL）：称取干燥的碳酸钙(光谱纯)0.25g ，用1:4的盐酸10mL 溶解，并定容于100mL 容量瓶中。
标准工作曲线的绘制：选用灵敏吸收线Fe 248.3nm;Zn213.9nm;Ca422.7nm.用毛细管吸喷2%的盐酸溶液，测定钙时用含镧1mg/ml的体积分数为2%的盐酸调零。分别测定混合标准溶液中各离子的透光率，对各元素含量绘制标准曲线。
样品测定：
铁、锌的测定：将待测液用2%盐酸稀释到一定浓度，直接上机测定。
钙的测定：将待测液用2%盐酸稀释到一定浓度，并加入一定量的镧溶液后上机测定。
计算：
样品中元素含量（mg/100g）=(C1-C 2) ×V ×A ×100/(m×1000)
C 1---- 测定液中元素的浓度（µg/ml）
C 2---- 测定空白液中元素的浓度（µg/ml）
V ---- 样液体积，ml
A --- 稀释倍数
m ---样品的质量，g
结果评价：两次平行测定结果之差不得超过两次测定平均值的 5%。
3.4 乙醇回流提取橙皮苷：
定量橘皮在乙醇中50℃下回流4小时，过滤浓缩，加入饱和的氢氧化钙水溶液，静置过滤，加盐酸调节PH=5-6，静置，离心，沉淀以乙醇和水洗涤后，干燥得到橙皮苷粗品，用于UV 测定橙皮苷的含量。
3.5 橙皮苷含量的测定：
对照品溶液的制备：精密称取干燥至恒重的橙皮苷标准品20mg ，用无水乙醇溶解，定容至100ml ，配制成浓度为0.2mg ／ml 的对照品溶液。
最大吸收波长的选择：精密吸取橙皮苷标准液3ml ，加入无水乙醇9ml ，振摇溶解，置于50ml 容量瓶中，静置5min ，再加入5％的 NaNO2溶液2ml ，振摇，静置6min ，加入10％的AI(NO3)3溶液2ml ，振摇，静置6min ，最后加入5％的NaOH 溶液20ml ，振摇，静置15min ．用无水乙醇定容至刻度．以没加入橙皮苷且按照上述相同方法配制的乙醇溶液为空白溶液．在200nm ～700nm 的波长范围内扫描，确定最大吸收波长。
标准曲线的绘制：分别精密量取0．0ml 、2．0ml 、3．0ml 、4．0ml 、5．0ml 、6．0ml 的橙皮苷标准品(0．2mg/m1)储备溶液，按照上述操作方法进行操作．以第一瓶为空白液．在最大波长处测定吸光度值，以 值(y)为横坐标、橙皮苷的含量(x，mg ／m1) 为纵坐标作线性回归，得标准曲线。
样品含量的测定：精密称取供试品浸膏2mg ，加入无水乙醇1 0ml溶解，按上述方法操作，在最大吸收波长处测定吸光度。同时扣除空白。
结果评价：两次平行测定结果之差不得超过两次测定平均值的 5%。
3.6 水蒸气蒸馏提取橘皮香精油:
定量的柑橘皮进行水蒸气蒸馏，得到的油层用无水硫酸钠干燥，以GC-FID 检测其中的4种精油含量。
3.7 GC-FID测定香精油的含量：
柑橘皮中含量最大的4种香精油分别是：柠檬烯，beta-蒎烯，芳樟醇，乙酸芳樟醇。将上述4中对照品配成标准溶液在GC 上分离得到对照品的色谱图，样品进样，按照外标法测定含量。
GC-FID 的色谱条件：
DB-1 非极性毛细管柱，FID 检测器
进样温度：150℃; 检测器温度：250℃;
炉温：80℃停留5min, 8℃/min升温到250℃，停留5min （ 需调整）
3.8 丙酮-乙醚提取类胡萝卜素:
柑橘皮晒干研碎, 称量, 加含0.1%BHT的丙酮提取, 离心, 沉淀用0.1％BHT 的丙酮分2～3次重复提取，至样品无色，合并上清液，减压蒸干，溶于乙醚(含0.1％ BHT) 后，再加10％K0H-甲醇溶液皂化反应3 h；加入10％NaC1使之分层萃取，水相再用乙醚萃取2次，合并乙醚相，蒸馏水反复洗至中性，用无水硫酸钠脱水后, 减压蒸干；用甲醇定容，以高压液相色谱检测3种类胡萝素。
3.9 HPLC测定类胡萝卜素
柑橘皮中含量最大的一种类胡萝卜素是叶黄素。
将上述3中对照品配成标准溶液在HPLC 上分离得到对照品的色谱图，样品进样，按照外标法测定含量。
HPLC 的色谱条件：
C18柱，紫外460nm
甲醇/乙腈/水/磷酸作流动相（ 需调整）
4．参考文献
[1]. 邵伟，熊泽，李昕. 光谱实验室,2005,22(5)
[2]. 陶俊, 张上隆, 中国农业科学2003,36(10)：1202-1208
[3] Bouzouita Nabiha,E1 Omri Abdelfatteh. Journal of Chemistry and Chemical Engineering,2010,29(4); 60-64
[4] 国家药典委员会编．中华人民共和国药典(2005年版) 一部[M]．北京：化学工业出版
[5] GB/T 5413.21-1997
[6] GB/T 821-3-1986