鸡胚在医学中的应用
摘要：鸡胚是研究动物发育的重要模型，已被大量用于医学各个学科的研究。对鸡胚的研究可以追溯到古希腊著名的博物学家亚里士多德，之后被很多生物学家予以深入的研究。现在对鸡胚发育的过程已有清楚的了解和认识。鸡胚在疫苗的开发和研究中更是有着不可替代的作用。本文主要阐述了鸡胚胎在发育生物学、肿瘤、神经、干细胞和免疫等研究领域中的应用。
关键词：鸡胚；发育；肿瘤；神经；干细胞；免疫
正文：
1鸡胚与发育生物学
鸡胚在发育生物学上作为一个重要模型系统已具有悠久的历史，一个多世纪以来，鸡胚已经成为洞悉发育过程和胚胎细胞命运的一个经典实验模型。随着生物技术的发展，如体内电穿孔技术、胚胎干细胞、新的转基因技术和基因组测序完成等，这些已经使鸡胚模型系统已变得更加强大，再结合传统的移植和世系追踪等技术，鸡胚已成为最优秀的实验系统之一[1]。随着模式生物鸡的基因资源增加、胚胎的易得性和RNA 干扰方法的应用，这些都使研究胚胎发育中众多基因的功能变得简单容易。因此，鸡胚也成为众多对基因功能感兴趣的脊椎动物学家首选的研究系统[2]。
2 鸡胚和肿瘤
宫颈癌是一种严重威胁女性健康和生命安全的恶性肿瘤[3,4]，近年来宫颈癌的治疗手段有了改进，但其生存率仍然有待提高，宫颈癌的动物模型对提高宫颈癌的实验研究水平具有重要意义。有人用BALB ／c~nude、SCID 小鼠或大鼠作为人宫颈癌移植瘤的动物模型[5,6,7]。鸡胚作为人类疾病模型有许多优点[8]，有人把鸡胚作为其它癌细胞如人结肠癌细胞系HT-29、成釉细胞瘤细胞、骨肉瘤细胞移植受体[9,10]，或作为肿瘤新生血管形成、肿瘤侵袭和远处脏器转移潜能，以及抗肿瘤药物作用机制探讨等方面研究的体内实验模型[11]，为建立宫颈癌鸡胚模型提供了可能性与借鉴方法。
3 鸡胚和神经生物学
3.1建立鸡胚神经管缺陷模型
鸡胚胎内注射氨甲喋呤(MTX)，制作鸡胚神经管缺陷动物模型。鲍南、施诚仁等选用上海农业科学院“菜杭”鸡的受精蛋552枚，分成3组，分别为药物(MTX)注射组、生理盐水注射对照组及正常对照组。药物注射时间选择在鸡胚孵化第2-7d ，MTX 剂量分别为0.01、0.02、0.05、0.l 及0.25mg/kg。孵化3周后观察结果。结果孵育第3~6d注药的鸡(剂量为0.01、0.02、0.05及0.lmg/kg)有神经管缺陷畸形产生，为脑膜脑膨出、骶尾骨退化等[12]。
3.2 提取鸡胚内神经营养活性物质及其生物活性
陈姝、何蕴韶等采用不同截留分子质量的超滤膜将不同胚龄的鸡胚内的蛋白分离提取，分成不同分子质量的蛋白组分，采用原代海马神经元和鸡胚背根节体外培养技术进行神经营养活性的分析与鉴定，发现不同胚龄的鸡胚相对分子质量Mr>50*103，的蛋白组分体外培养的海马神经元较对照组神经元存活数目多，存活时间长，突起粗而长，表明鸡胚相对分子质量Mr>50*l03蛋白组分可以维持和促进海马神经元的存活、生长．促进神经元之间的连接。值得注意的是相对分子
质量Mr>50*l03蛋白组分可以明显改变神经元胞体的形态，胞体截面积较对照组明显增大，表明对神经元也有较强的促分化的作用。胚龄El6与El9的蛋白组分的促神经存活、分化与突起生长的作用较El2更加明显，提示随着胚龄的增加，具有神经营养活性的此蛋白组分的含量有增加的趋势。免疫组化方法揭示鸡胚相
3对分子质量Mr>50*l0的蛋白组分对于神经细胞的作用有高度特异性。本实验结
果显示鸡胚相对分子质量Mr>5*l03蛋白组分除对中枢神经元的明显营养作用外．对外周神经背根节也有明显的促神经突起生长的作用[13,14,15,16]。
4 鸡胚和胚胎干细胞
4.1 鸡胚胎干细胞的离体培养体系
4.1.1 鸡胚胎干细胞的分离
由于鸡的胚胎发育特点，受精卵排出体外时巳处于胚胎发育的X 期，形成了具有约60000个细胞的盘状囊胚，相当于哺乳动物的囊胚期，因此并不能像哺乳动物那样从内细胞团来获得ES 细胞。1990年，Petitte J N等首次将分离的芦花鸡X 期胚盘细胞注入白莱航鸡胚胎，获得芦花鸡与白莱航鸡的种系嵌合体，Naito M 等(1991)采用同样方法获得了鹌鹑与鸡的种间嵌合体。随后大量实验证明，X 期
[17]胚盘细胞具有发育的全能性，可参与各种组织的形成。Pain B 等利用鸡X
期胚盘细胞首次成功培养出鸡ES 细胞，细胞传至35代仍具有全能性，并获得种系嵌合体鸡。Park TS 等[18]从5.5d 鸡胚生殖嵴分离PGCs 细胞并在体外培养4个月，成功建立类EG(embryonic germ cells，EG) 细胞系。在国内，安静等[19]、谢蓓等[20]及秦洁等[21]分别成功对X 期胚盘细胞及PGCs 细胞进行离体培养与传代，在一定传代次数内细胞保持未分化状态，并获得种系嵌合体。目前，主要通过X 期胚盘分离胚盘细胞或从早期胚胎生殖嵴分离PGCs 来培养鸡ES 细胞。胚盘细胞可从X 期胚盘的明区经胰酶消化后获得，而PGCs 主要是从Ⅺ期～Ⅻ期鸡胚的血液或5.5d 鸡胚生殖腺中分离并经Ficoll 密度梯度离心法纯化[22]，但这种方法获得的PGCs 数量有限，且操作繁琐。最近Mozdziak PE等口报道了一种新方法—荧光活化细胞分拣法，用胚胎阶段表面特异性抗原SSEA-1(stage-specific embryonic antigens ，SSEAs) 对细胞进行荧光标记后，可从x Ⅲ期～xv 期胚胎的血液及27期生殖嵴中分离到大量有活性的PGcs ，大大提高了分离PGCs 的效率口[23]。
4.1.2 鸡胚胎干细胞的离体培养
ES 细胞离体培养的关键是在保证细胞具备无限增殖能力的同时维持其未分化状态，而胚胎及机体发育过程中分化和分裂增殖一般是同时进行的，因此必须筛选适宜的培养体系，目前主要通过合理设计基础培养基、采用饲养层细胞培养以及添加抑制分化的细胞因子来解决。
4.1.3 鸡胚胎干细胞的鉴定
关于ES 细胞的鉴定标准有以下几条：①从囊胚内细胞团或原始生殖细胞分离培养获得；②能在体外长期培养且保持未分化状态；③AKP 、OCT-4、SSEAs 阳性表达，高端粒酶活性；④在体内或体外具有多向分化的能力；⑤长期培养后仍能维持正常的二倍体核型。鸡ES 细胞可通过形态学、APK 活性、SSEAs 检测、分化实验、嵌合体试验等方法进行鉴定[24,25]。
5 鸡胚和免疫学
眼一泌尿生殖道衣原体是一种具独特生活周期的专性真核细胞内寄生性原核微生物[26]。大规模培养和纯化一直是其研究过程中的困难所[27]。1965年Gordon
建立的McCoy 细胞培养法是分离培养眼一泌尿生殖道衣原体的较好方法。郭建巍、周学良[28]将Co ．在McCoy 细胞中扩大培养至50以上细胞形成包涵体以后用细胞培养物接种7日龄鸡胚卵黄囊，用此二步法来制各实验用的抗原。通过第一步，oC ．可在McoC y细胞中增殖生长，不但提高了Co ．的数量，而且在48小时左右形成较多具传染性的原体。用它来感染鸡胚．使鸡胚对Co ．的敏感性提高，比较短的时间内出现充血、水肿至死亡。McCoy 细胞培养法与鸡胚卵黄囊接种法联合用于Co ．的培养，不但克服了单纯用McCoy 细胞培养中操作过程复杂，容易污染，抗原收获量小的缺点，而且也解决了Co ．在鸡胚卵黄囊中死亡不规律．接种量大造成的毒种易于丢失等不足，同时在两种宿主体内交替传代还可避免Co ．毒性的下降，在比较短的时间里可获得较多的抗原。
随着鸡基因组学和鸡胚胎体外操作技术的不断发展和完善，鸡胚胎在生命科学研究中的地位必将越来越受到研究者的广泛重视和偏爱，相信在不久的将来鸡胚能够发挥更大的实验模型作用，并最终为人类医学和畜牧业的发展和应用贡献更大的力量。
参考文献
[1] SternCD．The chick：a great model system becomes even greater．Dev Cel1, 2005, 8: 9-17.
[2] Brown WR et a1．The chicken as a model for large—scale analysis of vertebrate gene function．Nat Rev Genet, 2003, 4: 87-98.
[3] BrakeT, Lambert PF. Estrogen contirbutes to the onset, persistence, and Malignant progression of cervical cancer in a human papillomavirus-transgenic mouse model[J]．PNAS, 2005, 102(7): 2490-2495.
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[11] Wang HL, Deng CS, Yuan YF, et a1. Effects of antiangiopoietin-2 antibody on vascularization of an implanted model of human colonic carcinoma on chick embyro[J]. Chn J Gastroint Surg, 2007, 10(3): 278-280.
[12] 鲍南, 施诚仁, 严志龙, 等. 鸡胚神经管缺陷模型的建立[J]. 上海第二医科大学学报, 2000, 4: 358-360.
[13] 王廷华，冯忠堂，邹晓莉，等．鸡胚脊髓背角感觉神经元诱向因子的初步
分离及鉴定[J]．华西医科大学学报，2000。31(2)：200一203．
[14] 张浚，邹晓莉，贾军，等．鸡胚脊髓背角神经营养物质的HPLC 纯化分析[J]．华西医大学报，2002，33(3)：407—408.
[15] 刘耀波，薛庆善，肖渝平，等．鸡胚脊髓背角中神经营养活性物质的初步分离和检测[J]．生理学报，2001, 53(4)：321-324．
[16] 陈姝，何蕴韶，程钢, 等. 鸡胚内神经营养活性物质的提取及其生物活性[J]. 中山大学学报(医学科学版) ，2006,27（5）:481-484.
[17] Pain B, Clark M E, Shen M, eta1. Long-term in vitro culture and characterization of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities[J]. Development, 1996, 122(8): 2339-02348.
[18 ]Park T S, Han J Y . Deirvaiton and characterization of pluirpo-tent embryonic germ cells in chicken[J]. Mol Reprod and Deve, 2000, 56(4): 475-482.
[19] 安静，杜立新．鸡胚胎干细腻的分离、培养与鉴定[J]．动物学报, 2003, 49(5), 698—703.
[20] 谢蓓，黄海．胡小芬，等．鸡胚胎原始生殖细盥体外培养[J]．细胞生物学杂志，2005, 27: 225—229．
[21] 嘉洁．李碧春．陈国宏，等．鸡胚胎原始生殖细胞的培养和传代[J]．动物学报, 2005．51(4): 723-731．
[22] Zhao D F, Kuwana T. Purification of aviancirculaitng primordial germ cells by nyeodenz density gradient centrifugation[J]. Br PouhSci, 2003．44(1): 30-35.
[23] Mozdziak P E, Stewart A J, Rushton B, et a1. Isolaiton of chicken pirmoridal germ cells using lfuorescence-acitvated cell soritng[J]．PoultSic, 2005, 84(4): 594-600.
[24] 杨威, 陈岩, 朱大力. 禽类胚胎千细胞的研究[J]. 高技术通讯, 2002, (1): 102-105.
[25] 王丙云. 家禽胚胎干细胞的研究进展[J]. 佛山科学技术学院学报(自然科学版). 2002, 20(4): 67-70.
[26] 张友逊等. 沙眼衣原体原体被膜超微结构的研究. 中国科学, 1980, (7): 718-717.
[27] Salarl SH et a1. Polypeptide Composition of Chlamydia trachomatis. Journal of general Microbiology, 1981, 183: 197-207.
{28}郭建巍, 周学良. 用细胞与鸡胚二步法培养眼-泌尿生殖道衣原体的研究[J]. 微生物学免疫学进展, 1997, 25(2): 28-30.
鸡胚在医学中的应用
摘要：鸡胚是研究动物发育的重要模型，已被大量用于医学各个学科的研究。对鸡胚的研究可以追溯到古希腊著名的博物学家亚里士多德，之后被很多生物学家予以深入的研究。现在对鸡胚发育的过程已有清楚的了解和认识。鸡胚在疫苗的开发和研究中更是有着不可替代的作用。本文主要阐述了鸡胚胎在发育生物学、肿瘤、神经、干细胞和免疫等研究领域中的应用。
关键词：鸡胚；发育；肿瘤；神经；干细胞；免疫
正文：
1鸡胚与发育生物学
鸡胚在发育生物学上作为一个重要模型系统已具有悠久的历史，一个多世纪以来，鸡胚已经成为洞悉发育过程和胚胎细胞命运的一个经典实验模型。随着生物技术的发展，如体内电穿孔技术、胚胎干细胞、新的转基因技术和基因组测序完成等，这些已经使鸡胚模型系统已变得更加强大，再结合传统的移植和世系追踪等技术，鸡胚已成为最优秀的实验系统之一[1]。随着模式生物鸡的基因资源增加、胚胎的易得性和RNA 干扰方法的应用，这些都使研究胚胎发育中众多基因的功能变得简单容易。因此，鸡胚也成为众多对基因功能感兴趣的脊椎动物学家首选的研究系统[2]。
2 鸡胚和肿瘤
宫颈癌是一种严重威胁女性健康和生命安全的恶性肿瘤[3,4]，近年来宫颈癌的治疗手段有了改进，但其生存率仍然有待提高，宫颈癌的动物模型对提高宫颈癌的实验研究水平具有重要意义。有人用BALB ／c~nude、SCID 小鼠或大鼠作为人宫颈癌移植瘤的动物模型[5,6,7]。鸡胚作为人类疾病模型有许多优点[8]，有人把鸡胚作为其它癌细胞如人结肠癌细胞系HT-29、成釉细胞瘤细胞、骨肉瘤细胞移植受体[9,10]，或作为肿瘤新生血管形成、肿瘤侵袭和远处脏器转移潜能，以及抗肿瘤药物作用机制探讨等方面研究的体内实验模型[11]，为建立宫颈癌鸡胚模型提供了可能性与借鉴方法。
3 鸡胚和神经生物学
3.1建立鸡胚神经管缺陷模型
鸡胚胎内注射氨甲喋呤(MTX)，制作鸡胚神经管缺陷动物模型。鲍南、施诚仁等选用上海农业科学院“菜杭”鸡的受精蛋552枚，分成3组，分别为药物(MTX)注射组、生理盐水注射对照组及正常对照组。药物注射时间选择在鸡胚孵化第2-7d ，MTX 剂量分别为0.01、0.02、0.05、0.l 及0.25mg/kg。孵化3周后观察结果。结果孵育第3~6d注药的鸡(剂量为0.01、0.02、0.05及0.lmg/kg)有神经管缺陷畸形产生，为脑膜脑膨出、骶尾骨退化等[12]。
3.2 提取鸡胚内神经营养活性物质及其生物活性
陈姝、何蕴韶等采用不同截留分子质量的超滤膜将不同胚龄的鸡胚内的蛋白分离提取，分成不同分子质量的蛋白组分，采用原代海马神经元和鸡胚背根节体外培养技术进行神经营养活性的分析与鉴定，发现不同胚龄的鸡胚相对分子质量Mr>50*103，的蛋白组分体外培养的海马神经元较对照组神经元存活数目多，存活时间长，突起粗而长，表明鸡胚相对分子质量Mr>50*l03蛋白组分可以维持和促进海马神经元的存活、生长．促进神经元之间的连接。值得注意的是相对分子
质量Mr>50*l03蛋白组分可以明显改变神经元胞体的形态，胞体截面积较对照组明显增大，表明对神经元也有较强的促分化的作用。胚龄El6与El9的蛋白组分的促神经存活、分化与突起生长的作用较El2更加明显，提示随着胚龄的增加，具有神经营养活性的此蛋白组分的含量有增加的趋势。免疫组化方法揭示鸡胚相
3对分子质量Mr>50*l0的蛋白组分对于神经细胞的作用有高度特异性。本实验结
果显示鸡胚相对分子质量Mr>5*l03蛋白组分除对中枢神经元的明显营养作用外．对外周神经背根节也有明显的促神经突起生长的作用[13,14,15,16]。
4 鸡胚和胚胎干细胞
4.1 鸡胚胎干细胞的离体培养体系
4.1.1 鸡胚胎干细胞的分离
由于鸡的胚胎发育特点，受精卵排出体外时巳处于胚胎发育的X 期，形成了具有约60000个细胞的盘状囊胚，相当于哺乳动物的囊胚期，因此并不能像哺乳动物那样从内细胞团来获得ES 细胞。1990年，Petitte J N等首次将分离的芦花鸡X 期胚盘细胞注入白莱航鸡胚胎，获得芦花鸡与白莱航鸡的种系嵌合体，Naito M 等(1991)采用同样方法获得了鹌鹑与鸡的种间嵌合体。随后大量实验证明，X 期
[17]胚盘细胞具有发育的全能性，可参与各种组织的形成。Pain B 等利用鸡X
期胚盘细胞首次成功培养出鸡ES 细胞，细胞传至35代仍具有全能性，并获得种系嵌合体鸡。Park TS 等[18]从5.5d 鸡胚生殖嵴分离PGCs 细胞并在体外培养4个月，成功建立类EG(embryonic germ cells，EG) 细胞系。在国内，安静等[19]、谢蓓等[20]及秦洁等[21]分别成功对X 期胚盘细胞及PGCs 细胞进行离体培养与传代，在一定传代次数内细胞保持未分化状态，并获得种系嵌合体。目前，主要通过X 期胚盘分离胚盘细胞或从早期胚胎生殖嵴分离PGCs 来培养鸡ES 细胞。胚盘细胞可从X 期胚盘的明区经胰酶消化后获得，而PGCs 主要是从Ⅺ期～Ⅻ期鸡胚的血液或5.5d 鸡胚生殖腺中分离并经Ficoll 密度梯度离心法纯化[22]，但这种方法获得的PGCs 数量有限，且操作繁琐。最近Mozdziak PE等口报道了一种新方法—荧光活化细胞分拣法，用胚胎阶段表面特异性抗原SSEA-1(stage-specific embryonic antigens ，SSEAs) 对细胞进行荧光标记后，可从x Ⅲ期～xv 期胚胎的血液及27期生殖嵴中分离到大量有活性的PGcs ，大大提高了分离PGCs 的效率口[23]。
4.1.2 鸡胚胎干细胞的离体培养
ES 细胞离体培养的关键是在保证细胞具备无限增殖能力的同时维持其未分化状态，而胚胎及机体发育过程中分化和分裂增殖一般是同时进行的，因此必须筛选适宜的培养体系，目前主要通过合理设计基础培养基、采用饲养层细胞培养以及添加抑制分化的细胞因子来解决。
4.1.3 鸡胚胎干细胞的鉴定
关于ES 细胞的鉴定标准有以下几条：①从囊胚内细胞团或原始生殖细胞分离培养获得；②能在体外长期培养且保持未分化状态；③AKP 、OCT-4、SSEAs 阳性表达，高端粒酶活性；④在体内或体外具有多向分化的能力；⑤长期培养后仍能维持正常的二倍体核型。鸡ES 细胞可通过形态学、APK 活性、SSEAs 检测、分化实验、嵌合体试验等方法进行鉴定[24,25]。
5 鸡胚和免疫学
眼一泌尿生殖道衣原体是一种具独特生活周期的专性真核细胞内寄生性原核微生物[26]。大规模培养和纯化一直是其研究过程中的困难所[27]。1965年Gordon
建立的McCoy 细胞培养法是分离培养眼一泌尿生殖道衣原体的较好方法。郭建巍、周学良[28]将Co ．在McCoy 细胞中扩大培养至50以上细胞形成包涵体以后用细胞培养物接种7日龄鸡胚卵黄囊，用此二步法来制各实验用的抗原。通过第一步，oC ．可在McoC y细胞中增殖生长，不但提高了Co ．的数量，而且在48小时左右形成较多具传染性的原体。用它来感染鸡胚．使鸡胚对Co ．的敏感性提高，比较短的时间内出现充血、水肿至死亡。McCoy 细胞培养法与鸡胚卵黄囊接种法联合用于Co ．的培养，不但克服了单纯用McCoy 细胞培养中操作过程复杂，容易污染，抗原收获量小的缺点，而且也解决了Co ．在鸡胚卵黄囊中死亡不规律．接种量大造成的毒种易于丢失等不足，同时在两种宿主体内交替传代还可避免Co ．毒性的下降，在比较短的时间里可获得较多的抗原。
随着鸡基因组学和鸡胚胎体外操作技术的不断发展和完善，鸡胚胎在生命科学研究中的地位必将越来越受到研究者的广泛重视和偏爱，相信在不久的将来鸡胚能够发挥更大的实验模型作用，并最终为人类医学和畜牧业的发展和应用贡献更大的力量。
参考文献
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