线粒体凋亡途径的研究进展

线粒体凋亡途径的研究进展

摘要:线粒体凋亡是细胞凋亡的主要途径之一,是一种由凋亡基因调控的高度保守的死亡过程。大多数凋亡信号作用于线粒体,通过改变线粒体膜的通透性,导致线粒体内相关物质释放入胞质,从而介导线粒体乃至细胞的凋亡,因此线粒体可能在细胞凋亡中起到主开关的作用,并且线粒体凋亡途径受到caspase家族、Bcl-2家族、Smac及IAP等的调节。

关键词:线粒体;细胞凋亡;细胞色素C;Bcl-2; MPTP;caspase;AIF;IAP;EndoG;Smac/DIABLO

Abstract: Mitochondrial apoptosis is one of the major pathways for apoptotic, and it is a high conservative process which is regulation by apoptosis gene. Most of the apoptosis signal was directed to mitochondria, by changing the permeability of mitochondrial membrane, which is leading to related substances in the mitochondria into the cytoplasm, and made the apoptotic of mitochondria and cells. So mitochondria may be master switch in apoptotic, and mitochondrial pathways of apoptosis be regulated by caspase family、Bcl-2 family、Smac and IAP.

Key words:mitochondrion;Apoptosis;CtyC;Bcl-2;MPTP;caspase;AIF;IAP;EndoG;Smac/DIABLO

引言

凋亡(apoptosis)是一个生理性的细胞自我毁灭过程,并由基因调控的高度保守的死亡过程,它在维持机体内环境的稳定和防御内外伤害等方面起着重要作用。如果机体内凋亡发生紊乱,则可能导致各种疾病的发生。但凋亡与坏死是两个完全不同的概念,凋亡是一个主动过程,它涉及到许多基因的表达和调控,最早是1972年由kerr教授根据形态学特征而提出的[1]。而坏死是一个被动过程,它是指细胞受到外界物理或化学等方面的影响而导致的细胞死亡过程。

细胞凋亡途径主要有3种通路:线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路

[2],也有学者将内质网通路归纳入线粒体通路之中。而且各种通路之间相互联系,共同介导细胞凋亡,并且在这其中线粒体通路起到决定性作用,被视为在细胞凋亡中起着主开关作用,从而成为细胞凋亡的执行者。因此,研究细胞内线粒体凋

亡已成为现代研究的热点。这里我们将就线粒体的功能,以及其在凋亡过程中结构的变化、调控作用及其机制等方面做一综述。

一、线粒体的功能

线粒体(mitochondria)是德国生物学家Altmann 1890年首先在动物细胞内发现,Benda 1897年命名的[3]。

线粒体具有氧化磷酸化、转递电子、能量代谢、抗活性氧化等重要生理作用,它为细胞的各种生命活动提供基础能量,细胞生命活动所需的能量约有95%来自线粒体,其是细胞内主要的ATP生产中心,当其合成ATP发生障碍时,则可影响心肌、骨骼肌、肝脏细胞等组织使其发生障碍。并且线粒体对于细胞内Ca2+浓度起着重要调节作用,它具有二条Ca2+摄取途径和四条Ca2+释放途径,也可通过其膜电化学梯度来维持,并为代谢产物的转运提供动力。另外,线粒体在介导细胞信号转导、细胞对环境变化做出各种应激反应、细胞内pH值的维持及渗透压调节等方面亦起着非常重要的作用。研究发现,线粒体的另一项主要任务就是在细胞凋亡中起重要作用,它通过自身的凋亡来介导细胞发生程序性死亡,在此过程中线粒体通过对凋亡信号的感知[4],通过一系列的变化从而释放一些蛋白,如细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)、凋亡介导因子和核酸内切酶等,这些释放物除在胞质中发挥作用介导细胞凋亡外,还可以进入细胞核内,调节相关凋亡基因的表达,产生凋亡效应。

二、线粒体凋亡的结构特征

在光学显微镜下,线粒体多为杆状、粒状和线状。不同种类细胞和不同生理条件下,线粒体的形状可能不同,其直径一般为0.5μm~3.0μm,其大小也因细胞种类和生理状况而异。并且在电镜下可以看到,线粒体是由两层单位膜围成的封闭的囊状结构,可以分为外膜(outer membrane)、内膜(inner membrane)、膜间腔(inter membrane space)和内室基质(matrix)4个部分。

在线粒体凋亡的前期,线粒体膜的通透性会升高,其通透性由线粒体通透性转变孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)调控。MPTP是位于线粒体内外膜之间,由多个蛋白质组成的复合通道,Zamzami等报道,该复合体至少由外膜的电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel,VDAC)、内膜的腺苷酸转位子(adenine nucleotide translocator,ANT)

及基质的亲环蛋白D(cyclophilin D)三种蛋白组成[5],它是线粒体与胞质进行信息交流的枢纽,可以通过钙超载和过氧化等途径而活化,被称为细胞的生死开关。在不同的内环境下,MPTP可有3种不同的状态,一种是完全关闭状态,线粒体跨膜电位完整。一种是可逆的低水平开放状态,仅允许分子量小于300D的物质通过,线粒体跨膜电位可逆性降低。另一种是不可逆的高水平开放状态,允许分子量小于1.5KDa的物质通过,包括质子和水分子,跨膜电位不可逆的降低。如上所述,线粒体凋亡时,其膜的通透性会升高,导致各种凋亡因子释放入胞质,胱天蛋白酶(caspase)被激活,以及细胞死亡。但其通透性升高的确切机制目前尚不十分清楚,最近的研究表明,在线粒体凋亡时,线粒体脂质会发生重新分布,并对膜通透性的升高起着重要作用[6]。首先发现的是磷脂酰丝氨酸外翻以及浆膜囊泡形成。最近还发现,当线粒体发生凋亡时,心磷脂水平会降低,而心磷脂是一种带负电荷的主要分布在线粒体内膜上的磷脂,它对于线粒体内氧化磷酸化中的许多蛋白活性和载体都是非常重要的。凋亡时,它会跨膜转向线粒体外膜,通过与Bcl-2家族蛋白作用使通透性升高。

在线粒体膜通透性升高的条件下,其结构改变的主要特征是由于基质蛋白的高浓度而使线粒体发生肿胀,并可伴有线粒体嵴数减少或消失,当肿胀达到一定程度时,即可出现线粒体外膜(OMM)破裂导致膜间蛋白释放,但内膜并不易破裂,其原因可能是内膜多嵴,其表面积远大于外膜。

由于线粒体膜通透性的升高,将导致线粒体内膜原有两侧质子和其他离子的不对称分布消失,从而导致线粒体膜电位的降低或消失。而线粒体膜电位的维持是保持线粒体功能所必需的,所以当膜电位降低或消失后,线粒体的功能将发生紊乱进而导致凋亡的发生。

三、线粒体凋亡的调控机制

和机体内各种细胞的增殖一样,凋亡也是受到基因调控的精确过程,线粒体凋亡的调控主要是针对线粒体凋亡途径中各种凋亡蛋白及其所形成的各种复合物进行调节,从而达到促进或抑制线粒体凋亡的作用。

1.线粒体通透性转换孔(MPTP)的作用:MPTP是一种调控机构,能够造成线粒体膜电位的降低,线粒体内Ca2+的减少和内部产生自由基的减少[7],使细胞维持正常的生理功能。MPTP的调控机制主要有以下几点:①质子梯度调控:MPTP

是由质子梯度、基质pH和线粒体内膜(IMM)电压差调控,最适宜的该孔道开放的基质pH为7.4,其它pH无论低于此值还是高于此值都将造成孔道的开放性下降。②Ca离子调控:通过Ca2+的内流外放之间的相互转变可以严格调控基质Ca2+含量,这也是被广泛认同的用于调节MPTP开关的机制。③MPTP抑制因子调控:主要包括环孢菌素、米酵母酸。④Bcl-2家族对MPTP的调控:如促凋亡蛋白Bax可与ANT或VDAC相互作用促进MPTP的开放,抗凋亡蛋白Bcl-2则可以与ANT相互作用或阻止Bax与ANT作用而抑制MPTP的开放[8]。此外,细胞氧化还原水平、能量代谢水平、腺嘌呤核苷酸的耗竭以及无机磷酸盐浓度的升高等都能影响MPTP的开放状态。

2.各种促凋亡蛋白的释放:这些促凋亡蛋白的作用是非常重要的,在细胞的正常状态下,它们与各种凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins IAPS)共同通过对caspase级联反应的促进或抑制来调节细胞的凋亡,使细胞的增殖与死亡保持平衡,如果这些调控因素发生紊乱,则可使细胞过分增殖或过分死亡从而引起肿瘤的发生。

(1)细胞色素c(cytc)的释放:cytc不仅能够在线粒体的呼吸中起到转递电子的作用,而且作为一个凋亡的起始因子也起着重要作用。当cytc释放到胞质后,不仅使线粒体呼吸链、电子转递受阻,能量供应减少,而且cytc与(凋亡活化因子-1)Apaf-1、ATP/dATP结合并发生多聚化从而形成凋亡体,引起Procaspase-9的活化[9],从而有效的切割和活化下游的效应半胱氨酸蛋白酶,导致凋亡。也有可能在某些细胞中,由于细胞中存在内源性caspase抑制剂,释放的细胞色素C将无法诱导caspsae-3介导的凋亡,而大量的细胞色素C释放将导致细胞向坏死的方向发展[10]。目前,关于cytc释放的机制还不是十分确切,就提出的各种观点来看,主要有两种模式,一种是通过Bcl-2家族的促凋亡成员Bax/Bak造成线粒体外膜中断,而不影响线粒体内膜或基质的功能,并且Shimizu等[12]发现在缺乏VDAC的细胞中,Bax不能诱导细胞色素C的释放以及线粒体跨膜电位的消失,而在ANT缺乏的细胞中则无此现象,这说明Bax和VADC相互作用可能促使cytc的释放。另一种是其他信号,如反应应激、Ca2+触发线粒体内膜上的小孔道开放,水分子进入线粒体基质导致外膜破裂[11]。

(2)凋亡诱导因子AIF(apoptosis inducing factor,AIF)的释放:AIF

是一种主要的凋亡效应蛋白,由位于X染色体一简单基因编码,是一种分子量为57KD的双动能黄素蛋白,除具有电子供体/受体功能外,还可独立作用于核染色质,具有促凋亡作用[13]。其前体在胞浆合成后转运到线粒体,被线粒体外膜保留在膜间隙,并与热休克蛋白60(heat stock protein 60,hsp60)共同定位于线粒体,hsp60被线粒体内膜保留于基质。当线粒体凋亡时,AIF就从线粒体释放出来,获得能量后直接转运到细胞核,独立的将DNA裂解为60KD左右的片段,引起染色质凝缩和DNA的大规模片段化,但AIF并不具有核酸内切酶活性,可能与核酸内切酶G(EndoG)或其它核酸内切酶协同作用。同时也有研究表明,AIF的重组体能诱导纯化的线粒体中cytc及caspase-9的释放。许多研究表明,AIF的释放可以受到Bac-2家族、Ca2+、过氧化氢等的调节,这些调节因素可以使线粒体MPTP的孔径变大,释放出AIF。并且发现AIF从线粒体释放是caspase依赖的,但其释放后的功能是caspase非依赖的,它不能被caspase抑制剂所抑制。膜间隙中的AIF还可通过自身放大回路使线粒体释放出更多的AIF,后者再作用于其它线粒体,破坏其功能。因此,AIF是线粒体膜通透性改变与核凋亡之间的重要桥梁。

(3)核酸内切酶G(EndoG)的释放:EndoG是由核基因编码,在胞浆中翻译后转运入线粒体膜间的一种线粒体核酸内切酶,其大小为30KD。它的释放可以受到紫外辐射和TNF的影响,当受到凋亡信号作用时,它可以释放出线粒体与AIF共同作用于核DNA使其产生片段化[14],并且EndoG的活化及其功能也是不依赖于caspase的。AIF和EdnoG的证实,说明在不依赖于caspase的情况下,乃可引起凋亡,这就激发了一个与caspase活化平行的凋亡过程。

(4)Smac/DIABLO的释放:Smac(the second mitochondria – derived activator of caspase)又称为DIABLO(direct IAP binding protein),作为一种促凋亡蛋白,Smac是一个由核基因编码大小为25KD的线粒体蛋白,其全长含有239个氨基酸,它的氨基末段是一个线粒体描定序列,包括55个氨基酸,此时的Smac是没有活性,这一末段在Smac从胞质转运入线粒体的过程中被水解,从而产生成熟的Smac并形成二聚体,而且这也保证了其进入线粒体前不会触发凋亡。成熟后的Smac氨基末段暴露出一段由四个疏水氨基酸(Ala-Val-Pro-Ile)所组成的四肽,其与caspase-9氨基末段的四肽存在明显的同源性,因此,Smac

可以与caspase-9竞争性地结合凋亡抑制蛋白(IAPs)的BIR结构域[15],IAPs家族中的BIR结构域可抑制活化的caspase,所以Smac可通过拮抗或中和IAPs家族成员而发挥促凋亡作用,但其从线粒体释放要受到Bcl-2的调节,Bcl-2可抑制其的释放,而紫外线或γ-射线可促进其释放。

(5)Caspase(半胱天冬蛋白酶)家族的释放:caspase全称为门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶,它通过介导和执行死亡指令在凋亡过程中发挥重要作用。到目前为止,caspase家族中已有14种成员被提出,并且将他们大致分为两类,一类为凋亡启动子,主要包括caspase-2,8,9,10;另一类为凋亡效应子,主要包括caspase-3,6,7等。在正常情况下,他们都以无活性的酶原形式存在,并且都是由两小、两大亚基组成的异四聚体。其中作为凋亡启动子的caspase能够进行自剪接而激活,并引起caspase的级联反应。而作为效应子的caspase则不能通过自催化或自剪接的方式激活。当在凋亡信号的介导下,线粒体释放出procasape-9(也有某些细胞的线粒体膜间腔中存在procaspase-3)到胞质引起casape的级联反应,使胞质中的蛋白质降解从而介导凋亡[16]。在体内对Caspase的调控因素主要有:IAPs家族的抑制作用,Smac的促进作用,核因子NF-kB的抑制作用以及Bcl-2家族对其的平衡调节作用[17,18],这些调控因素的作用非常重要,他们保持正常的细胞增殖和死亡的平衡。

3.Bcl-2基因家族对线粒体凋亡途径的调控作用。Bcl-2基因最早是在B-cell leukemia中发现,由此命名。其家族之间含有较高的同源性,可分为四个同源区:BH1、BH2、BH3和BH4,并且多数Bcl-2家族蛋白的C端具有疏水序列

[19],使其可定位于各种膜上,目前发现它们主要定位在核膜的胞质面、内质网及线粒体外膜上,且与膜的结合对于其发挥功能是非常重要的。在目前发现的15个成员中,按其功能可分为2大类,一类是抑制凋亡的因子,如Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1、CED9等,另一类是促进凋亡的因子,如Bax、Bak、Bcl-xs、Bad、Bid、Bik、Bim等。而按其结构不同可分为3个亚家族,它们分别为在BH1、BH2、BH3、BH4上具有同源性的Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等、在BH1、BH2、BH3上具有同源性的Bax、Bak等、以及只有在BH3上具有同源性的Bid、Bim、Bad、Bik等。

Bcl-2家族对线粒体凋亡途径的调控作用主要表现在其对线粒体膜通透

性、膜电位的影响,以及它对caspase家族蛋白的调节作用。有研究表明,Bcl-2家族中的某些成员可能参与了线粒体PT孔道的形成,Bax或Bak的寡聚体可插入线粒体膜增加线粒体的通透性[20],从而形成ctyc和更大分子的通道。此外定位于线粒体上的转录因子P53能与Bax、Bak相互作用,是它们处于促凋亡的构象并引起多聚化,从而导致线粒体通透性的改变,膜电位丢失[21,22],并已证实,Bax与Bak诱导线粒体跨膜电位降低是通过与线粒体外膜上的VDAC结合,使MPTP开放而实现的,并且BH3结构域是必需的。而作为Bcl-2家族中的凋亡抑制蛋白Bcl-2、Bcl-xl等,并且其中Bcl-2蛋白可能是线粒体PT孔的组成成分,它能够封闭Bax形成孔道的活性,包保护线粒体免于凋亡。此外Bcl-2蛋白还可以抑制线粒体活性氧的产生,提高线粒体的Ca2+负荷,与Apaf-1的N端结合阻止caspase-9的活化,从而阻断caspase级联反应。

总之,Bcl-2家族对凋亡的调控取决于各成员之间的相互作用,其各成员通过组成同源或异源聚合体而形成相互制约、相互影响的凋亡调控网络。

最后,除上述细胞内各种成分对线粒体凋亡途径的调控外,在细胞外也存在着多种调控对线粒体凋亡途径的物质,如过氧化物、硒、化合物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)等都可以对线粒体凋亡途径起到促进作用[23,24],并且某些药物对线粒体凋亡途径也起到重要的调节作用,如西乐葆(celecoxib)。

4.问题与展望

目前,关于线粒体凋亡途径的研究虽然比较广泛,但乃有许多问题尚未解决,如线粒体为何能够在细胞中担负起能量工厂、凋亡调控中心等如此重要的功能,以及在凋亡过程之中各级联反应中的具体环节和作用机制并不十分明确,线粒体膜通透性的转变也未能完全阐明,并且Bcl-2家族的活化机制尚未完全清楚,各种凋亡蛋白释放的精密调控机制和线粒体凋基因亡与线粒体凋亡之间的关系,这些都需要做出进一步的研究与论证。并且相信随着研究的不断深入能够为相关疾病的治疗提供更为有效的方法。

5.参考文献

[1] Kerr J F, W yllie A H, Currie A R. Apoptosis a basis biological

phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics BrJ Cancer, 1972, 26: 239-257.

[2] 刘丽君,彭建新,洪华珠,等. 线粒体在细胞凋亡中的变化与作用[J].细胞生

物学杂志,2005,27: 117-120.

[3] 刘树森.线粒体医学及其分子基础.细胞生物学动态.北京,北京师范大学出

版社,1999,135-153.

[4] 黄文林 ,朱孝峰. 信号转导[M]. 第 1 版.北京:人民卫生出版

社 ,2005.350-351.

[5] Halestrap A P ,Mcstay G O ,Clarke S J.The permeability transition pore complex:another view [J].Biochimie . 2002.84 ( 2-3 ):I53-166.

[6] Wang B, Ngnycn M, Breckenridge DG, et al. Uncleaved BAP31 in

association with A4 protein at the endoplasmic reticulum is an inhibitor of Fas-initiated release of cytochrome c from mitochondrial

[J].J Biol chem, 2003, 278(16):1461-1468.

[7] Armnstrong J S. Mitochondrial membrane permeabilization: the smequa

non for cell death[J]. Biocssays, 2006, 28( 3):253 -260.

[8] 孟祥东. BCL - 2 家族与线粒体对细胞凋亡的调控[J ]. 细胞与分子免疫学

杂志 ,2005 ,21:77–79.

[9] Hao Z, Gordom S, can D, et al. Specific ablation of the apototic

functions of ctyochrome c reveals a differential requirement for ctyochrome c and apaf- I in apoptosis[J].cell, 2005, 121( 4):579- 591.

[10] Coldstein .J C, Waterhouse N J ,juin P,et al.The coordinate release

of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant [J].Nat Cell Biol ,2000 ,2 (3):156-162.

[11] 方希敏.细胞色素 C 与细胞凋亡[J ].国外医学临床生物化学与检验学分

册 ,2005 ,26(1):43–46.

[12] DEGIORGIF, L ARTIGUEL,BAUER M K, et al the permeability transition

pore signals apoptosis by directing Bax transbcation and multimerization [J].FA SEBJ, 2002, 16: 607- 609.

[13] Crow MT, Mani K, Nam YJ,et al. The mitochondrial death pathway and

ceidiac myocyte apoptosie. Circ Rea, 2004,95:957-970.

[14] Crompton M. On the involvement of mitochondrial intermembrane

junctional complexes in apoptosis.curr Med chem,2003,10:1473-1484.

[15] Chipuk J E, Bouchier-Hayes L, Grcen D R.Mitochondrial outer Membrane

permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario[J] . Cell Death Differ, 2006, 13( 8):1396-1402.

[16] Shi Y. Mechanisms of caspase activation and inhibition during

apoptosis. Mol Ce11,2002,9:459-470.

[17] shiozakiEN,chai.I, Rigotti D.I, etal Mechanism of XIAP-mediated

inhibition of caspase-9[J].Mol cell, 2003,11(2):519-527.

[18] 周光飚,张广森。吲哚美辛诱导 K562细胞凋亡过程中半胱天冬酶及细胞

内游离钙浓度的变化[J].中华血液学杂志,2001,22:241-243.

[19] Kawatani M,Imoto M. Deletion of the BH1 domain of Bcl-2 accelerates

apoptosis by acting in a dominant negative fashion[J].J Biol chem,2003,278(22):19732-19742.

[20] Nutt LK, Pataer A, Pahler J, et al. Bax and Bak promote apoptosis

by modulating endoplasmic reticular and mitochondrial Ca2+ stores [J]. J Biol Chem, 2002, 277( 11): 9219- 9225.

[21] Bauer JH, Helfand SL New tricks of an old molecule:lifespan

regulation by p53 Aging Cell 2006,5( 5): 437-40.

[22] Samuels-Lev Y, O'Connor DJ ,Bergamschi D ,et al. ASPP proteins

specially stimulate the apoptotic function of p53 [J]. Mol Cell .2001,8 :781-794.

[23] Zhao Y, Yang LF, Ye M, et al. induction of apoptosis by

epigallocatechin-3-gallate via mitochondrial signal transduction pathWay [ J]. Preventive Medicine. 2004. 39: 1172- 1179.

[24] Le B ras M, Clement MV. Pervaiz S, etal. Reactive oxygen species

and the mitochondrial signaling pathway of cell death [J] .H istol H istopathol 2005, 20( 1):205-219.

线粒体凋亡途径的研究进展

摘要:线粒体凋亡是细胞凋亡的主要途径之一,是一种由凋亡基因调控的高度保守的死亡过程。大多数凋亡信号作用于线粒体,通过改变线粒体膜的通透性,导致线粒体内相关物质释放入胞质,从而介导线粒体乃至细胞的凋亡,因此线粒体可能在细胞凋亡中起到主开关的作用,并且线粒体凋亡途径受到caspase家族、Bcl-2家族、Smac及IAP等的调节。

关键词:线粒体;细胞凋亡;细胞色素C;Bcl-2; MPTP;caspase;AIF;IAP;EndoG;Smac/DIABLO

Abstract: Mitochondrial apoptosis is one of the major pathways for apoptotic, and it is a high conservative process which is regulation by apoptosis gene. Most of the apoptosis signal was directed to mitochondria, by changing the permeability of mitochondrial membrane, which is leading to related substances in the mitochondria into the cytoplasm, and made the apoptotic of mitochondria and cells. So mitochondria may be master switch in apoptotic, and mitochondrial pathways of apoptosis be regulated by caspase family、Bcl-2 family、Smac and IAP.

Key words:mitochondrion;Apoptosis;CtyC;Bcl-2;MPTP;caspase;AIF;IAP;EndoG;Smac/DIABLO

引言

凋亡(apoptosis)是一个生理性的细胞自我毁灭过程,并由基因调控的高度保守的死亡过程,它在维持机体内环境的稳定和防御内外伤害等方面起着重要作用。如果机体内凋亡发生紊乱,则可能导致各种疾病的发生。但凋亡与坏死是两个完全不同的概念,凋亡是一个主动过程,它涉及到许多基因的表达和调控,最早是1972年由kerr教授根据形态学特征而提出的[1]。而坏死是一个被动过程,它是指细胞受到外界物理或化学等方面的影响而导致的细胞死亡过程。

细胞凋亡途径主要有3种通路:线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路

[2],也有学者将内质网通路归纳入线粒体通路之中。而且各种通路之间相互联系,共同介导细胞凋亡,并且在这其中线粒体通路起到决定性作用,被视为在细胞凋亡中起着主开关作用,从而成为细胞凋亡的执行者。因此,研究细胞内线粒体凋

亡已成为现代研究的热点。这里我们将就线粒体的功能,以及其在凋亡过程中结构的变化、调控作用及其机制等方面做一综述。

一、线粒体的功能

线粒体(mitochondria)是德国生物学家Altmann 1890年首先在动物细胞内发现,Benda 1897年命名的[3]。

线粒体具有氧化磷酸化、转递电子、能量代谢、抗活性氧化等重要生理作用,它为细胞的各种生命活动提供基础能量,细胞生命活动所需的能量约有95%来自线粒体,其是细胞内主要的ATP生产中心,当其合成ATP发生障碍时,则可影响心肌、骨骼肌、肝脏细胞等组织使其发生障碍。并且线粒体对于细胞内Ca2+浓度起着重要调节作用,它具有二条Ca2+摄取途径和四条Ca2+释放途径,也可通过其膜电化学梯度来维持,并为代谢产物的转运提供动力。另外,线粒体在介导细胞信号转导、细胞对环境变化做出各种应激反应、细胞内pH值的维持及渗透压调节等方面亦起着非常重要的作用。研究发现,线粒体的另一项主要任务就是在细胞凋亡中起重要作用,它通过自身的凋亡来介导细胞发生程序性死亡,在此过程中线粒体通过对凋亡信号的感知[4],通过一系列的变化从而释放一些蛋白,如细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)、凋亡介导因子和核酸内切酶等,这些释放物除在胞质中发挥作用介导细胞凋亡外,还可以进入细胞核内,调节相关凋亡基因的表达,产生凋亡效应。

二、线粒体凋亡的结构特征

在光学显微镜下,线粒体多为杆状、粒状和线状。不同种类细胞和不同生理条件下,线粒体的形状可能不同,其直径一般为0.5μm~3.0μm,其大小也因细胞种类和生理状况而异。并且在电镜下可以看到,线粒体是由两层单位膜围成的封闭的囊状结构,可以分为外膜(outer membrane)、内膜(inner membrane)、膜间腔(inter membrane space)和内室基质(matrix)4个部分。

在线粒体凋亡的前期,线粒体膜的通透性会升高,其通透性由线粒体通透性转变孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)调控。MPTP是位于线粒体内外膜之间,由多个蛋白质组成的复合通道,Zamzami等报道,该复合体至少由外膜的电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel,VDAC)、内膜的腺苷酸转位子(adenine nucleotide translocator,ANT)

及基质的亲环蛋白D(cyclophilin D)三种蛋白组成[5],它是线粒体与胞质进行信息交流的枢纽,可以通过钙超载和过氧化等途径而活化,被称为细胞的生死开关。在不同的内环境下,MPTP可有3种不同的状态,一种是完全关闭状态,线粒体跨膜电位完整。一种是可逆的低水平开放状态,仅允许分子量小于300D的物质通过,线粒体跨膜电位可逆性降低。另一种是不可逆的高水平开放状态,允许分子量小于1.5KDa的物质通过,包括质子和水分子,跨膜电位不可逆的降低。如上所述,线粒体凋亡时,其膜的通透性会升高,导致各种凋亡因子释放入胞质,胱天蛋白酶(caspase)被激活,以及细胞死亡。但其通透性升高的确切机制目前尚不十分清楚,最近的研究表明,在线粒体凋亡时,线粒体脂质会发生重新分布,并对膜通透性的升高起着重要作用[6]。首先发现的是磷脂酰丝氨酸外翻以及浆膜囊泡形成。最近还发现,当线粒体发生凋亡时,心磷脂水平会降低,而心磷脂是一种带负电荷的主要分布在线粒体内膜上的磷脂,它对于线粒体内氧化磷酸化中的许多蛋白活性和载体都是非常重要的。凋亡时,它会跨膜转向线粒体外膜,通过与Bcl-2家族蛋白作用使通透性升高。

在线粒体膜通透性升高的条件下,其结构改变的主要特征是由于基质蛋白的高浓度而使线粒体发生肿胀,并可伴有线粒体嵴数减少或消失,当肿胀达到一定程度时,即可出现线粒体外膜(OMM)破裂导致膜间蛋白释放,但内膜并不易破裂,其原因可能是内膜多嵴,其表面积远大于外膜。

由于线粒体膜通透性的升高,将导致线粒体内膜原有两侧质子和其他离子的不对称分布消失,从而导致线粒体膜电位的降低或消失。而线粒体膜电位的维持是保持线粒体功能所必需的,所以当膜电位降低或消失后,线粒体的功能将发生紊乱进而导致凋亡的发生。

三、线粒体凋亡的调控机制

和机体内各种细胞的增殖一样,凋亡也是受到基因调控的精确过程,线粒体凋亡的调控主要是针对线粒体凋亡途径中各种凋亡蛋白及其所形成的各种复合物进行调节,从而达到促进或抑制线粒体凋亡的作用。

1.线粒体通透性转换孔(MPTP)的作用:MPTP是一种调控机构,能够造成线粒体膜电位的降低,线粒体内Ca2+的减少和内部产生自由基的减少[7],使细胞维持正常的生理功能。MPTP的调控机制主要有以下几点:①质子梯度调控:MPTP

是由质子梯度、基质pH和线粒体内膜(IMM)电压差调控,最适宜的该孔道开放的基质pH为7.4,其它pH无论低于此值还是高于此值都将造成孔道的开放性下降。②Ca离子调控:通过Ca2+的内流外放之间的相互转变可以严格调控基质Ca2+含量,这也是被广泛认同的用于调节MPTP开关的机制。③MPTP抑制因子调控:主要包括环孢菌素、米酵母酸。④Bcl-2家族对MPTP的调控:如促凋亡蛋白Bax可与ANT或VDAC相互作用促进MPTP的开放,抗凋亡蛋白Bcl-2则可以与ANT相互作用或阻止Bax与ANT作用而抑制MPTP的开放[8]。此外,细胞氧化还原水平、能量代谢水平、腺嘌呤核苷酸的耗竭以及无机磷酸盐浓度的升高等都能影响MPTP的开放状态。

2.各种促凋亡蛋白的释放:这些促凋亡蛋白的作用是非常重要的,在细胞的正常状态下,它们与各种凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins IAPS)共同通过对caspase级联反应的促进或抑制来调节细胞的凋亡,使细胞的增殖与死亡保持平衡,如果这些调控因素发生紊乱,则可使细胞过分增殖或过分死亡从而引起肿瘤的发生。

(1)细胞色素c(cytc)的释放:cytc不仅能够在线粒体的呼吸中起到转递电子的作用,而且作为一个凋亡的起始因子也起着重要作用。当cytc释放到胞质后,不仅使线粒体呼吸链、电子转递受阻,能量供应减少,而且cytc与(凋亡活化因子-1)Apaf-1、ATP/dATP结合并发生多聚化从而形成凋亡体,引起Procaspase-9的活化[9],从而有效的切割和活化下游的效应半胱氨酸蛋白酶,导致凋亡。也有可能在某些细胞中,由于细胞中存在内源性caspase抑制剂,释放的细胞色素C将无法诱导caspsae-3介导的凋亡,而大量的细胞色素C释放将导致细胞向坏死的方向发展[10]。目前,关于cytc释放的机制还不是十分确切,就提出的各种观点来看,主要有两种模式,一种是通过Bcl-2家族的促凋亡成员Bax/Bak造成线粒体外膜中断,而不影响线粒体内膜或基质的功能,并且Shimizu等[12]发现在缺乏VDAC的细胞中,Bax不能诱导细胞色素C的释放以及线粒体跨膜电位的消失,而在ANT缺乏的细胞中则无此现象,这说明Bax和VADC相互作用可能促使cytc的释放。另一种是其他信号,如反应应激、Ca2+触发线粒体内膜上的小孔道开放,水分子进入线粒体基质导致外膜破裂[11]。

(2)凋亡诱导因子AIF(apoptosis inducing factor,AIF)的释放:AIF

是一种主要的凋亡效应蛋白,由位于X染色体一简单基因编码,是一种分子量为57KD的双动能黄素蛋白,除具有电子供体/受体功能外,还可独立作用于核染色质,具有促凋亡作用[13]。其前体在胞浆合成后转运到线粒体,被线粒体外膜保留在膜间隙,并与热休克蛋白60(heat stock protein 60,hsp60)共同定位于线粒体,hsp60被线粒体内膜保留于基质。当线粒体凋亡时,AIF就从线粒体释放出来,获得能量后直接转运到细胞核,独立的将DNA裂解为60KD左右的片段,引起染色质凝缩和DNA的大规模片段化,但AIF并不具有核酸内切酶活性,可能与核酸内切酶G(EndoG)或其它核酸内切酶协同作用。同时也有研究表明,AIF的重组体能诱导纯化的线粒体中cytc及caspase-9的释放。许多研究表明,AIF的释放可以受到Bac-2家族、Ca2+、过氧化氢等的调节,这些调节因素可以使线粒体MPTP的孔径变大,释放出AIF。并且发现AIF从线粒体释放是caspase依赖的,但其释放后的功能是caspase非依赖的,它不能被caspase抑制剂所抑制。膜间隙中的AIF还可通过自身放大回路使线粒体释放出更多的AIF,后者再作用于其它线粒体,破坏其功能。因此,AIF是线粒体膜通透性改变与核凋亡之间的重要桥梁。

(3)核酸内切酶G(EndoG)的释放:EndoG是由核基因编码,在胞浆中翻译后转运入线粒体膜间的一种线粒体核酸内切酶,其大小为30KD。它的释放可以受到紫外辐射和TNF的影响,当受到凋亡信号作用时,它可以释放出线粒体与AIF共同作用于核DNA使其产生片段化[14],并且EndoG的活化及其功能也是不依赖于caspase的。AIF和EdnoG的证实,说明在不依赖于caspase的情况下,乃可引起凋亡,这就激发了一个与caspase活化平行的凋亡过程。

(4)Smac/DIABLO的释放:Smac(the second mitochondria – derived activator of caspase)又称为DIABLO(direct IAP binding protein),作为一种促凋亡蛋白,Smac是一个由核基因编码大小为25KD的线粒体蛋白,其全长含有239个氨基酸,它的氨基末段是一个线粒体描定序列,包括55个氨基酸,此时的Smac是没有活性,这一末段在Smac从胞质转运入线粒体的过程中被水解,从而产生成熟的Smac并形成二聚体,而且这也保证了其进入线粒体前不会触发凋亡。成熟后的Smac氨基末段暴露出一段由四个疏水氨基酸(Ala-Val-Pro-Ile)所组成的四肽,其与caspase-9氨基末段的四肽存在明显的同源性,因此,Smac

可以与caspase-9竞争性地结合凋亡抑制蛋白(IAPs)的BIR结构域[15],IAPs家族中的BIR结构域可抑制活化的caspase,所以Smac可通过拮抗或中和IAPs家族成员而发挥促凋亡作用,但其从线粒体释放要受到Bcl-2的调节,Bcl-2可抑制其的释放,而紫外线或γ-射线可促进其释放。

(5)Caspase(半胱天冬蛋白酶)家族的释放:caspase全称为门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶,它通过介导和执行死亡指令在凋亡过程中发挥重要作用。到目前为止,caspase家族中已有14种成员被提出,并且将他们大致分为两类,一类为凋亡启动子,主要包括caspase-2,8,9,10;另一类为凋亡效应子,主要包括caspase-3,6,7等。在正常情况下,他们都以无活性的酶原形式存在,并且都是由两小、两大亚基组成的异四聚体。其中作为凋亡启动子的caspase能够进行自剪接而激活,并引起caspase的级联反应。而作为效应子的caspase则不能通过自催化或自剪接的方式激活。当在凋亡信号的介导下,线粒体释放出procasape-9(也有某些细胞的线粒体膜间腔中存在procaspase-3)到胞质引起casape的级联反应,使胞质中的蛋白质降解从而介导凋亡[16]。在体内对Caspase的调控因素主要有:IAPs家族的抑制作用,Smac的促进作用,核因子NF-kB的抑制作用以及Bcl-2家族对其的平衡调节作用[17,18],这些调控因素的作用非常重要,他们保持正常的细胞增殖和死亡的平衡。

3.Bcl-2基因家族对线粒体凋亡途径的调控作用。Bcl-2基因最早是在B-cell leukemia中发现,由此命名。其家族之间含有较高的同源性,可分为四个同源区:BH1、BH2、BH3和BH4,并且多数Bcl-2家族蛋白的C端具有疏水序列

[19],使其可定位于各种膜上,目前发现它们主要定位在核膜的胞质面、内质网及线粒体外膜上,且与膜的结合对于其发挥功能是非常重要的。在目前发现的15个成员中,按其功能可分为2大类,一类是抑制凋亡的因子,如Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1、CED9等,另一类是促进凋亡的因子,如Bax、Bak、Bcl-xs、Bad、Bid、Bik、Bim等。而按其结构不同可分为3个亚家族,它们分别为在BH1、BH2、BH3、BH4上具有同源性的Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等、在BH1、BH2、BH3上具有同源性的Bax、Bak等、以及只有在BH3上具有同源性的Bid、Bim、Bad、Bik等。

Bcl-2家族对线粒体凋亡途径的调控作用主要表现在其对线粒体膜通透

性、膜电位的影响,以及它对caspase家族蛋白的调节作用。有研究表明,Bcl-2家族中的某些成员可能参与了线粒体PT孔道的形成,Bax或Bak的寡聚体可插入线粒体膜增加线粒体的通透性[20],从而形成ctyc和更大分子的通道。此外定位于线粒体上的转录因子P53能与Bax、Bak相互作用,是它们处于促凋亡的构象并引起多聚化,从而导致线粒体通透性的改变,膜电位丢失[21,22],并已证实,Bax与Bak诱导线粒体跨膜电位降低是通过与线粒体外膜上的VDAC结合,使MPTP开放而实现的,并且BH3结构域是必需的。而作为Bcl-2家族中的凋亡抑制蛋白Bcl-2、Bcl-xl等,并且其中Bcl-2蛋白可能是线粒体PT孔的组成成分,它能够封闭Bax形成孔道的活性,包保护线粒体免于凋亡。此外Bcl-2蛋白还可以抑制线粒体活性氧的产生,提高线粒体的Ca2+负荷,与Apaf-1的N端结合阻止caspase-9的活化,从而阻断caspase级联反应。

总之,Bcl-2家族对凋亡的调控取决于各成员之间的相互作用,其各成员通过组成同源或异源聚合体而形成相互制约、相互影响的凋亡调控网络。

最后,除上述细胞内各种成分对线粒体凋亡途径的调控外,在细胞外也存在着多种调控对线粒体凋亡途径的物质,如过氧化物、硒、化合物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)等都可以对线粒体凋亡途径起到促进作用[23,24],并且某些药物对线粒体凋亡途径也起到重要的调节作用,如西乐葆(celecoxib)。

4.问题与展望

目前,关于线粒体凋亡途径的研究虽然比较广泛,但乃有许多问题尚未解决,如线粒体为何能够在细胞中担负起能量工厂、凋亡调控中心等如此重要的功能,以及在凋亡过程之中各级联反应中的具体环节和作用机制并不十分明确,线粒体膜通透性的转变也未能完全阐明,并且Bcl-2家族的活化机制尚未完全清楚,各种凋亡蛋白释放的精密调控机制和线粒体凋基因亡与线粒体凋亡之间的关系,这些都需要做出进一步的研究与论证。并且相信随着研究的不断深入能够为相关疾病的治疗提供更为有效的方法。

5.参考文献

[1] Kerr J F, W yllie A H, Currie A R. Apoptosis a basis biological

phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics BrJ Cancer, 1972, 26: 239-257.

[2] 刘丽君,彭建新,洪华珠,等. 线粒体在细胞凋亡中的变化与作用[J].细胞生

物学杂志,2005,27: 117-120.

[3] 刘树森.线粒体医学及其分子基础.细胞生物学动态.北京,北京师范大学出

版社,1999,135-153.

[4] 黄文林 ,朱孝峰. 信号转导[M]. 第 1 版.北京:人民卫生出版

社 ,2005.350-351.

[5] Halestrap A P ,Mcstay G O ,Clarke S J.The permeability transition pore complex:another view [J].Biochimie . 2002.84 ( 2-3 ):I53-166.

[6] Wang B, Ngnycn M, Breckenridge DG, et al. Uncleaved BAP31 in

association with A4 protein at the endoplasmic reticulum is an inhibitor of Fas-initiated release of cytochrome c from mitochondrial

[J].J Biol chem, 2003, 278(16):1461-1468.

[7] Armnstrong J S. Mitochondrial membrane permeabilization: the smequa

non for cell death[J]. Biocssays, 2006, 28( 3):253 -260.

[8] 孟祥东. BCL - 2 家族与线粒体对细胞凋亡的调控[J ]. 细胞与分子免疫学

杂志 ,2005 ,21:77–79.

[9] Hao Z, Gordom S, can D, et al. Specific ablation of the apototic

functions of ctyochrome c reveals a differential requirement for ctyochrome c and apaf- I in apoptosis[J].cell, 2005, 121( 4):579- 591.

[10] Coldstein .J C, Waterhouse N J ,juin P,et al.The coordinate release

of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant [J].Nat Cell Biol ,2000 ,2 (3):156-162.

[11] 方希敏.细胞色素 C 与细胞凋亡[J ].国外医学临床生物化学与检验学分

册 ,2005 ,26(1):43–46.

[12] DEGIORGIF, L ARTIGUEL,BAUER M K, et al the permeability transition

pore signals apoptosis by directing Bax transbcation and multimerization [J].FA SEBJ, 2002, 16: 607- 609.

[13] Crow MT, Mani K, Nam YJ,et al. The mitochondrial death pathway and

ceidiac myocyte apoptosie. Circ Rea, 2004,95:957-970.

[14] Crompton M. On the involvement of mitochondrial intermembrane

junctional complexes in apoptosis.curr Med chem,2003,10:1473-1484.

[15] Chipuk J E, Bouchier-Hayes L, Grcen D R.Mitochondrial outer Membrane

permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario[J] . Cell Death Differ, 2006, 13( 8):1396-1402.

[16] Shi Y. Mechanisms of caspase activation and inhibition during

apoptosis. Mol Ce11,2002,9:459-470.

[17] shiozakiEN,chai.I, Rigotti D.I, etal Mechanism of XIAP-mediated

inhibition of caspase-9[J].Mol cell, 2003,11(2):519-527.

[18] 周光飚,张广森。吲哚美辛诱导 K562细胞凋亡过程中半胱天冬酶及细胞

内游离钙浓度的变化[J].中华血液学杂志,2001,22:241-243.

[19] Kawatani M,Imoto M. Deletion of the BH1 domain of Bcl-2 accelerates

apoptosis by acting in a dominant negative fashion[J].J Biol chem,2003,278(22):19732-19742.

[20] Nutt LK, Pataer A, Pahler J, et al. Bax and Bak promote apoptosis

by modulating endoplasmic reticular and mitochondrial Ca2+ stores [J]. J Biol Chem, 2002, 277( 11): 9219- 9225.

[21] Bauer JH, Helfand SL New tricks of an old molecule:lifespan

regulation by p53 Aging Cell 2006,5( 5): 437-40.

[22] Samuels-Lev Y, O'Connor DJ ,Bergamschi D ,et al. ASPP proteins

specially stimulate the apoptotic function of p53 [J]. Mol Cell .2001,8 :781-794.

[23] Zhao Y, Yang LF, Ye M, et al. induction of apoptosis by

epigallocatechin-3-gallate via mitochondrial signal transduction pathWay [ J]. Preventive Medicine. 2004. 39: 1172- 1179.

[24] Le B ras M, Clement MV. Pervaiz S, etal. Reactive oxygen species

and the mitochondrial signaling pathway of cell death [J] .H istol H istopathol 2005, 20( 1):205-219.


相关内容

  • 细胞凋亡及凋亡信号途径相关蛋白
  • 细胞凋亡及凋亡信号途径相关蛋白 一.细胞凋亡及凋亡信号途径相关蛋白 1.1细胞凋亡的概念及其途径 细胞凋亡是在生理或病理条件下的一种主动死亡方式,是受细胞内基因及细胞外一些因子调控的生物学过程,以DNA早期降解为特征,其细胞膜一般保持完整,不伴有细胞内容物的释放,细胞最终分解成凋亡小体后被巨噬细胞或 ...

  • 细胞凋亡信号转导途径及调控的研究进展
  • 细胞凋亡信号转导途径及其调控的研究 进展 学科: 专业: 姓名: 学号: 基础兽医学 药理毒理学 ma cai hui 13203023 细胞凋亡信号转导途径及其调控的研究进展 摘要 目的:为了研究抗肿瘤药物促使细胞凋亡的作用机理,探讨细胞凋亡的信号转导途径以及相关基因对其的调控.方法:查阅近年的国 ...

  • 卵泡颗粒细胞凋亡相关蛋白的研究进展
  • 文章编号 :1004-0374(2009)04-0494-05 ·评述与综述· 卵泡颗粒细胞凋亡相关蛋白的研究进展 王昭晖,张耀君,师 红,文瑞丽,吴民耀* (陕西师范大学生命科学学院,药用资源与天然药物化学教育部重点实验室, 西北濒危药材资源开发国家工程实验室,西安 710062) 摘 要:哺乳动 ...

  • 脑神经元死亡的研究进展_黄菊芳
  • 第22卷第25期2012年9月 中国现代医学杂志 ChinaJournalofModernMedicine Vol.22No.25Sep.2012 (2012)25-0053-06文章编号:1005-8982 ·综述· 脑神经元死亡的研究进展* 黄菊芳综述,李 岚,尚 蕾,熊 鲲审校 (中南大学湘雅 ...

  • 黄酮类化合物诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展
  • 黄酮类化合物诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展 陈思宇 基础医学院2012级23班,生物技术 201240262 摘要:黄酮类化合物是广泛存在于自然界中的一类多酚化合物,有许多潜在的药用价值,抗肿瘤活性是其研究热点之一.它的抗肿瘤作用主要表现在抑制细胞增殖.诱导细胞凋亡.干预信号转导.影响细胞周期.影响血管 ...

  • 细胞凋亡和细胞坏死的区别
  • 细胞凋亡和细胞坏死的区别 细胞凋亡的基本概念:多细胞生物中,细胞死亡有两种不同的方式.一种是细胞坏死,它是细胞在生理过程中意外死亡,这常见于对细胞的侵袭使细胞受到损伤,是一种被动死亡过程.另一种死亡方式称细胞凋亡,是细胞死亡的一种生理形式,是在基因调控下细胞主动死亡过程. 表1 特征 诱发因素 细胞 ...

  • 半胱氨酸蛋白酶与消化系肿瘤化疗
  • [摘要] 半胱氨酸蛋白酶(Caspases)激活级联反应在凋亡调控中占核心作用,它涉及2条主要途径:死亡介导途径和线粒体依赖途径.不同的凋亡刺激信号经各自特定途径的起始不同的Caspases级联反应,进而激活下游的效应Caspases,诱发细胞凋亡.研究发现有些细胞毒化疗药物通过半胱氨酸蛋白酶而诱导 ...

  • 凋亡抑制蛋白及其拮抗剂研发进展_范应仙
  • 中国新药与临床杂志(ChinJNewDrugsClinRem),2013年4月,第32卷第4期 [文章编号]1007-7669(2013)04-0257-08 ·257· 凋亡抑制蛋白及其拮抗剂研发进展 范应仙a,张继虹a,b,张宽仁a (昆明理工大学a.生命科学与技术学院,b.医学院,云南昆明 [ ...

  • 缺氧诱发细胞凋亡的机制
  • ・1012・ 13陈俊.李积胜,王华仁,等.睡眠剥夺大鼠大脑皮层和海马lINoS 表达的改变在其学习记忆损伤中的作用[J].神经科学通报,2005:21(4):283-6. 14,s|lllinellM,HolmJ,HirvonenK,eta/.Recovery ante . 2l郭华珍,恽晓平.R ...