姓名 系年级 09级 组别 同组者
科目细胞生物学实验 题目 叶绿体的分离与荧光观察仪器编号
一、实验目的：
1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
二、实验原理：
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。沉降顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化氢酶体、内质网与高尔基体、核蛋白体。
将匀浆液在1000 r／min 的条件下离心2min ，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000 r／min 的条件下离心5min ，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。如需获得纯的叶绿体，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。某些物质在一定短波长的光(如紫外光)
的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，
就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光) ，这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光) ，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光) ，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
三、实验试剂及器材：
1、器材：普通离心机、榨汁机、研钵、滴管、漏斗、离心管、天平、量筒、纱布
2、材料：新鲜菠菜
3、试剂：0.35 mol／L 氯化钠溶液、0.01％吖啶橙(acridine orange)
四、实验步骤：
1、选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g 于150ml 0.35 mol ／L NaCI溶液中，装入组织捣碎机。
2、利用组织捣碎机低速(5 000 r／min) 匀浆3~5min。
3、将匀浆用6层纱布过滤于500ml 烧杯中。
4、取滤液4ml 在1000 r／min 下离心2 min。弃去沉淀。
5、将上清液在3000 r／min 下离心5min ，弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核) 。
6、将沉淀用0.35 mol／L NaCl溶液悬浮。
7、取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察： ①在普通光镜下观察；②在荧光显微镜下观察； ③取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0．01％吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察。
五、实验结果：
普通显微镜中菠菜叶的叶绿体（10x40） 普通显微镜中菠菜叶绿体局部放大图（10x40）
荧光显微镜菠菜叶绿体（未染色）（10x40） 荧光显微镜菠菜叶绿体局部放大图（未染色）（10x40）
细胞核
线粒体
荧光显微镜菠菜叶绿体（染色）（10x40） 荧光显微镜菠菜叶绿体局部放大图（染色）（10x40）
六、实验总结：
1、叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好在0-5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。
2、荧光显微镜启动2-3分钟后方可稳定，启动15分钟内不得关闭电源，一旦关闭汞灯，3分钟内不得重启，以延长光源寿命。放置样品后，先在普通光镜下选择好要观察的视野，然后关闭普通光源，撤开UV 挡板，观察样品激发萤光情况。
3、利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察时，会受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在进行荧光观察时应抓紧时间，必要时应立即拍照。
姓名 系年级 09级 组别 同组者
科目细胞生物学实验 题目 叶绿体的分离与荧光观察仪器编号
一、实验目的：
1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。
二、实验原理：
将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。沉降顺序为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化氢酶体、内质网与高尔基体、核蛋白体。
将匀浆液在1000 r／min 的条件下离心2min ，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000 r／min 的条件下离心5min ，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。如需获得纯的叶绿体，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。
荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观测的一种技术。某些物质在一定短波长的光(如紫外光)
的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，
就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光) ，这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光) ，如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光) ，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
三、实验试剂及器材：
1、器材：普通离心机、榨汁机、研钵、滴管、漏斗、离心管、天平、量筒、纱布
2、材料：新鲜菠菜
3、试剂：0.35 mol／L 氯化钠溶液、0.01％吖啶橙(acridine orange)
四、实验步骤：
1、选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g 于150ml 0.35 mol ／L NaCI溶液中，装入组织捣碎机。
2、利用组织捣碎机低速(5 000 r／min) 匀浆3~5min。
3、将匀浆用6层纱布过滤于500ml 烧杯中。
4、取滤液4ml 在1000 r／min 下离心2 min。弃去沉淀。
5、将上清液在3000 r／min 下离心5min ，弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核) 。
6、将沉淀用0.35 mol／L NaCl溶液悬浮。
7、取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察： ①在普通光镜下观察；②在荧光显微镜下观察； ③取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0．01％吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察。
五、实验结果：
普通显微镜中菠菜叶的叶绿体（10x40） 普通显微镜中菠菜叶绿体局部放大图（10x40）
荧光显微镜菠菜叶绿体（未染色）（10x40） 荧光显微镜菠菜叶绿体局部放大图（未染色）（10x40）
细胞核
线粒体
荧光显微镜菠菜叶绿体（染色）（10x40） 荧光显微镜菠菜叶绿体局部放大图（染色）（10x40）
六、实验总结：
1、叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好在0-5℃的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。
2、荧光显微镜启动2-3分钟后方可稳定，启动15分钟内不得关闭电源，一旦关闭汞灯，3分钟内不得重启，以延长光源寿命。放置样品后，先在普通光镜下选择好要观察的视野，然后关闭普通光源，撤开UV 挡板，观察样品激发萤光情况。
3、利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察时，会受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在进行荧光观察时应抓紧时间，必要时应立即拍照。