CAT酶活性测定

植物组织中过氧化氢酶的活性测定—紫外吸收法

【原理】

H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与用具】

紫外分光光度计；冷冻离心机；研钵；容量瓶；刻度吸管；恒温水浴；分析天平【试剂】

1. 0.05mol/L pH7.0磷酸缓冲液

2. 0.2mol/L H2O2溶液：30% H2O2 11.36ml溶于磷酸缓冲液中，定量至250ml。 3.0.05 mol/LTris-Hcl缓冲液（pH7.0）【材料】

正常生长或经逆境处理的新鲜植物组织【方法步骤】

1.酶液提取：称取剪碎混匀的植物样品（如叶片等）1.00g置与预冷的研钵中，加入适量预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂冰浴研磨成匀浆后，转入10ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到10ml。取提取液5ml于离心管中，在4℃、15000g下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。4℃下保存备用。

2.CAT活性测定

（1）取10ml具塞试管，加2ml酶提取液于沸水浴中加热煮死，冷却备用。（2）取10ml具塞试管，3支为测定管（3个重复），1支为对照，按下表加入试剂：

将上述4支试管于25℃水浴中预热3min后,逐管加入0.2ml 0.2mol/L的H2O2溶液，每加完一管立即在紫外分光光度计上测定A240（蒸馏水调零），每隔30s读数一次，共测3min,记录4支试管的测定值。（需用石英比色杯） 3.结果计算：

以1min内A240降低0.1（三支测定管的平均值）的酶量为1个酶活单位（u），先求出3支测定管各自1min内A240降低值，按下式计算CAT活性。

A240VT

过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=0.1V1tFW

 3)

式中 A240 = AS0－

AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；

AS1, AS2,As3—样品测定管吸光值；

—

Vt—酶提取液总体积（ml）； V1—测定时用酶液体积（ml）； FW—样品鲜重（g）；

0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。【注意事项】

凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。

【思考题】

1.影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?

2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?