实验一 总糖和还原糖含量的测定
(3,5-二硝基水杨酸法)
一、目的要求:
掌握还原糖和总糖的测定原理,学习用比色法测定还原糖的方法。 二、实验原理:
在NaOH 存在的条件下,3,5-二硝基水杨酸(DNS )与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH 碱性溶液中此化合物呈棕红色,在540nm 波长处有最大吸收,在一定的浓度范围内,还原糖的量与光吸收值呈线性关系,利用比色法可测定样品中的含糖量。
黄色 桔红色
三、试剂和器材
1、试剂
3,5-二硝基水杨酸(DNS )试剂:称取6.5g DNS 溶于少量热蒸馏水中,溶解后移入1000ml 容量瓶中,加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml ,再加入45g 丙三醇,摇匀,冷却后定容至1000ml 。
葡萄糖标准溶液:准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg ,加少量蒸馏水溶解后,以蒸馏水定容至100ml ,即葡萄糖浓度为1.0mg/ml。
6mol/L HCl:取250ml 浓HCl (35%~38%)用蒸馏水稀释到500ml 。
碘-碘化钾溶液:称取5g 碘,10g 碘化钾溶于100ml 蒸馏水中。 6N NaOH:称取120g NaOH溶于500ml 蒸馏水中。 0.1% 酚酞指示剂。 2、材料
山芋淀粉 四、器材
723型分光光度计,分析天平,水浴锅,研钵,烧瓶,试管若干等。
五、操作
1、葡萄糖标准曲线制作
取干净试管6支,按表1进行操作。以吸光值为纵坐标,各标准溶液的浓度(mg ∕ml )为横坐标作图得标准曲线。
管号
试剂
标准葡萄糖溶液∕ml
蒸馏水∕ml DNS 试剂∕ml
蒸馏水∕ml 葡萄糖含量∕mg
A 540nm
2、样品中还原糖的提取与测定
准确称取 0.5g 山芋淀粉,加蒸馏水约3ml ,在研钵中磨成匀浆,转入三角烧瓶中,并用约30ml 的蒸馏水冲洗研钵2-3次,洗出液转入三角烧瓶中。于50℃ 恒温水浴中保温0.5h ,不时搅拌,使还原糖浸出。将浸出液(含沉淀)转移到100ml 离心管中,于4000r ∕min 下离心5min ,沉淀用20ml 蒸馏水洗一次,再离心,将两次离心的上清液合并,用蒸馏水定容至100ml ,混匀,作为还原糖待测液。取1ml 进行还原糖含量测定。 3、样品总糖的水解及提取
准确称取0.5g 山芋淀粉,加蒸馏水约3ml ,在研钵中磨成匀浆,转入三角烧瓶中,并用约12ml 的蒸馏水冲洗研钵2-3次,洗出液转入三角烧瓶中。再向烧瓶中加入6mol/L HCl 10ml ,搅拌均匀后在沸水浴中水解0.5h ,取出1~2滴置于白瓷板上,加1滴I 2-KI 溶液检查水解是否完全。如已水解完全,则不呈现蓝色。水解完毕,冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂,以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色,并用蒸馏水定容至100ml ,过滤,取滤液10ml 于100ml 容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,混匀,即为稀释1000倍的总糖水解液。取1ml 总糖水解液,测定其还原糖含量。
六、结果处理
1、各浓度标准葡萄糖溶液按表1进行反应后,溶液吸光值见表1。以吸光值为纵坐标,各标准溶液的浓度(mg ∕ml )为横坐标作图得标准曲线。如图1所示。
0 0 1.0 2
1 0.2 0.8 2
2 0.4 0.6 2
3 0.6 0.4 2
4 0.8 0.2 2
5 1.0 0 2
沸水浴中准确煮沸5min ,取出,用自来水冷却至室温 9.0 0 0
9.0 0.2 0.051
9.0 0.4 0.110
9.0 0.6 0.150
9.0 0.8 0.205
9.0 1.0 0.253
图1 葡萄糖标准曲线
经分析得标准曲线回归方程为:y=0.2524x+0.0020,相关系数R 2=0.9984。
2、还原糖溶液按照表1进行反应后,测定得到溶液于540nm 处的吸光值为:A 1 将A 1代入回归方程得c 1
还原糖(mg ∕g )= (c 1×100)∕m =
3、总糖溶液按照表1进行反应后,测定得到溶液于540nm 处的吸光值为:A 2 将A 2代入回归方程得c 2=
总糖(mg ∕g )= (c 2×1000×0.9)∕m =
式中:C──还原糖或总糖提取液的浓度,mg/ml;
V──还原糖或总糖提取液的总体积,ml ;
m──样品重量,g ;
0.9──乘以0.9是为了从测定的总糖水解成单糖量中扣除水解时所消耗的水量。
注意事项
标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行,一起显色和比色。
七、思考题
1. 简述3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的原理?
2. 本实验中盐酸、氢氧化钠和碘-碘化钾溶液的作用是什么?
实验一 总糖和还原糖含量的测定
(3,5-二硝基水杨酸法)
一、目的要求:
掌握还原糖和总糖的测定原理,学习用比色法测定还原糖的方法。 二、实验原理:
在NaOH 存在的条件下,3,5-二硝基水杨酸(DNS )与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH 碱性溶液中此化合物呈棕红色,在540nm 波长处有最大吸收,在一定的浓度范围内,还原糖的量与光吸收值呈线性关系,利用比色法可测定样品中的含糖量。
黄色 桔红色
三、试剂和器材
1、试剂
3,5-二硝基水杨酸(DNS )试剂:称取6.5g DNS 溶于少量热蒸馏水中,溶解后移入1000ml 容量瓶中,加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml ,再加入45g 丙三醇,摇匀,冷却后定容至1000ml 。
葡萄糖标准溶液:准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg ,加少量蒸馏水溶解后,以蒸馏水定容至100ml ,即葡萄糖浓度为1.0mg/ml。
6mol/L HCl:取250ml 浓HCl (35%~38%)用蒸馏水稀释到500ml 。
碘-碘化钾溶液:称取5g 碘,10g 碘化钾溶于100ml 蒸馏水中。 6N NaOH:称取120g NaOH溶于500ml 蒸馏水中。 0.1% 酚酞指示剂。 2、材料
山芋淀粉 四、器材
723型分光光度计,分析天平,水浴锅,研钵,烧瓶,试管若干等。
五、操作
1、葡萄糖标准曲线制作
取干净试管6支,按表1进行操作。以吸光值为纵坐标,各标准溶液的浓度(mg ∕ml )为横坐标作图得标准曲线。
管号
试剂
标准葡萄糖溶液∕ml
蒸馏水∕ml DNS 试剂∕ml
蒸馏水∕ml 葡萄糖含量∕mg
A 540nm
2、样品中还原糖的提取与测定
准确称取 0.5g 山芋淀粉,加蒸馏水约3ml ,在研钵中磨成匀浆,转入三角烧瓶中,并用约30ml 的蒸馏水冲洗研钵2-3次,洗出液转入三角烧瓶中。于50℃ 恒温水浴中保温0.5h ,不时搅拌,使还原糖浸出。将浸出液(含沉淀)转移到100ml 离心管中,于4000r ∕min 下离心5min ,沉淀用20ml 蒸馏水洗一次,再离心,将两次离心的上清液合并,用蒸馏水定容至100ml ,混匀,作为还原糖待测液。取1ml 进行还原糖含量测定。 3、样品总糖的水解及提取
准确称取0.5g 山芋淀粉,加蒸馏水约3ml ,在研钵中磨成匀浆,转入三角烧瓶中,并用约12ml 的蒸馏水冲洗研钵2-3次,洗出液转入三角烧瓶中。再向烧瓶中加入6mol/L HCl 10ml ,搅拌均匀后在沸水浴中水解0.5h ,取出1~2滴置于白瓷板上,加1滴I 2-KI 溶液检查水解是否完全。如已水解完全,则不呈现蓝色。水解完毕,冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂,以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色,并用蒸馏水定容至100ml ,过滤,取滤液10ml 于100ml 容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,混匀,即为稀释1000倍的总糖水解液。取1ml 总糖水解液,测定其还原糖含量。
六、结果处理
1、各浓度标准葡萄糖溶液按表1进行反应后,溶液吸光值见表1。以吸光值为纵坐标,各标准溶液的浓度(mg ∕ml )为横坐标作图得标准曲线。如图1所示。
0 0 1.0 2
1 0.2 0.8 2
2 0.4 0.6 2
3 0.6 0.4 2
4 0.8 0.2 2
5 1.0 0 2
沸水浴中准确煮沸5min ,取出,用自来水冷却至室温 9.0 0 0
9.0 0.2 0.051
9.0 0.4 0.110
9.0 0.6 0.150
9.0 0.8 0.205
9.0 1.0 0.253
图1 葡萄糖标准曲线
经分析得标准曲线回归方程为:y=0.2524x+0.0020,相关系数R 2=0.9984。
2、还原糖溶液按照表1进行反应后,测定得到溶液于540nm 处的吸光值为:A 1 将A 1代入回归方程得c 1
还原糖(mg ∕g )= (c 1×100)∕m =
3、总糖溶液按照表1进行反应后,测定得到溶液于540nm 处的吸光值为:A 2 将A 2代入回归方程得c 2=
总糖(mg ∕g )= (c 2×1000×0.9)∕m =
式中:C──还原糖或总糖提取液的浓度,mg/ml;
V──还原糖或总糖提取液的总体积,ml ;
m──样品重量,g ;
0.9──乘以0.9是为了从测定的总糖水解成单糖量中扣除水解时所消耗的水量。
注意事项
标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行,一起显色和比色。
七、思考题
1. 简述3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的原理?
2. 本实验中盐酸、氢氧化钠和碘-碘化钾溶液的作用是什么?