遗 传HEREDITAS (Beijing ) 23(3) :260～262,2001 技术与方法
一种筛选拟南芥突变体的有效方法
赵淑清
(山西大学生物工程实验室, 太原030006)
摘 要:经甲基磺酸乙酯(EMS ) 诱变处理的拟南芥种子, 接种于MS 培养基上, 垂直放置培养4天后, 将幼苗转移至胁迫培养基中, 以倒置幼苗180°所形成的弯曲生长根作为指标筛选拟南芥耐营养胁迫突变体。利用这种方法, 成功地筛选到一个耐低钾的隐性单基因拟南芥突变体。本方法同样适用于其他类型突变体的筛选。关键词:拟南芥; 突变体; 筛选; 根弯曲方法中图分类号:Q319 文献标识码:A
文章编号:0253-9772(2001) 03-0260-03
A E ff icient Method for Isolation of Arabidopsis ZHAO Shu 2(L aboratory of Biotechnology , S hanxi U , Abstract :This paper introduces a root 2of tolerant to nutrition stress. Seeds of wild 2type A rabidopsis mutagenized with ethyl methyl sulfide (EMS ) ,and M2populations 2old seedlings with 12to 1. 52cm 2long roots were transferred from the vertical to agar medium that was supplemented with determinate stress. The seedlings were ar 2ranged in rows , plates were oriented vertically with the roots pointing upward. After another 4days , the root bending seedlings were selected for putative mutants and transferred to soil to grow to maturity. Seeds from the putative mutants were screened again to determine the true mutants. By using this root 2bending assay we have isolated a low 2K +2tolerant (lkt1) mutant which is caused by single recessive nuclear mutation. For lkt1mutant screening , K +concentration
μmol/L because root growth of wild type seedlings was completely inhibited at or below this con 2of the medium was 100
centration. This root 2bending assay is also applicable to other type of A rabidopsis mutant isolation. K ey w ords :A rabidopsis ;mutant ;isolation ;root 2banding assay
拟南芥是十字花科拟南芥属植物, 近年来拟南芥以其个体小、生长周期短以及基因组小等特点而成为分子遗传学研究的模式植物。拟南芥的另一优点是很容易被诱变, 目前已从拟南芥中分离得到了几千种突变体, 这些突变体的获得为揭示植物生长发育规律起了非常重要的作用[1]。拟南芥突变体的筛选已成为许多重要理论问题得以解决的前提, 而筛选方法是突变体筛选成败的关键。本文以拟南芥耐低钾突变体的筛选为例, 介绍一种简单、灵敏、通用的拟南芥突变体的筛选方法。
1. 1 植物材料诱变
以拟南芥(A rabidopsis thaliana cv. L andsberg erecta ) 为材料。诱变方法如下:称取250mg (约5000粒) 野生型种子置于50ml 烧杯内并加入25ml 重蒸水, 搅拌30分钟; 在4℃下放置12小时后, 把种子转移到盛有30ml100mmol/L 磷酸缓冲液(p H6. 5) 的100ml 三角瓶中, 加入0. 2%(v/v ) 的甲基
) 振荡器上振荡12h 。磺酸乙酯(EMS ) , 封口后放在水浴(25℃
然后用50ml 蒸馏水漂洗种子4次, 每次15min 。将漂洗好的种子置于4℃下春化3天后种植。
收稿日期:2000-06-08; 修回日期:2000-09-10
作者简介:赵淑清(1965-) , 女, 山西兴县人, 博士学位, 讲师, 专业方向:植物营养遗传。Tel :0351-7011499,E -mail :[email protected]. cn
3期 赵淑清等:一种筛选拟南芥突变体的有效方法 261
1 材料与方法
1. 1 植物材料诱变
拟南芥种子用0. 5%(v/v ) 次氯酸钠加0. 1%(v/v ) Tri 2
ton X -100表面消毒10分钟, 再用无菌水冲洗3遍。接种
前种子与0. 4%(w/v ) 低熔点琼脂糖混和, 然后用吸管将种子吸出, 成行地涂于MS 培养基上; 将培养皿置于4℃冰箱春化48小时, 之后转入光照培养, 培养皿垂直放置。培养箱温μmol/m 2s -1。度22℃, 连续光照, 光强30
1. 3. 3 根弯曲试验
以拟南芥(A rabidopsis thaliana cv. L andsberg erecta ) 为材料。诱变方法如下:称取250mg (约5000粒) 野生型种子置于50ml 烧杯内并加入25ml 重蒸水, 搅拌30分钟; 在4℃下放置12小时后, 把种子转移到盛有30ml 100mmol/L 磷酸缓冲液(p H6. 5) 的100ml 三角瓶中, 加入012%(v/v ) 的甲基
) 振荡器上振荡12h 。磺酸乙酯(EMS ) , 封口后放在水浴(25℃
将经过灭菌的野生型种子接种于MS 培养基中, 在光照培养箱中(条件同上) 培养4天, 待幼苗根长至1～1. 5cm 时, 再将幼苗转入含有系列不同K +浓度的低钾培养基中, 排列成行, 然后将培养皿倒置, 使根尖朝上, 继续培养。如果根能够继续生长, 则生长的根会由于重力作用而向下弯曲。以野生型拟南芥幼苗完全不能生长(根不发生弯曲) 的K +浓度作为突变体的筛选浓度。
1. 3. 4 突变体筛选
然后用50ml 蒸馏水漂洗种子4次, 每次15min 。将漂洗好的种子置于4℃下春化3天后种植。
1. 2 诱变植株培养
将经EMS 诱变处理后的拟南芥种子(M 1) 播种于用1/4
Hoagland 营养液浸透的混有蛭石的营养土中(营养土:蛭石=2:1, v/v ) , 种植后覆盖塑料薄膜以保持湿度。在温度18
μmol/m 2s -1、～22℃、光照强度120光暗周期16h/8h 条件下培养, 待种子成熟后分行采收种子(M 2代) 。
1. 3 突变体的筛选1. 3. 1 培养基
在确定的选择压力下, M 2代进行筛选, 0. 6%琼脂(w/
v ) , ; 然后转入含有
, 3。M 3代种子再进行。若某一株系的M 3代幼苗仍, 则将其确定为耐低钾突变体。
基本培养基:MS 培养基[2],1. 0%琼脂(w/v ) ,p H 选择培养基(本实验是去钾培养基) :(mg/)
NH 4NO 32350, NH 4H 2PO 4, 2, 47H 2O 370, K +1. 2%(w/v ) ,
2 结 果
2. 1 筛选浓度的确定
蔗糖3%(w/v ) ,p -) 。
1. 3. 2 将根长1～1. 5cm
的野生型拟南芥幼苗转入含有系列
图1 不同浓度K Cl 对拟南芥野生型幼苗根生长的影响
Fig. 1 E ffects of K Cl at V arious Concentrations on R oot G row th of Wild -type Arabidopsis Seedlings
遗 传HEREDITAS (Beijing ) 2001 23卷262
K +浓度的低钾培养基中, 将培养皿转动180°, 垂直放置,4天
形态和生理生化基础研究的进展。即使找到与某一营养性状密切相关的形态和生理生化指标, 也由于测定指标常会损坏植株并且较为麻烦, 所以, 实用性也不强。因此, 选择合适的特异性筛选指标对于筛选的顺利进行是至关重要的。
勿庸置疑, 使植物生长良好是植物营养性状改良的最终目标。所以, 我们以植物生长状况作为指标进行筛选, 并且采用形象、直观的根弯曲作为标志, 使筛选过程简单化、快速化。
根弯曲方法的原理是:在一定的选择压力下, 突变体由于具有忍受胁迫的能力可以正常生长, 非突变体则由于受到胁迫而停止生长, 但这种生长对于大量的选择来说并非一目了然, 所以选择起来比较困难。如果将拟南芥幼苗转至选择培养基后, 把根倒过来培养, 非突变体的根由于不长也就只能停在原来的位置, 而突变体可以在这种选择条件下正常生长, 并因重力作用向下形成弯钩。将根发生弯曲的个体挑选出来, 即为可能的突变体观、灵敏, 。该方法在镉、钠、[5, 6, 7], 是。
后幼苗根生长情况见图1。由图中可见, 野生型拟南芥幼苗μmol/L 时已被完全抑制。在200根的生长在K +浓度为100
μmol/L K +时, 根已有较明显的生长。所以本实验用于筛选耐低钾突变体的低钾浓度被确定为100μmol/L 。
2. 2 突变体筛选
对7万粒M 2代种子在100μmol/L K +的选择压力下利用根弯曲方法进行了筛选, 共得到60株可能突变体。对其
M 3代种子在同样选择压力下又进行了筛选, 其中一株(M -33) 的M 3代幼苗根仍表现弯曲, 说明该株系的后代在低钾条
件下根仍可以生长, 且它的耐低钾性状可以稳定遗传, 是真正的突变体。
3 讨 论
据理论估算, 每5万株经诱变的拟南芥子代(M 2) , 其基因组中的每一个基因至少有一次发生突变的机会。对于这样较大规模的筛选工作, 采用组织培养方法在培养基上进行是比较经济有效的。对于突变体筛选的成败, 筛选方法是非常关键的。越是专一的筛选条件, 就越有机会直接获得所期望的突变体。最好的例子是正选择法, 或一定的培养条件, 常生长。K oornneef 陷型突变体
[3]
(R eferences) :
[1] Meinke D W ,Cherry J M ,Dean C , et al. A rabidopsis thaliana :Am od 2
el plant for genome analysis[J].Science ,1998,282:662～682. [2] Murashige T , Skoog F. A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue culture [J].Physiol Plant ,1962,15:473～497.
[3] K oornneef M ,Jorna M L ,Brinkhorst 2van der Swan D L C , et al.
The isolation of abscisic acid (ABA ) deficient mutants by selection of induced revertants in nongerminating gibberellin sensitive lines of A rabi dopsis thaliana (L. ) Heynh [J ].Theor Appl G enet , 1982,61:385.
[4] Parks B M , Quail P H. Hy8, a new class of A rabi dopsis long
hypocotyl mutants deficient in functional phytochrome A[J].Plant Cell ,1993,5:39.
[5] Howden R ,Cobbett C S. Cadmium 2sensitive mutants of A rabi dop 2
sis thaliana [J].Plant Physiol ,1992,99:100～107.
[4]
。运用
。
, 适当的选择压力应当是既能使突变体的优势得到发挥, 又能使野生型受到足够的压力而不能表现。换句话说, 就是筛选浓度既不至于过高而使一些本来没有突变的个体被认为是突变体; 也不至于过低而使真正的突变体被淘汰掉。那么, 在筛选突变体之前, 首先要设计一系列的筛选浓度, 以野生型完全不能生长的浓度确定为筛选浓度。
筛选指标是突变体筛选的又一关键。常规的植物育种主要根据相对产量(生物量) 和外观征状等综合指标来进行, 并认为植物对营养胁迫的抗性也会同时遗传保持下去。这虽然有其正确的一面, 但因缺乏特异抗性指标的指导, 不仅使得选择周期加长, 而且针对性不强。进行遗传工程育种缺乏特异性抗性指标时, 常常会由于无特异性状标记而难以进行有关基因的定位, 有时甚至会产生错误的结果。另外, 植物形态和生理生化指标也是植物营养性状基因型差异选择的常用指标, 但这些指标的确立首先取决于植物营养性状的
[6] Wu S J ,Ding L ,Zhu J K. SOS1,a genetic locus essential for salt toler 2
ance and potassium acquisition[J].Plant Cell ,1996,8:617～627. [7] Zhao Shu 2Qing ,Wu Wei 2Hua. Isolation and genetic analysis of low
K +-tolereant (L KT ) A rabi dopsis mutants[C].The American So 2ciety of Plant Physiologists ,1999,452.
遗 传HEREDITAS (Beijing ) 23(3) :260～262,2001 技术与方法
一种筛选拟南芥突变体的有效方法
赵淑清
(山西大学生物工程实验室, 太原030006)
摘 要:经甲基磺酸乙酯(EMS ) 诱变处理的拟南芥种子, 接种于MS 培养基上, 垂直放置培养4天后, 将幼苗转移至胁迫培养基中, 以倒置幼苗180°所形成的弯曲生长根作为指标筛选拟南芥耐营养胁迫突变体。利用这种方法, 成功地筛选到一个耐低钾的隐性单基因拟南芥突变体。本方法同样适用于其他类型突变体的筛选。关键词:拟南芥; 突变体; 筛选; 根弯曲方法中图分类号:Q319 文献标识码:A
文章编号:0253-9772(2001) 03-0260-03
A E ff icient Method for Isolation of Arabidopsis ZHAO Shu 2(L aboratory of Biotechnology , S hanxi U , Abstract :This paper introduces a root 2of tolerant to nutrition stress. Seeds of wild 2type A rabidopsis mutagenized with ethyl methyl sulfide (EMS ) ,and M2populations 2old seedlings with 12to 1. 52cm 2long roots were transferred from the vertical to agar medium that was supplemented with determinate stress. The seedlings were ar 2ranged in rows , plates were oriented vertically with the roots pointing upward. After another 4days , the root bending seedlings were selected for putative mutants and transferred to soil to grow to maturity. Seeds from the putative mutants were screened again to determine the true mutants. By using this root 2bending assay we have isolated a low 2K +2tolerant (lkt1) mutant which is caused by single recessive nuclear mutation. For lkt1mutant screening , K +concentration
μmol/L because root growth of wild type seedlings was completely inhibited at or below this con 2of the medium was 100
centration. This root 2bending assay is also applicable to other type of A rabidopsis mutant isolation. K ey w ords :A rabidopsis ;mutant ;isolation ;root 2banding assay
拟南芥是十字花科拟南芥属植物, 近年来拟南芥以其个体小、生长周期短以及基因组小等特点而成为分子遗传学研究的模式植物。拟南芥的另一优点是很容易被诱变, 目前已从拟南芥中分离得到了几千种突变体, 这些突变体的获得为揭示植物生长发育规律起了非常重要的作用[1]。拟南芥突变体的筛选已成为许多重要理论问题得以解决的前提, 而筛选方法是突变体筛选成败的关键。本文以拟南芥耐低钾突变体的筛选为例, 介绍一种简单、灵敏、通用的拟南芥突变体的筛选方法。
1. 1 植物材料诱变
以拟南芥(A rabidopsis thaliana cv. L andsberg erecta ) 为材料。诱变方法如下:称取250mg (约5000粒) 野生型种子置于50ml 烧杯内并加入25ml 重蒸水, 搅拌30分钟; 在4℃下放置12小时后, 把种子转移到盛有30ml100mmol/L 磷酸缓冲液(p H6. 5) 的100ml 三角瓶中, 加入0. 2%(v/v ) 的甲基
) 振荡器上振荡12h 。磺酸乙酯(EMS ) , 封口后放在水浴(25℃
然后用50ml 蒸馏水漂洗种子4次, 每次15min 。将漂洗好的种子置于4℃下春化3天后种植。
收稿日期:2000-06-08; 修回日期:2000-09-10
作者简介:赵淑清(1965-) , 女, 山西兴县人, 博士学位, 讲师, 专业方向:植物营养遗传。Tel :0351-7011499,E -mail :[email protected]. cn
3期 赵淑清等:一种筛选拟南芥突变体的有效方法 261
1 材料与方法
1. 1 植物材料诱变
拟南芥种子用0. 5%(v/v ) 次氯酸钠加0. 1%(v/v ) Tri 2
ton X -100表面消毒10分钟, 再用无菌水冲洗3遍。接种
前种子与0. 4%(w/v ) 低熔点琼脂糖混和, 然后用吸管将种子吸出, 成行地涂于MS 培养基上; 将培养皿置于4℃冰箱春化48小时, 之后转入光照培养, 培养皿垂直放置。培养箱温μmol/m 2s -1。度22℃, 连续光照, 光强30
1. 3. 3 根弯曲试验
以拟南芥(A rabidopsis thaliana cv. L andsberg erecta ) 为材料。诱变方法如下:称取250mg (约5000粒) 野生型种子置于50ml 烧杯内并加入25ml 重蒸水, 搅拌30分钟; 在4℃下放置12小时后, 把种子转移到盛有30ml 100mmol/L 磷酸缓冲液(p H6. 5) 的100ml 三角瓶中, 加入012%(v/v ) 的甲基
) 振荡器上振荡12h 。磺酸乙酯(EMS ) , 封口后放在水浴(25℃
将经过灭菌的野生型种子接种于MS 培养基中, 在光照培养箱中(条件同上) 培养4天, 待幼苗根长至1～1. 5cm 时, 再将幼苗转入含有系列不同K +浓度的低钾培养基中, 排列成行, 然后将培养皿倒置, 使根尖朝上, 继续培养。如果根能够继续生长, 则生长的根会由于重力作用而向下弯曲。以野生型拟南芥幼苗完全不能生长(根不发生弯曲) 的K +浓度作为突变体的筛选浓度。
1. 3. 4 突变体筛选
然后用50ml 蒸馏水漂洗种子4次, 每次15min 。将漂洗好的种子置于4℃下春化3天后种植。
1. 2 诱变植株培养
将经EMS 诱变处理后的拟南芥种子(M 1) 播种于用1/4
Hoagland 营养液浸透的混有蛭石的营养土中(营养土:蛭石=2:1, v/v ) , 种植后覆盖塑料薄膜以保持湿度。在温度18
μmol/m 2s -1、～22℃、光照强度120光暗周期16h/8h 条件下培养, 待种子成熟后分行采收种子(M 2代) 。
1. 3 突变体的筛选1. 3. 1 培养基
在确定的选择压力下, M 2代进行筛选, 0. 6%琼脂(w/
v ) , ; 然后转入含有
, 3。M 3代种子再进行。若某一株系的M 3代幼苗仍, 则将其确定为耐低钾突变体。
基本培养基:MS 培养基[2],1. 0%琼脂(w/v ) ,p H 选择培养基(本实验是去钾培养基) :(mg/)
NH 4NO 32350, NH 4H 2PO 4, 2, 47H 2O 370, K +1. 2%(w/v ) ,
2 结 果
2. 1 筛选浓度的确定
蔗糖3%(w/v ) ,p -) 。
1. 3. 2 将根长1～1. 5cm
的野生型拟南芥幼苗转入含有系列
图1 不同浓度K Cl 对拟南芥野生型幼苗根生长的影响
Fig. 1 E ffects of K Cl at V arious Concentrations on R oot G row th of Wild -type Arabidopsis Seedlings
遗 传HEREDITAS (Beijing ) 2001 23卷262
K +浓度的低钾培养基中, 将培养皿转动180°, 垂直放置,4天
形态和生理生化基础研究的进展。即使找到与某一营养性状密切相关的形态和生理生化指标, 也由于测定指标常会损坏植株并且较为麻烦, 所以, 实用性也不强。因此, 选择合适的特异性筛选指标对于筛选的顺利进行是至关重要的。
勿庸置疑, 使植物生长良好是植物营养性状改良的最终目标。所以, 我们以植物生长状况作为指标进行筛选, 并且采用形象、直观的根弯曲作为标志, 使筛选过程简单化、快速化。
根弯曲方法的原理是:在一定的选择压力下, 突变体由于具有忍受胁迫的能力可以正常生长, 非突变体则由于受到胁迫而停止生长, 但这种生长对于大量的选择来说并非一目了然, 所以选择起来比较困难。如果将拟南芥幼苗转至选择培养基后, 把根倒过来培养, 非突变体的根由于不长也就只能停在原来的位置, 而突变体可以在这种选择条件下正常生长, 并因重力作用向下形成弯钩。将根发生弯曲的个体挑选出来, 即为可能的突变体观、灵敏, 。该方法在镉、钠、[5, 6, 7], 是。
后幼苗根生长情况见图1。由图中可见, 野生型拟南芥幼苗μmol/L 时已被完全抑制。在200根的生长在K +浓度为100
μmol/L K +时, 根已有较明显的生长。所以本实验用于筛选耐低钾突变体的低钾浓度被确定为100μmol/L 。
2. 2 突变体筛选
对7万粒M 2代种子在100μmol/L K +的选择压力下利用根弯曲方法进行了筛选, 共得到60株可能突变体。对其
M 3代种子在同样选择压力下又进行了筛选, 其中一株(M -33) 的M 3代幼苗根仍表现弯曲, 说明该株系的后代在低钾条
件下根仍可以生长, 且它的耐低钾性状可以稳定遗传, 是真正的突变体。
3 讨 论
据理论估算, 每5万株经诱变的拟南芥子代(M 2) , 其基因组中的每一个基因至少有一次发生突变的机会。对于这样较大规模的筛选工作, 采用组织培养方法在培养基上进行是比较经济有效的。对于突变体筛选的成败, 筛选方法是非常关键的。越是专一的筛选条件, 就越有机会直接获得所期望的突变体。最好的例子是正选择法, 或一定的培养条件, 常生长。K oornneef 陷型突变体
[3]
(R eferences) :
[1] Meinke D W ,Cherry J M ,Dean C , et al. A rabidopsis thaliana :Am od 2
el plant for genome analysis[J].Science ,1998,282:662～682. [2] Murashige T , Skoog F. A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue culture [J].Physiol Plant ,1962,15:473～497.
[3] K oornneef M ,Jorna M L ,Brinkhorst 2van der Swan D L C , et al.
The isolation of abscisic acid (ABA ) deficient mutants by selection of induced revertants in nongerminating gibberellin sensitive lines of A rabi dopsis thaliana (L. ) Heynh [J ].Theor Appl G enet , 1982,61:385.
[4] Parks B M , Quail P H. Hy8, a new class of A rabi dopsis long
hypocotyl mutants deficient in functional phytochrome A[J].Plant Cell ,1993,5:39.
[5] Howden R ,Cobbett C S. Cadmium 2sensitive mutants of A rabi dop 2
sis thaliana [J].Plant Physiol ,1992,99:100～107.
[4]
。运用
。
, 适当的选择压力应当是既能使突变体的优势得到发挥, 又能使野生型受到足够的压力而不能表现。换句话说, 就是筛选浓度既不至于过高而使一些本来没有突变的个体被认为是突变体; 也不至于过低而使真正的突变体被淘汰掉。那么, 在筛选突变体之前, 首先要设计一系列的筛选浓度, 以野生型完全不能生长的浓度确定为筛选浓度。
筛选指标是突变体筛选的又一关键。常规的植物育种主要根据相对产量(生物量) 和外观征状等综合指标来进行, 并认为植物对营养胁迫的抗性也会同时遗传保持下去。这虽然有其正确的一面, 但因缺乏特异抗性指标的指导, 不仅使得选择周期加长, 而且针对性不强。进行遗传工程育种缺乏特异性抗性指标时, 常常会由于无特异性状标记而难以进行有关基因的定位, 有时甚至会产生错误的结果。另外, 植物形态和生理生化指标也是植物营养性状基因型差异选择的常用指标, 但这些指标的确立首先取决于植物营养性状的
[6] Wu S J ,Ding L ,Zhu J K. SOS1,a genetic locus essential for salt toler 2
ance and potassium acquisition[J].Plant Cell ,1996,8:617～627. [7] Zhao Shu 2Qing ,Wu Wei 2Hua. Isolation and genetic analysis of low
K +-tolereant (L KT ) A rabi dopsis mutants[C].The American So 2ciety of Plant Physiologists ,1999,452.