摘要：锌指蛋白核酸酶（Zinc Finger Nuclease，ZFN）是一种人工合成酶，含有锌指蛋白和FokⅠ核酸内切酶的剪切结构域，因其能特异性识别并切割DNA序列及其可设计性而被用基因定点突变和外源基因定点整合。这项技术已应用于转基因动物研究中。本文综述了锌指核酸酶技术在转基因研究中的应用进展，并对锌指核酸酶技术的应用前景进行了展望。 关键词：锌指蛋白； 锌指核酸酶；基因打靶；同源重组；转基因动物 中图分类号：Q503文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）02-0135-04 基因打靶主要是依赖同源重组及体细胞核移植完成对基因的特定改造，但同源重组及体细胞核移植的方法概率低、成本高。因此人们尝试发现新的基因打靶技术并应用于动植物转基因研究中。锌指核酸酶（ZFN）技术的应用大大提高了基因定点整合效率。锌指核酸酶是锌指蛋白和FokⅠ核酸内切酶的剪切结构域组成的融合蛋白，其锌指蛋白结构域负责识别靶位点，依赖FokⅠ的作用打断DNA双链，从而造成双链断裂（Double Strand Break，DSB）。修复DNA双链断裂的主要途径是同源重组，利用ZFN特异断裂靶基因位点，可提高同源重组效率，故人工设计合成的锌指嵌合核酸酶技术提供了新的基因打靶平台。本文对锌指核酸酶技术研究及其在转基因方面的应用进行了介绍。 1锌指蛋白 1.1锌指蛋白及其分类 锌指结构于1983年首次在非洲爪蟾转录因子TF ⅢA中被发现[1，2]。近30年已从不同生物体发现了十多种锌指结构，但不同种属中典型锌指数目和相邻锌指间连接的长度有很大不同。锌指结构是由多个半光氨酸和（或）组氨酸与锌离子螯合组成四面体结构。锌离子的存在是锌指蛋白发挥调控作用的关键，当用螯合剂除去锌离子， 或用 Fe、Cu、Mn、Co、Ni 等金属离子置换锌离子后，锌指蛋白与 DNA等结合特异性就会显著地被抑制，同时蛋白本身的结构稳定性也会被破坏，影响基因表达[1]。用半胱氨酸或组氨酸代替锌离子通常也会导致锌指功能的丧失。由此可见，锌指结构的稳定性保证了锌指功能的有效性 。 根据锌指结构序列和功能的不同可将锌指蛋白分为9大类： Cys2His2、Cys8、Cys6、Cys3HisCys4、Cys2HisCys、Cys2HisCys5、Cys4、Cys3His、Cys4HisCys3[3]。Krishna[4]根据锌指的空间结构将其分类为： 类C2H2型锌指、塞结状锌指、高音谱号锌指、带状锌指、Zn2/Cys6型锌指、类TAZ2型锌指、锌离子结合短环锌指和金属硫蛋白锌指，每一种锌指都可以在8 组不同的折叠群中找到相应的归类。根据锌指蛋白保守结构域的差异可分为C2H2型、C4型和C6型3种类型[5]，其中C2H2型（Cys2His2）为最广泛的一类。C2H2型锌指由若干个重复单位组成，每个单位含30个氨基酸残基（序列：C2X2242C2X122H 2X3252H，其中C代表半胱氨酸，H代表组氨酸，X代表任何氨基酸）。这些序列在锌指存在时折叠形成紧密的ββα结构，其中锌离子夹叠在α螺旋和两股反向平行的β链中 ，与β链末端的2个半胱氨酸和α螺旋C末端的2 个组氨酸形成四面体结构。 1.2重组锌指蛋白及其应用 对含有多个C2H2型锌指基序的蛋白来说，在连续的两个锌指结构间存在着高度保守的连接子，保持C2H2锌指的基本骨架不变，替换锌指其它位点的氨基酸残基就可以产生不同序列特异性的锌指基序[6]，这些基序串联在一起就可以形成与DNA序列结合且具有特定靶向性的锌指蛋白[7]。锌指蛋白可以和不同的功能性结构域连接形成具有不同功能的融合蛋白，例如锌指核酸酶（Zinc Finger Nuclease，ZFN）[8，9]，锌指转录激活因子（Zinc Finger Transcription Activators，ZFA）[9～12]，锌指转录阻遏因子（Zinc Finger Transcription Repressors，ZFR）[13，14]，锌指甲基化酶（Zinc Finger Methylases，ZFM）[15]等。可见，人造锌指蛋白为基因工程研究提供了强有力的技术平台。 2锌指核酸酶技术 2.1锌指核酸酶基本结构 锌指核酸酶（ZFN）由一个DNA识别结构域和一个非特异性核酸内切酶的剪切结构域融合而成。此酶N末端为锌指蛋白DNA结合域，由一系列Cys2-His2锌指蛋白串联组成，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。C末端为非特异性核酸酶Fok Ⅰ剪切结构域，Fok Ⅰ是海床黄杆菌（Flavobacterium okeanokoites）表达的一种限制性内切酶，当两个单体形成二聚体时才具有活性[16]。 2.2锌指核酸酶的构建及筛选 锌指蛋白核酸酶技术已经被成功用于动植物基因改造实验中，具有非常高的基因整合效率[17～21]。而在整个实验流程中，设计特异性的锌指蛋白（Zinc Finger Protein，ZFP）是最关键的环节。ZFN识别结构域的设计思路主要有两种：其一是模块组装法 （Modular Assembly）[22]，简单地将能够识别三个连续碱基的锌指作为一个“模块”，再根据目标序列把不同的 “模块”拼接在一起；另一种是寡聚体库工程法[23]，应用该方法产生的ZFNs与靶DNA有高度的亲和性和特异性。 3锌指核酸酶在转基因研究中的应用3.1锌指核酸酶介导的基因定点敲除 传统的基因打靶技术效率非常低，制约了基因功能及转基因生物等的研究。ZFN技术为上述研究提供了一种理想的技术手段。 2001年Bibikova等[24]构建了一个ZFN特异识别的靶基因质粒载体，该载体与表达ZFN的质粒共注入卵母细胞，发现ZFN能将靶基因切开，并且通过同源重组修复了该切口。2002年他们又应用ZFN敲除了位于X染色体上的Yellow基因，并发现变异可稳定遗传给后代[25]，从而证明ZFN可用于转基因动物的研究中。 将ZFN mRNA注入到斑马鱼单细胞胚胎发现20%成体的Ntl基因位点发生了突变并表现出相应的突变性状。研究中，有30%～50%的个体将ZFN诱导的突变传给了子代，而7%～18%的子代为突变型[17]。 Meng等[26]将针对斑马鱼血管内皮细胞生长因子受体基因设计的ZFN mRNA注射入一细胞期的斑马鱼胚胎中，导致很高的突变效率，虽然突变存在脱靶现象，但是实验结果表明可以直接注射mRNA到脊椎动物胚胎中，实现基因打靶。 2010年，Watanabe[27]设计了针对增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的ZFN，利用ZFN将本身稳定表达EGFP的猪原代成纤维细胞系中的EGFP敲除，经序列和流式细胞检测分析，ZFN诱导的突变包括在ZFN切割位点的碱基替换、敲除或插入，这为转基因猪的产生提供一个模型[27]。 利用专门打靶GGTA 1基因编码半乳糖苷酶转移酶的催化区域的一对ZFN，产生出GGTA 1基因敲除的母猪，同时，将ZFN电转染入雄猪的胚胎成纤维细胞中，经鉴定打靶效率为5.7%，获得GGTA 1基因敲除的雄猪，说明ZFN在雌雄细胞系中都能工作，为人类疾病的治疗提供了一个模型[28]。 Moreno等[29]针对肾素设计的一对ZFN，可使第5外显子上缺失10个碱基，从而产生移码突变，产生的Ren-/-的小鼠中无血浆肾素活性，在肾小球旁细胞无肾素蛋白的表达，与正常小鼠相比，小鼠体重减轻，血压降低，血尿素氮和血浆肌酐升高等，ZFN技术为心血管疾病的研究提供各种遗传背景的模型。 3.2锌指核酸酶介导的基因定点重组 研究已表明ZFN技术可显著提高基因的靶向敲除效率，然而最近研究发现，ZFN技术也可以提高同源重组的效率。 Porteus等[30]证明了ZFN可以在哺乳动物体细胞上实现基因打靶。他们将构建好的ZFN特异识别序列插入到GFP基因中，并将其整合入人胚肾（HEK293）细胞，建立含有突变型GFP的HEK293稳定细胞系，然后将连接在CMV启动子上的ZFN表达质粒和表达野生型GFP的同源供体质粒共转染该稳定细胞系。结果显示，部分细胞的突变GFP基因得到修复，转变为GFP正常表达的细胞。 将针对人内源基因IL2Rγ设计的带4个锌指结构域的ZFN和IL2Rγ同源打靶载体共转染K562细胞，发现20%的细胞发生了同源重组。Urnov在mRNA和蛋白质水平上验证了此结果[31]。 Erica等[32]利用ZFN将编码四个氨基酸的标签序列、GFP表达框、带有poly（A）尾巴的GFP表达框和带有启动子的GFP表达框在ZFNs介导下分别整合入K562细胞中的IL2Rγ基因，效率分别为15%、6%、3%和6%。可见，ZFN可以在哺乳动物体细胞上显著提高基因打靶效率，这为基因的定点整合和诱导突变提供了一个非常有力的工具。 2010年，Melanie等[33]针对小鼠Rosa26基因设计了一对ZFN，并且将构建的潮霉素基因同源打靶载体、β-半乳糖苷酶及Venus同源打靶载体，分别和ZFN的mRNA共同注射入小鼠原核胚胎，产生转基因小鼠，经鉴定同源打靶效率为1.7%～4.5%[33]。 4结语或展望 研究发现，ZFN技术能够快速有效地在细胞水平或者个体水平上进行基因敲除和基因插入的操作，为尚未获得ES细胞的转基因物种提供了基因操作的可能性。然而ZFN技术也存在一些不足，研究证实ZFN在细胞内表达后具有毒性及副作用[25]，还需要更深入地研究并解决相关问题。ZFN作为新兴的基因打靶的有力工具，存在着巨大的潜力和价值，通过研究人员的不断努力和探索，ZFN技术会越来越完善，并推动动物转基因产业的快速发展。参考文献： [1]Miller J，McLaehlan A D，Klug A.Repetitive zinc binding domains in the protein transcription factor ⅢA from Xenopus oocytes[J].EMBO J.， 1985， 4：1609-1614. [2]Lee M S，Gippert G P，Soman K V.Three-dimensional solution structure of a single zinc finger DNA-binding domain[J].Science， 1989， 245：635-637. [3]Berg J M， Shi Y. The galvanization of biology： a growing appreciation for the roles of zinc[J]. Science，1996，271：1081-1085. [4]Krishna S S， Majumdar I， Grishin N V. Structural classification of zinc fingers survey and summary[J]. Nucleic Acids Res.， 2003， 31（2）：532-550. [5]MacPherson S， Larochelle M， Turcotte B. A fungal family of transcriptional regulators： the zinc cluster proteins[J]. Microbiol. Rev.， 2006， 70：583-604. [6]Porteus M H，Carroll D. Gene targeting using zinc finger nucleases[J]. Nat. Biotechnol.， 2005， 23（8）：967-973. [7]Kim J S， Pabo C O.Getting a handhold on DNA： Design of poly-zinc finger proteins with femtomolar dissociation constants[J]. PNAS， 1998， 95：2812-2817. [8]Smith J， Bibikova M， Whitny F G. Requirements for double-strand cleavage by chimeric restriction enzyme with zinc finger DNA-recognition domains[J]. 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摘要：锌指蛋白核酸酶（Zinc Finger Nuclease，ZFN）是一种人工合成酶，含有锌指蛋白和FokⅠ核酸内切酶的剪切结构域，因其能特异性识别并切割DNA序列及其可设计性而被用基因定点突变和外源基因定点整合。这项技术已应用于转基因动物研究中。本文综述了锌指核酸酶技术在转基因研究中的应用进展，并对锌指核酸酶技术的应用前景进行了展望。 关键词：锌指蛋白； 锌指核酸酶；基因打靶；同源重组；转基因动物 中图分类号：Q503文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）02-0135-04 基因打靶主要是依赖同源重组及体细胞核移植完成对基因的特定改造，但同源重组及体细胞核移植的方法概率低、成本高。因此人们尝试发现新的基因打靶技术并应用于动植物转基因研究中。锌指核酸酶（ZFN）技术的应用大大提高了基因定点整合效率。锌指核酸酶是锌指蛋白和FokⅠ核酸内切酶的剪切结构域组成的融合蛋白，其锌指蛋白结构域负责识别靶位点，依赖FokⅠ的作用打断DNA双链，从而造成双链断裂（Double Strand Break，DSB）。修复DNA双链断裂的主要途径是同源重组，利用ZFN特异断裂靶基因位点，可提高同源重组效率，故人工设计合成的锌指嵌合核酸酶技术提供了新的基因打靶平台。本文对锌指核酸酶技术研究及其在转基因方面的应用进行了介绍。 1锌指蛋白 1.1锌指蛋白及其分类 锌指结构于1983年首次在非洲爪蟾转录因子TF ⅢA中被发现[1，2]。近30年已从不同生物体发现了十多种锌指结构，但不同种属中典型锌指数目和相邻锌指间连接的长度有很大不同。锌指结构是由多个半光氨酸和（或）组氨酸与锌离子螯合组成四面体结构。锌离子的存在是锌指蛋白发挥调控作用的关键，当用螯合剂除去锌离子， 或用 Fe、Cu、Mn、Co、Ni 等金属离子置换锌离子后，锌指蛋白与 DNA等结合特异性就会显著地被抑制，同时蛋白本身的结构稳定性也会被破坏，影响基因表达[1]。用半胱氨酸或组氨酸代替锌离子通常也会导致锌指功能的丧失。由此可见，锌指结构的稳定性保证了锌指功能的有效性 。 根据锌指结构序列和功能的不同可将锌指蛋白分为9大类： Cys2His2、Cys8、Cys6、Cys3HisCys4、Cys2HisCys、Cys2HisCys5、Cys4、Cys3His、Cys4HisCys3[3]。Krishna[4]根据锌指的空间结构将其分类为： 类C2H2型锌指、塞结状锌指、高音谱号锌指、带状锌指、Zn2/Cys6型锌指、类TAZ2型锌指、锌离子结合短环锌指和金属硫蛋白锌指，每一种锌指都可以在8 组不同的折叠群中找到相应的归类。根据锌指蛋白保守结构域的差异可分为C2H2型、C4型和C6型3种类型[5]，其中C2H2型（Cys2His2）为最广泛的一类。C2H2型锌指由若干个重复单位组成，每个单位含30个氨基酸残基（序列：C2X2242C2X122H 2X3252H，其中C代表半胱氨酸，H代表组氨酸，X代表任何氨基酸）。这些序列在锌指存在时折叠形成紧密的ββα结构，其中锌离子夹叠在α螺旋和两股反向平行的β链中 ，与β链末端的2个半胱氨酸和α螺旋C末端的2 个组氨酸形成四面体结构。 1.2重组锌指蛋白及其应用 对含有多个C2H2型锌指基序的蛋白来说，在连续的两个锌指结构间存在着高度保守的连接子，保持C2H2锌指的基本骨架不变，替换锌指其它位点的氨基酸残基就可以产生不同序列特异性的锌指基序[6]，这些基序串联在一起就可以形成与DNA序列结合且具有特定靶向性的锌指蛋白[7]。锌指蛋白可以和不同的功能性结构域连接形成具有不同功能的融合蛋白，例如锌指核酸酶（Zinc Finger Nuclease，ZFN）[8，9]，锌指转录激活因子（Zinc Finger Transcription Activators，ZFA）[9～12]，锌指转录阻遏因子（Zinc Finger Transcription Repressors，ZFR）[13，14]，锌指甲基化酶（Zinc Finger Methylases，ZFM）[15]等。可见，人造锌指蛋白为基因工程研究提供了强有力的技术平台。 2锌指核酸酶技术 2.1锌指核酸酶基本结构 锌指核酸酶（ZFN）由一个DNA识别结构域和一个非特异性核酸内切酶的剪切结构域融合而成。此酶N末端为锌指蛋白DNA结合域，由一系列Cys2-His2锌指蛋白串联组成，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。C末端为非特异性核酸酶Fok Ⅰ剪切结构域，Fok Ⅰ是海床黄杆菌（Flavobacterium okeanokoites）表达的一种限制性内切酶，当两个单体形成二聚体时才具有活性[16]。 2.2锌指核酸酶的构建及筛选 锌指蛋白核酸酶技术已经被成功用于动植物基因改造实验中，具有非常高的基因整合效率[17～21]。而在整个实验流程中，设计特异性的锌指蛋白（Zinc Finger Protein，ZFP）是最关键的环节。ZFN识别结构域的设计思路主要有两种：其一是模块组装法 （Modular Assembly）[22]，简单地将能够识别三个连续碱基的锌指作为一个“模块”，再根据目标序列把不同的 “模块”拼接在一起；另一种是寡聚体库工程法[23]，应用该方法产生的ZFNs与靶DNA有高度的亲和性和特异性。 3锌指核酸酶在转基因研究中的应用3.1锌指核酸酶介导的基因定点敲除 传统的基因打靶技术效率非常低，制约了基因功能及转基因生物等的研究。ZFN技术为上述研究提供了一种理想的技术手段。 2001年Bibikova等[24]构建了一个ZFN特异识别的靶基因质粒载体，该载体与表达ZFN的质粒共注入卵母细胞，发现ZFN能将靶基因切开，并且通过同源重组修复了该切口。2002年他们又应用ZFN敲除了位于X染色体上的Yellow基因，并发现变异可稳定遗传给后代[25]，从而证明ZFN可用于转基因动物的研究中。 将ZFN mRNA注入到斑马鱼单细胞胚胎发现20%成体的Ntl基因位点发生了突变并表现出相应的突变性状。研究中，有30%～50%的个体将ZFN诱导的突变传给了子代，而7%～18%的子代为突变型[17]。 Meng等[26]将针对斑马鱼血管内皮细胞生长因子受体基因设计的ZFN mRNA注射入一细胞期的斑马鱼胚胎中，导致很高的突变效率，虽然突变存在脱靶现象，但是实验结果表明可以直接注射mRNA到脊椎动物胚胎中，实现基因打靶。 2010年，Watanabe[27]设计了针对增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的ZFN，利用ZFN将本身稳定表达EGFP的猪原代成纤维细胞系中的EGFP敲除，经序列和流式细胞检测分析，ZFN诱导的突变包括在ZFN切割位点的碱基替换、敲除或插入，这为转基因猪的产生提供一个模型[27]。 利用专门打靶GGTA 1基因编码半乳糖苷酶转移酶的催化区域的一对ZFN，产生出GGTA 1基因敲除的母猪，同时，将ZFN电转染入雄猪的胚胎成纤维细胞中，经鉴定打靶效率为5.7%，获得GGTA 1基因敲除的雄猪，说明ZFN在雌雄细胞系中都能工作，为人类疾病的治疗提供了一个模型[28]。 Moreno等[29]针对肾素设计的一对ZFN，可使第5外显子上缺失10个碱基，从而产生移码突变，产生的Ren-/-的小鼠中无血浆肾素活性，在肾小球旁细胞无肾素蛋白的表达，与正常小鼠相比，小鼠体重减轻，血压降低，血尿素氮和血浆肌酐升高等，ZFN技术为心血管疾病的研究提供各种遗传背景的模型。 3.2锌指核酸酶介导的基因定点重组 研究已表明ZFN技术可显著提高基因的靶向敲除效率，然而最近研究发现，ZFN技术也可以提高同源重组的效率。 Porteus等[30]证明了ZFN可以在哺乳动物体细胞上实现基因打靶。他们将构建好的ZFN特异识别序列插入到GFP基因中，并将其整合入人胚肾（HEK293）细胞，建立含有突变型GFP的HEK293稳定细胞系，然后将连接在CMV启动子上的ZFN表达质粒和表达野生型GFP的同源供体质粒共转染该稳定细胞系。结果显示，部分细胞的突变GFP基因得到修复，转变为GFP正常表达的细胞。 将针对人内源基因IL2Rγ设计的带4个锌指结构域的ZFN和IL2Rγ同源打靶载体共转染K562细胞，发现20%的细胞发生了同源重组。Urnov在mRNA和蛋白质水平上验证了此结果[31]。 Erica等[32]利用ZFN将编码四个氨基酸的标签序列、GFP表达框、带有poly（A）尾巴的GFP表达框和带有启动子的GFP表达框在ZFNs介导下分别整合入K562细胞中的IL2Rγ基因，效率分别为15%、6%、3%和6%。可见，ZFN可以在哺乳动物体细胞上显著提高基因打靶效率，这为基因的定点整合和诱导突变提供了一个非常有力的工具。 2010年，Melanie等[33]针对小鼠Rosa26基因设计了一对ZFN，并且将构建的潮霉素基因同源打靶载体、β-半乳糖苷酶及Venus同源打靶载体，分别和ZFN的mRNA共同注射入小鼠原核胚胎，产生转基因小鼠，经鉴定同源打靶效率为1.7%～4.5%[33]。 4结语或展望 研究发现，ZFN技术能够快速有效地在细胞水平或者个体水平上进行基因敲除和基因插入的操作，为尚未获得ES细胞的转基因物种提供了基因操作的可能性。然而ZFN技术也存在一些不足，研究证实ZFN在细胞内表达后具有毒性及副作用[25]，还需要更深入地研究并解决相关问题。ZFN作为新兴的基因打靶的有力工具，存在着巨大的潜力和价值，通过研究人员的不断努力和探索，ZFN技术会越来越完善，并推动动物转基因产业的快速发展。参考文献： [1]Miller J，McLaehlan A D，Klug A.Repetitive zinc binding domains in the protein transcription factor ⅢA from Xenopus oocytes[J].EMBO J.， 1985， 4：1609-1614. 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