班
级：2006《基因工程原理》课程试题与答案 一、名词解释
1、寄主的修饰现象
寄主本身的DNA ，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA 得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。
２、F ’细胞
以染色体外环双链质粒DNA 形式存在，同时还带有细菌色体基因或DNA 片段。这样的细胞叫F ’细胞。 ３、溶原周期
溶源周期是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA 是整合到寄主细胞DNA 上，成为它的一个组成部分。
４、内含肽：
蛋白质剪接是从前体蛋白内切除intein ，并将extein 以肽键连接，产生成熟蛋白质的过程。从前体蛋白中切除的部分称为内含肽。
５、cDNA 文库
cDNA 文库是将某种生物在某一时期所有的mRNA 经反转录后形成的互补DNA( cDNA)连接进某种载体而形成的克隆集合。
６、转化
转化(transformation)是指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA 分子的生命过程。
７、嵌套引物
利用第一轮PCR 扩增产物作为第二轮PCR 扩增的起始材料(DNA)，同时除使用第一轮的一对特异引物之外，另加一至两个同模板DNA 结合位点是处在头两个引物之间的新引物
８、非融合蛋白
不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的外源表达蛋白称为非融合蛋白。
９、酵母的复制型载体
YRp 型载体是酵母的DNA 片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。其中酵母DNA 片段不但提供了选择标记，还携带来自酵母染色体DNA 的自主复制顺序(ARS)。因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制。
10、RAPD ：随机引物扩增多态性，是用随机引物扩增基因组DNA ，从中寻找扩增片段有差异。
11、基因组文库
将某种生物的全部基因组DNA 切割成一定长度的DNA 片段. B.克隆到某种载体上而形成的集合
12、转染
感受态的大肠杆菌细胞 b.捕获和表达噬菌体DNA 分子的生命过程
13、简并引物
是一类由多种寡核苷酸组成的混合物. B. 彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异
14、融合蛋白
与细菌的蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白称为融合蛋白
15、酵母的整合型载体
. 大肠杆菌质粒和酵母的DNA 片段构成. B. 进入细胞后的YIp 质粒被整合到染色体上，并随染色体一起复制。
16、受纳细胞
病毒对细胞的感染，能产生具有感染性的病毒颗粒。B. 并使寄主细胞裂解
二、填空
1、目的基因获得的方法有:用机械或酶切的方法从基因组中获得基因、用逆转录酶以mRNA 为模板cDNA 、用化学合成的方法、从文库中筛选目的基因、用PCR 获得目的基因。
2、PCR 中计算引物Tm 的经验公式:Tm=（G+C)⨯4 + (A+T)⨯2 姓名： 学号： 加白纸 1 张
3、与6个连续His 连接在一起的融合蛋白能用＿Ni+＿层析柱分离。
4、举出一种PCR 产物的克隆载体:T载体
5、确定基因文库大小的公式N ＝ln[(1－P)/(1－f)]
6、为了利用 PCR 技术扩增下列染色体 DNA 片段上的虚线部分，应选用的引物顺序是＿D ＿＿。
Ａ I + II
Ｂ I + III
Ｃ I + IV
Ｄ II + III
Ｅ II + IV
7 、请举出三种基因工程中所用的载体:质粒、噬菌体载体、柯斯质粒、动物病毒载体、植物载体(Ti质粒) 任选三。
8、举出两种哺乳动物基因转移的遗传选择标记有:胸苷激酶(TK)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、新霉素(neo)、氯霉素乙酰转移酶(cat).
9、分离真核mRNA 是利用它的什么结构:Poly(A)
10、请举出三种重组体克隆筛选的方法:遗传检测法、物理检测法、核酸杂交筛选法、免疫化学检测法
11、请举出四种将外源基因导入受体细胞的途径:转化、转染、感染、显微注射、电穿孔五选四
12、在基因工程中使用的原核生物启动子有:Lac 启动子、trp 启动子、P L 或P R 启动子、tac 启动子任选三。
13、细菌的表达载体一般具有:启动子、SD 序列、终止子、增强子 四种基本结构。
14、生物技术包括:基因工程、细胞工程、酶工程、微生物发酵工程、生化工程五个方面，其中基因工程占主导地位。
15、λ噬菌体载体的包装范围在野生噬菌体范围的75% -- 105%之间.
16、基因工程中所使用的酶有：核酸酶、连接酶、聚合酶和修饰酶四种，其中在载体酶切或基因组酶切过程中所使用的酶称为 限制性内切酶
17、酵母中载体有：整合型(Yip)、复制型(YRp)和附加型(YEp)
17、举出一种实验室的物理安全级别：P1、P2、P3和P4选一
18、PCR 中实际复性温度选择低于Tm 值：2－5度
19、pUC 中p 代表：质粒 UC 代表：单位
20、请说出基因组计划中两种图谱的名称：遗传图谱 物理图谱 或EST 图谱 cDNA 图谱等，选二。
21、请举出一种大肠杆菌的表达载体：pKK223 或pET 选一
22、基因工程中所使用的连接酶有：RNA 连接酶和DNA 连接酶。其中在DNA 连接时公司所生产的酶主要有：大肠杆菌连接酶和T4DNA 连接酶
23、与6个连续His 连接在一起的融合蛋白能用＿Ni+＿层析柱分离
24、λ噬菌体的类型：插入型 置换型
三、问答题
(一) 亚磷酸三酯法合成DNA 的步骤？
1、将所要合成的寡聚核苷酸链的3’末端先以3'-OH 与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠(CPG)连接。
2、然后依次从3’→5’的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的。其中5'-OH 用4，4—二对甲氧基三苯甲基(DMT)保护，3’端的二异丙基亚磷酸酰上的磷酸的OH 用甲基
或β—氰乙基保护。
3、脱三苯甲基保护基 加入ZnBr 2或二氯乙酸，脱去4，4—二对甲氧基三苯甲基，释放出与载体相连的寡聚核苷酸单体1上的5'-OH 。
4、缩合反应 在弱酸——四唑的存在下，新加入带保护基的核苷酸单体2与单体1发生缩合反应，形成3’，5’-磷酸二酯键，其中，磷为3价，即形成了亚磷酸三酯中间产物。
5、盖帽反应 加入乙酸酐，使极少数尚未参加缩合反应的核苷酸单体1中的5'-OH 乙酰化，从而达到封闭的作用，终止其以后参加缩合反应的可能性，以减少发生合成错误的机会。
6、氧化反应 形成的3’→5’磷酸二酯键由于磷为3价，即亚磷酸酯，不稳定，能被酸或碱解离。加入I 2将其氧化，使之转化为磷酸三酯，其中磷为5价。
7、如此经过多次循环，直到合成出具有所需序列长度的寡核苷酸后。
8、用苯硫酚脱去甲氧基保护基，再用浓氢氧化铵将DNA 片段与固相断开，使DNA 洗脱下来，最后除去氢氧化铵，在真空中抽干，样品即可溶于适量的水中进行分析。
9、所获得的DNA 片段长短不一，可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳或液相色谱进行纯化，收集相对分子质量最大的部分进行序列分析即可。
（二）如何构建基因组文库？
1、用适当的方法将某一种生物细胞的整个基因组DNA 切割成大小合适的片段.
2、并将这些片段与适当的载体进行体外重组；
3、再引入到相应的宿主细胞中繁殖和扩增，从而形成含有重组DNA 分子的群体。
4、从理论上讲，这些重组子应包含有整个基因组DNA 序列，即包含了某种生物细胞的全部基因.
（三）限制性长度片段多态性(RFLP)的原理？
1、限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphism) ， 简称RFLP 标记) 。生物的基因组DNA 经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的DNA.
2、通过琼脂糖凝胶电泳分离这些片段。
3、凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变(新产生和去除酶切位点) 和一段DNA 的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化) 等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP ．
(四) 杂交选择的转译的原理
1、将克隆的DNA 结合到硝酸纤维素滤膜上.
2、再与未经分离纯化的mRNA 或细胞的总RNA 杂交。
3、漂洗滤膜, 把杂交的mRNA 洗脱下来(即将mRNA 释放出来) 。
4、最后，再用回收的mRNA 用无细胞翻译体系进行体外转译试验。
（五）高温DNA 聚合酶的种类及各自的特点，并各举出一例？
1、第一类酶具有5’-3’方向的DNA 合成（聚合）性能，没有3’-5’方向的外切酶特性。如Taq DNA聚合酶及其突变体。这类酶合成延伸能力比其它DNA 聚合酶强，因为它不能纠正合成过程中出现的突变。
2、第二类和第一类酶类似，它有合成特性，没有3’-5’方向的外切酶活性，即不具备保真性能。不同的是它们能以RNA 为模板，合成DNA 。也就是说它们具有逆转录功能。如Tth DNA聚合酶。
3、第三类酶具有第一类酶的DNA 聚合特性，不拥有第二类酶的逆转录功能，但是它们具有3’-5’方向的外切酶活性。如Pfu DNA 聚合酶。正是酶本身具有的外切酶活性，Pfu 能够纠正DNA 扩增过程出现的错误，如点突变。不足之处是该类酶的DNA 延伸能力不及其它两类。
（六）画出pUC18质粒载体的物理图谱和并说明它筛选重组子的原理
1、质粒上有来自E ．coli 的Lac 操纵子的DNA 区段，编码β—半乳糖苷酶氨基端的一个片段，它没有β—半乳糖苷酶的活性。编码该产物的基因称为LacZ ’基因。
2、宿主细胞编码缺陷型β—半乳糖苷酶，它没有β—半乳糖苷酶的活性。
3、只有LacZ ’基因的产物与宿主细胞编码缺陷型β—半乳糖苷酶产物都存在时，可实现基因内互补(α互补) ，从而使细胞具有β—半乳糖苷酶的活性。
4、异丙基—β—D —硫代半乳糖苷(1PTG)可诱导质粒上LacZ ’基因产物的合成。
5、当培养基中含有IPTG 时，可产生LacZ ’基因的产物，同时合成二个功能上互补的片段，使细胞具有β—半乳糖苷酶的活性.
6、β—半乳糖苷酶能使受体菌在含有生色底物5－溴－4—氯—3—吲哚—β－D —半乳糖苷(X-gal)的培养基上形成蓝色菌落。
7、当外源DNA 片段插入到质粒上LacZ ’的多克隆位点时，可使β—半乳糖苷酶的氨基端片段失活，破坏α互补作用。这样，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。可从菌落颜色的变化来选择重组体。
（七）图示Ti 质粒的组成
（每两个结构1分）
（八）请从SV40病毒的特征、COS 是如何获得的，以及如何将流感病毒血细胞凝集素(Ha)基因克隆到病毒载体中等方面说明如何利用COS 细胞及病毒的早期区域克隆外源基因？
组成
1、SV40病毒是一种小型的20面体的蛋白质颗粒，由三种病毒外壳蛋白质VPl 、VP2和VP3构成，中间包装着一条环形的病毒基因组DNA 。
2、SV40病毒基因组表达的时间顺序是相当严格的。据此可将其区分为早期表达区和晚期表达区。
3、早期初级转录本加工成2种不同的早期mRNA(多瘤病毒的早期初级转录本加工成3种不同的早期mRNA) ；这2种早期mRNA 分别编码大T 抗原和小t 抗原(即肿瘤蛋白质或抗原) 。
4、而晚期的初级转录本加工成3种不同的晚期mRNA 。它们分别编码VPl 、VP3和VP2病毒蛋白质。 COS 细胞的获得
1、用复制起点有缺陷的SV40侵染猴细胞，这种病毒DNA 不能自我复制，因此在细胞中存留的唯一途径是整合到猴细胞的染色体上。
2、SV40与染色体整合后，能继续产生大T 抗原，这种具有大T 抗原的猴细胞称COS 细胞。
外源基因导入到病毒载体中
1、当正常SV40的早期区域用酶切下后，回收病毒载体。
2、将被流感病毒血细胞凝集素(Ha)基因连接到酶切的病毒载体上。
3、将重组DNA 转染COS 细胞，虽然这种含有Ha 基因的重组DNA 本身已不能产生大T 抗原，但COS 细胞中的大T 抗原可以识别进入细胞的SV40复制起点，促使重组分子不断复制。重组分子上晚期基因编的蛋白质可以包装重组分子，使细胞裂解。新形成的病毒颗粒全部包含重组DNA 。
（九）基因工程中所使用的酶的类型，它们的作用是什么？并详细说明DNA 核酸酶的种类及作用特点？ 基因工程中所使用的酶的类型，它们的作用是什么？
1、核酸酶：用于切割或核酸分子，如DNA 酶和Rnase 。
2、连接酶：用于反核酸分子连接到一起。
3、聚合酶：用于核酸分子的扩增或拷贝。
4、修饰酶：用于给核酸分子添加或减去某些化学基团可核苷酸。
DNA 核酸酶的种类及作用特点？
1、DNA 链的核酸酶分为两大类：一类称为核酸外切酶，核酸外切酶就是从DNA 两端开始向内切割。
2、一类称为核酸内切酶，核酸内切酶就是从DNA 链的内部进行切割的酶。
3、核酸内切酶分为两类： 一类称为限制性内切酶，限制性内切酶是具有在特定的位点识别特定的DNA 序列。
4、类型Ⅰ限制性内切酶识别的DNA 序列长约十几个苷酸或甲基化，可在离识别序列一端约1000bp 的位置切割DNA 。类型Ⅲ它也可以识别特定的DNA 序列，它的切割DNA 位点往往在识别结合位点很相邻的位置上。
5、类型Ⅱ不但能识别特定的DNA 序列，而且识别的位置与切割的位置一致，它避免了酶切末端的不确定性和不可重复性，使DNA 分子重组成为可能。目前人们使用的限制性内切酶这一概念主要是指类型Ⅱ限制性内切酶。
6、另一类称为限制性内切酶。非限制性内切酶是指那些不识别特定DNA 序列进行切割的内切酶。
（十）、α互补的原理
1、质粒上有来自E ．coli 的Lac 操纵子的DNA 区段，编码β—半乳糖苷酶氨基端的一个片段，它没有β—半乳糖苷酶的活性。编码该产物的基因称为LacZ ’基因。
2、宿主细胞编码缺陷型β—半乳糖苷酶，它没有β—半乳糖苷酶的活性。
3、只有LacZ ’基因的产物与宿主细胞编码缺陷型β—半乳糖苷酶产物都存在时，可实现基因内互补(α互补) ，从而使细胞具有β—半乳糖苷酶的活性。
4、异丙基—β—D —硫代半乳糖苷(1PTG)可诱导质粒上LacZ ’基因产物的合成。
5、当培养基中含有IPTG 时，可产生LacZ ’基因的产物，同时合成二个功能上互补的片段，使细胞具有β—半乳糖苷酶的活性.
6、β—半乳糖苷酶能使受体菌在含有生色底物5－溴－4—氯—3—吲哚—β－D —半乳糖苷(X-gal)的培养基上形成蓝色菌落。
7、当外源DNA 片段插入到质粒上LacZ ’的多克隆位点时，可使β—半乳糖苷酶的氨基端片段失活，破坏α互补作用。这样，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。可从菌落颜色的变化来选择重组体。 (十二) 、如何构建cDNA 文库？
1、总RNA 的提取
2、mRNA 的分离 高等生物细胞的绝大部分mRNA 在其3’端均有一个Po1y(A)尾，尾的长度一般足以吸附于寡聚脱氧胸苷酸(oligo(dT))—纤维素上，因此，可以用亲和层析法从总RNA 样品中分离mRNA 。
3、合成—段寡聚脱氧胸腺核苷酸(Oligo(dT)，让它通过碱基配对与Poly(A)结合从而形成逆转录酶所必需的引物结构.
4、逆转录酶即可作用合成与mRNA 互补的DNA(cDNA)。这时的cDNA 是一条链。
5、利用RNase H在mRNA 上制造一些缺刻，这样小片段的RNA 链即可作为引物在DNA 聚合酶的作用下，引导第二链cDNA 的合成而取代RNA 链.
6、用不同的人工接头连接在双链cDNA 两端的平头末端上，用两种限制性内切酶水解，两端暴露出不同的粘性末端，插入到载体DNA 适当位点内。
7、重组的质粒载体DNA 分子在一定条件下转化大肠杆菌，形成菌落群即为cDNA 文库。重组的噬菌体载体包装形成病毒颗粒后，感染大肠杆菌，所获得的噬菌体集合即为cDNA 文库。
(十三) 、图示并解释原位杂交的过程？
1、将被筛选的大肠杆菌菌落，从其生长的琼脂乎板中小心地转移到铺放在琼脂平板表面的硝酸纤维素滤膜上，同时保藏原来的菌落平板作为参照，以便从中挑取阳性克隆。
2、取出已经长有菌落的硝酸纤维素滤膜，使用碱处理，于是细菌菌落便被溶解，它们的DNA 也就随之变性。然后再用适当的方法处理滤膜，以除去蛋白质，留下的便是同硝酸纤维素滤膜结合的变性DNA 。
3、在80℃下烘烤滤膜，使DNA 牢固地固定下来。带有DNA 印迹的滤膜可以长期保存。
4、用放射性同位素标记的RNA 或DNA 作为探针，同滤膜上的菌落所释放的变性DNA 杂交.
5、并用放射自显影技术进行检测。凡是含有与探针互补序列的菌落DNA ，就会在X 光胶片上出现曝光点(图7—8) 。根据曝光点的位置，便可以从保留的母板上相应位置挑出所需要的阳性菌落。
(十四) 、PCR 的类型及用途？
1、巢式PCR 利用两套PCR 引物对进行两轮PCR 扩增反应组成，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。
2、多重PCR 是指在一个单一反应中同时扩增多个序列的反应过程，能够节省时间和精力。
3、定量PCR 技术 是指以外参或内参为标准, 通过对PCR 终产物的分析或PCR 过程的监测, 进行PCR 起始模板量的定量。
4、锚定PCR ：使用一条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端序列的目的DNA 。
5、反向PCR 扩增两个引物外侧的未知序列
6、不对称PCR 用于扩增单链DNA
7、反转录PCR （RT-PCR) 扩增RNA 模板。
(十五) 、差异杂交法的原理
1、制备表达目的基因和不表达目的基因材料的mRNA 。
2、用逆转录酶制备表达目的基因和不表达目的基因材料的mRNA 的cDNA.
3、将表达目的基因的cDNA 构建cDNA 文库。
4、将表达目的基因和不表达目的基因材料的cDNA 分别标记成探针。
5、分别用cDNA 文库影印两张滤膜杂交
6、放射自显影后找出杂交差异信号，在文库中找出相对应的克隆。
(十六) 、胚胎干细胞是如何培养的？
1、小鼠交配后第三天分离胚泡，在培养皿上培养，这时细胞铺展在培养皿的表面，当形成内胚层细胞团时，将其移出。
2、用胰蛋白酶将细胞团分离成单个细胞。
3、将ES 细胞培养在成纤维细胞的滋养层上，细胞将继续增殖，且能重复培养(滋养层是一种单层细胞，这种细胞经过处理，不能继续分裂，但能持续代谢，可创造像培养基一样的条件，使其他细胞能在其表面存活和生长) 。
4、ES 细胞可通过微注射进入囊胚中，然后同化进内胚层细胞团中，参与嵌合鼠许多组织的形成。 （十七）、什么是物理图谱，举例说明如何构建物理图谱？
1、物理图谱就是确定DNA 分子上不同限制性内切酶之间的相对位置。
2、以λDNA 为例，我们都知道λ有48.5Kb 长，Kpn1、Xba1和Xho1三个酶单酶解，Kpn1得到1.5Kb 、17.0Kb 和30.0Kb 三个片段，说明有两个Kpn1位点；Xba1得到24.0Kb 和24.5Kb 两个片段，Xho1得到15.0和33.5Kb 两个片段，说明Xba1和 Xho1位点各有一个。
3、紧接用Xba1和Xho1进行双酶解，得到9.0Kb 、15.0Kb 和24.5Kb 三个片段，通过分析得出这两个位点的相对位置只可能是一个 。
Xho1 Xba1
4、紧接着用Xba1和Kpn1进行双酶切产生1.5Kb ，6.0Kb 和17.0Kb 和24.0Kb 四个片段，可以判断这两个Kpn1位点是位于Xba1的24.5片段上；
5、至于两个位点的确切位置可以通过部分酶解来断定；用Kpn1部分酶解后产生1.5、17.0、18.5、30.0、31.5和48.5Kb 6 个片段，从这个部分酶解的结果可以分析出Kpn1两个位点应如下排列：
因此整个λDNA 上这三个酶切位点应是：
30.0 1.5 17.0
15.0 9.0 6.0 1.5 17.0
Xho1 Xba1 Kpn1 Kpn1
(十八) 、已知植物抗虫基因BT 已克隆到pUC18载体中，画出双元载体系统pBI121质粒TDNA 区的物理图谱，并将BT 基因转移到植物中，获得并证实为转基因植物。从双元载体系统的原理及叶盘法生产转BT 基因植物说明进行这个工作需要哪些步骤？
左边界－NOS 启动子－选择标记基因－NOS 终止子－35S 启动子－外源基因插入区－终止和加尾信号－右边界
1、将pUC18质粒上的BT 基因酶切下后，连接到微型质粒中。
2、将微型质粒通过冻融法转移到含有辅助质粒的农杆菌中。
3、实验材料的叶子表面进行消毒，再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片，即叶盘。
4、将叶盘放在上述土壤农杆菌培养液中浸泡4—5min ，然后用滤纸吸干。
5、将叶盘放在诱导培养基上进行培养。
6、转移到含有适当抗生素的选择培养基上进行培养.
7、在分化培养基分化出幼苗。
8、对这些幼苗的进一步进行分子检测(如PCR ，Southern 印迹法等) ，可以确定它们是否为转基因植物。 （十九）哺乳动物基因转移的遗传选择标记有哪些？
1、胸苷激酶(TK) 2、二氢叶酸还原酶(dhfr) 3、新霉素(neo) 4、氯霉素乙酰转移酶(cat).
班
级：2006《基因工程原理》课程试题与答案 一、名词解释
1、寄主的修饰现象
寄主本身的DNA ，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA 得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。
２、F ’细胞
以染色体外环双链质粒DNA 形式存在，同时还带有细菌色体基因或DNA 片段。这样的细胞叫F ’细胞。 ３、溶原周期
溶源周期是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA 是整合到寄主细胞DNA 上，成为它的一个组成部分。
４、内含肽：
蛋白质剪接是从前体蛋白内切除intein ，并将extein 以肽键连接，产生成熟蛋白质的过程。从前体蛋白中切除的部分称为内含肽。
５、cDNA 文库
cDNA 文库是将某种生物在某一时期所有的mRNA 经反转录后形成的互补DNA( cDNA)连接进某种载体而形成的克隆集合。
６、转化
转化(transformation)是指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA 分子的生命过程。
７、嵌套引物
利用第一轮PCR 扩增产物作为第二轮PCR 扩增的起始材料(DNA)，同时除使用第一轮的一对特异引物之外，另加一至两个同模板DNA 结合位点是处在头两个引物之间的新引物
８、非融合蛋白
不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起的外源表达蛋白称为非融合蛋白。
９、酵母的复制型载体
YRp 型载体是酵母的DNA 片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。其中酵母DNA 片段不但提供了选择标记，还携带来自酵母染色体DNA 的自主复制顺序(ARS)。因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制。
10、RAPD ：随机引物扩增多态性，是用随机引物扩增基因组DNA ，从中寻找扩增片段有差异。
11、基因组文库
将某种生物的全部基因组DNA 切割成一定长度的DNA 片段. B.克隆到某种载体上而形成的集合
12、转染
感受态的大肠杆菌细胞 b.捕获和表达噬菌体DNA 分子的生命过程
13、简并引物
是一类由多种寡核苷酸组成的混合物. B. 彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异
14、融合蛋白
与细菌的蛋白或多肽融合在一起的表达蛋白称为融合蛋白
15、酵母的整合型载体
. 大肠杆菌质粒和酵母的DNA 片段构成. B. 进入细胞后的YIp 质粒被整合到染色体上，并随染色体一起复制。
16、受纳细胞
病毒对细胞的感染，能产生具有感染性的病毒颗粒。B. 并使寄主细胞裂解
二、填空
1、目的基因获得的方法有:用机械或酶切的方法从基因组中获得基因、用逆转录酶以mRNA 为模板cDNA 、用化学合成的方法、从文库中筛选目的基因、用PCR 获得目的基因。
2、PCR 中计算引物Tm 的经验公式:Tm=（G+C)⨯4 + (A+T)⨯2 姓名： 学号： 加白纸 1 张
3、与6个连续His 连接在一起的融合蛋白能用＿Ni+＿层析柱分离。
4、举出一种PCR 产物的克隆载体:T载体
5、确定基因文库大小的公式N ＝ln[(1－P)/(1－f)]
6、为了利用 PCR 技术扩增下列染色体 DNA 片段上的虚线部分，应选用的引物顺序是＿D ＿＿。
Ａ I + II
Ｂ I + III
Ｃ I + IV
Ｄ II + III
Ｅ II + IV
7 、请举出三种基因工程中所用的载体:质粒、噬菌体载体、柯斯质粒、动物病毒载体、植物载体(Ti质粒) 任选三。
8、举出两种哺乳动物基因转移的遗传选择标记有:胸苷激酶(TK)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、新霉素(neo)、氯霉素乙酰转移酶(cat).
9、分离真核mRNA 是利用它的什么结构:Poly(A)
10、请举出三种重组体克隆筛选的方法:遗传检测法、物理检测法、核酸杂交筛选法、免疫化学检测法
11、请举出四种将外源基因导入受体细胞的途径:转化、转染、感染、显微注射、电穿孔五选四
12、在基因工程中使用的原核生物启动子有:Lac 启动子、trp 启动子、P L 或P R 启动子、tac 启动子任选三。
13、细菌的表达载体一般具有:启动子、SD 序列、终止子、增强子 四种基本结构。
14、生物技术包括:基因工程、细胞工程、酶工程、微生物发酵工程、生化工程五个方面，其中基因工程占主导地位。
15、λ噬菌体载体的包装范围在野生噬菌体范围的75% -- 105%之间.
16、基因工程中所使用的酶有：核酸酶、连接酶、聚合酶和修饰酶四种，其中在载体酶切或基因组酶切过程中所使用的酶称为 限制性内切酶
17、酵母中载体有：整合型(Yip)、复制型(YRp)和附加型(YEp)
17、举出一种实验室的物理安全级别：P1、P2、P3和P4选一
18、PCR 中实际复性温度选择低于Tm 值：2－5度
19、pUC 中p 代表：质粒 UC 代表：单位
20、请说出基因组计划中两种图谱的名称：遗传图谱 物理图谱 或EST 图谱 cDNA 图谱等，选二。
21、请举出一种大肠杆菌的表达载体：pKK223 或pET 选一
22、基因工程中所使用的连接酶有：RNA 连接酶和DNA 连接酶。其中在DNA 连接时公司所生产的酶主要有：大肠杆菌连接酶和T4DNA 连接酶
23、与6个连续His 连接在一起的融合蛋白能用＿Ni+＿层析柱分离
24、λ噬菌体的类型：插入型 置换型
三、问答题
(一) 亚磷酸三酯法合成DNA 的步骤？
1、将所要合成的寡聚核苷酸链的3’末端先以3'-OH 与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠(CPG)连接。
2、然后依次从3’→5’的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的。其中5'-OH 用4，4—二对甲氧基三苯甲基(DMT)保护，3’端的二异丙基亚磷酸酰上的磷酸的OH 用甲基
或β—氰乙基保护。
3、脱三苯甲基保护基 加入ZnBr 2或二氯乙酸，脱去4，4—二对甲氧基三苯甲基，释放出与载体相连的寡聚核苷酸单体1上的5'-OH 。
4、缩合反应 在弱酸——四唑的存在下，新加入带保护基的核苷酸单体2与单体1发生缩合反应，形成3’，5’-磷酸二酯键，其中，磷为3价，即形成了亚磷酸三酯中间产物。
5、盖帽反应 加入乙酸酐，使极少数尚未参加缩合反应的核苷酸单体1中的5'-OH 乙酰化，从而达到封闭的作用，终止其以后参加缩合反应的可能性，以减少发生合成错误的机会。
6、氧化反应 形成的3’→5’磷酸二酯键由于磷为3价，即亚磷酸酯，不稳定，能被酸或碱解离。加入I 2将其氧化，使之转化为磷酸三酯，其中磷为5价。
7、如此经过多次循环，直到合成出具有所需序列长度的寡核苷酸后。
8、用苯硫酚脱去甲氧基保护基，再用浓氢氧化铵将DNA 片段与固相断开，使DNA 洗脱下来，最后除去氢氧化铵，在真空中抽干，样品即可溶于适量的水中进行分析。
9、所获得的DNA 片段长短不一，可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳或液相色谱进行纯化，收集相对分子质量最大的部分进行序列分析即可。
（二）如何构建基因组文库？
1、用适当的方法将某一种生物细胞的整个基因组DNA 切割成大小合适的片段.
2、并将这些片段与适当的载体进行体外重组；
3、再引入到相应的宿主细胞中繁殖和扩增，从而形成含有重组DNA 分子的群体。
4、从理论上讲，这些重组子应包含有整个基因组DNA 序列，即包含了某种生物细胞的全部基因.
（三）限制性长度片段多态性(RFLP)的原理？
1、限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphism) ， 简称RFLP 标记) 。生物的基因组DNA 经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的DNA.
2、通过琼脂糖凝胶电泳分离这些片段。
3、凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变(新产生和去除酶切位点) 和一段DNA 的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化) 等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP ．
(四) 杂交选择的转译的原理
1、将克隆的DNA 结合到硝酸纤维素滤膜上.
2、再与未经分离纯化的mRNA 或细胞的总RNA 杂交。
3、漂洗滤膜, 把杂交的mRNA 洗脱下来(即将mRNA 释放出来) 。
4、最后，再用回收的mRNA 用无细胞翻译体系进行体外转译试验。
（五）高温DNA 聚合酶的种类及各自的特点，并各举出一例？
1、第一类酶具有5’-3’方向的DNA 合成（聚合）性能，没有3’-5’方向的外切酶特性。如Taq DNA聚合酶及其突变体。这类酶合成延伸能力比其它DNA 聚合酶强，因为它不能纠正合成过程中出现的突变。
2、第二类和第一类酶类似，它有合成特性，没有3’-5’方向的外切酶活性，即不具备保真性能。不同的是它们能以RNA 为模板，合成DNA 。也就是说它们具有逆转录功能。如Tth DNA聚合酶。
3、第三类酶具有第一类酶的DNA 聚合特性，不拥有第二类酶的逆转录功能，但是它们具有3’-5’方向的外切酶活性。如Pfu DNA 聚合酶。正是酶本身具有的外切酶活性，Pfu 能够纠正DNA 扩增过程出现的错误，如点突变。不足之处是该类酶的DNA 延伸能力不及其它两类。
（六）画出pUC18质粒载体的物理图谱和并说明它筛选重组子的原理
1、质粒上有来自E ．coli 的Lac 操纵子的DNA 区段，编码β—半乳糖苷酶氨基端的一个片段，它没有β—半乳糖苷酶的活性。编码该产物的基因称为LacZ ’基因。
2、宿主细胞编码缺陷型β—半乳糖苷酶，它没有β—半乳糖苷酶的活性。
3、只有LacZ ’基因的产物与宿主细胞编码缺陷型β—半乳糖苷酶产物都存在时，可实现基因内互补(α互补) ，从而使细胞具有β—半乳糖苷酶的活性。
4、异丙基—β—D —硫代半乳糖苷(1PTG)可诱导质粒上LacZ ’基因产物的合成。
5、当培养基中含有IPTG 时，可产生LacZ ’基因的产物，同时合成二个功能上互补的片段，使细胞具有β—半乳糖苷酶的活性.
6、β—半乳糖苷酶能使受体菌在含有生色底物5－溴－4—氯—3—吲哚—β－D —半乳糖苷(X-gal)的培养基上形成蓝色菌落。
7、当外源DNA 片段插入到质粒上LacZ ’的多克隆位点时，可使β—半乳糖苷酶的氨基端片段失活，破坏α互补作用。这样，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。可从菌落颜色的变化来选择重组体。
（七）图示Ti 质粒的组成
（每两个结构1分）
（八）请从SV40病毒的特征、COS 是如何获得的，以及如何将流感病毒血细胞凝集素(Ha)基因克隆到病毒载体中等方面说明如何利用COS 细胞及病毒的早期区域克隆外源基因？
组成
1、SV40病毒是一种小型的20面体的蛋白质颗粒，由三种病毒外壳蛋白质VPl 、VP2和VP3构成，中间包装着一条环形的病毒基因组DNA 。
2、SV40病毒基因组表达的时间顺序是相当严格的。据此可将其区分为早期表达区和晚期表达区。
3、早期初级转录本加工成2种不同的早期mRNA(多瘤病毒的早期初级转录本加工成3种不同的早期mRNA) ；这2种早期mRNA 分别编码大T 抗原和小t 抗原(即肿瘤蛋白质或抗原) 。
4、而晚期的初级转录本加工成3种不同的晚期mRNA 。它们分别编码VPl 、VP3和VP2病毒蛋白质。 COS 细胞的获得
1、用复制起点有缺陷的SV40侵染猴细胞，这种病毒DNA 不能自我复制，因此在细胞中存留的唯一途径是整合到猴细胞的染色体上。
2、SV40与染色体整合后，能继续产生大T 抗原，这种具有大T 抗原的猴细胞称COS 细胞。
外源基因导入到病毒载体中
1、当正常SV40的早期区域用酶切下后，回收病毒载体。
2、将被流感病毒血细胞凝集素(Ha)基因连接到酶切的病毒载体上。
3、将重组DNA 转染COS 细胞，虽然这种含有Ha 基因的重组DNA 本身已不能产生大T 抗原，但COS 细胞中的大T 抗原可以识别进入细胞的SV40复制起点，促使重组分子不断复制。重组分子上晚期基因编的蛋白质可以包装重组分子，使细胞裂解。新形成的病毒颗粒全部包含重组DNA 。
（九）基因工程中所使用的酶的类型，它们的作用是什么？并详细说明DNA 核酸酶的种类及作用特点？ 基因工程中所使用的酶的类型，它们的作用是什么？
1、核酸酶：用于切割或核酸分子，如DNA 酶和Rnase 。
2、连接酶：用于反核酸分子连接到一起。
3、聚合酶：用于核酸分子的扩增或拷贝。
4、修饰酶：用于给核酸分子添加或减去某些化学基团可核苷酸。
DNA 核酸酶的种类及作用特点？
1、DNA 链的核酸酶分为两大类：一类称为核酸外切酶，核酸外切酶就是从DNA 两端开始向内切割。
2、一类称为核酸内切酶，核酸内切酶就是从DNA 链的内部进行切割的酶。
3、核酸内切酶分为两类： 一类称为限制性内切酶，限制性内切酶是具有在特定的位点识别特定的DNA 序列。
4、类型Ⅰ限制性内切酶识别的DNA 序列长约十几个苷酸或甲基化，可在离识别序列一端约1000bp 的位置切割DNA 。类型Ⅲ它也可以识别特定的DNA 序列，它的切割DNA 位点往往在识别结合位点很相邻的位置上。
5、类型Ⅱ不但能识别特定的DNA 序列，而且识别的位置与切割的位置一致，它避免了酶切末端的不确定性和不可重复性，使DNA 分子重组成为可能。目前人们使用的限制性内切酶这一概念主要是指类型Ⅱ限制性内切酶。
6、另一类称为限制性内切酶。非限制性内切酶是指那些不识别特定DNA 序列进行切割的内切酶。
（十）、α互补的原理
1、质粒上有来自E ．coli 的Lac 操纵子的DNA 区段，编码β—半乳糖苷酶氨基端的一个片段，它没有β—半乳糖苷酶的活性。编码该产物的基因称为LacZ ’基因。
2、宿主细胞编码缺陷型β—半乳糖苷酶，它没有β—半乳糖苷酶的活性。
3、只有LacZ ’基因的产物与宿主细胞编码缺陷型β—半乳糖苷酶产物都存在时，可实现基因内互补(α互补) ，从而使细胞具有β—半乳糖苷酶的活性。
4、异丙基—β—D —硫代半乳糖苷(1PTG)可诱导质粒上LacZ ’基因产物的合成。
5、当培养基中含有IPTG 时，可产生LacZ ’基因的产物，同时合成二个功能上互补的片段，使细胞具有β—半乳糖苷酶的活性.
6、β—半乳糖苷酶能使受体菌在含有生色底物5－溴－4—氯—3—吲哚—β－D —半乳糖苷(X-gal)的培养基上形成蓝色菌落。
7、当外源DNA 片段插入到质粒上LacZ ’的多克隆位点时，可使β—半乳糖苷酶的氨基端片段失活，破坏α互补作用。这样，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。可从菌落颜色的变化来选择重组体。 (十二) 、如何构建cDNA 文库？
1、总RNA 的提取
2、mRNA 的分离 高等生物细胞的绝大部分mRNA 在其3’端均有一个Po1y(A)尾，尾的长度一般足以吸附于寡聚脱氧胸苷酸(oligo(dT))—纤维素上，因此，可以用亲和层析法从总RNA 样品中分离mRNA 。
3、合成—段寡聚脱氧胸腺核苷酸(Oligo(dT)，让它通过碱基配对与Poly(A)结合从而形成逆转录酶所必需的引物结构.
4、逆转录酶即可作用合成与mRNA 互补的DNA(cDNA)。这时的cDNA 是一条链。
5、利用RNase H在mRNA 上制造一些缺刻，这样小片段的RNA 链即可作为引物在DNA 聚合酶的作用下，引导第二链cDNA 的合成而取代RNA 链.
6、用不同的人工接头连接在双链cDNA 两端的平头末端上，用两种限制性内切酶水解，两端暴露出不同的粘性末端，插入到载体DNA 适当位点内。
7、重组的质粒载体DNA 分子在一定条件下转化大肠杆菌，形成菌落群即为cDNA 文库。重组的噬菌体载体包装形成病毒颗粒后，感染大肠杆菌，所获得的噬菌体集合即为cDNA 文库。
(十三) 、图示并解释原位杂交的过程？
1、将被筛选的大肠杆菌菌落，从其生长的琼脂乎板中小心地转移到铺放在琼脂平板表面的硝酸纤维素滤膜上，同时保藏原来的菌落平板作为参照，以便从中挑取阳性克隆。
2、取出已经长有菌落的硝酸纤维素滤膜，使用碱处理，于是细菌菌落便被溶解，它们的DNA 也就随之变性。然后再用适当的方法处理滤膜，以除去蛋白质，留下的便是同硝酸纤维素滤膜结合的变性DNA 。
3、在80℃下烘烤滤膜，使DNA 牢固地固定下来。带有DNA 印迹的滤膜可以长期保存。
4、用放射性同位素标记的RNA 或DNA 作为探针，同滤膜上的菌落所释放的变性DNA 杂交.
5、并用放射自显影技术进行检测。凡是含有与探针互补序列的菌落DNA ，就会在X 光胶片上出现曝光点(图7—8) 。根据曝光点的位置，便可以从保留的母板上相应位置挑出所需要的阳性菌落。
(十四) 、PCR 的类型及用途？
1、巢式PCR 利用两套PCR 引物对进行两轮PCR 扩增反应组成，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。
2、多重PCR 是指在一个单一反应中同时扩增多个序列的反应过程，能够节省时间和精力。
3、定量PCR 技术 是指以外参或内参为标准, 通过对PCR 终产物的分析或PCR 过程的监测, 进行PCR 起始模板量的定量。
4、锚定PCR ：使用一条锚定引物就一条特异性引物扩增已知一端序列的目的DNA 。
5、反向PCR 扩增两个引物外侧的未知序列
6、不对称PCR 用于扩增单链DNA
7、反转录PCR （RT-PCR) 扩增RNA 模板。
(十五) 、差异杂交法的原理
1、制备表达目的基因和不表达目的基因材料的mRNA 。
2、用逆转录酶制备表达目的基因和不表达目的基因材料的mRNA 的cDNA.
3、将表达目的基因的cDNA 构建cDNA 文库。
4、将表达目的基因和不表达目的基因材料的cDNA 分别标记成探针。
5、分别用cDNA 文库影印两张滤膜杂交
6、放射自显影后找出杂交差异信号，在文库中找出相对应的克隆。
(十六) 、胚胎干细胞是如何培养的？
1、小鼠交配后第三天分离胚泡，在培养皿上培养，这时细胞铺展在培养皿的表面，当形成内胚层细胞团时，将其移出。
2、用胰蛋白酶将细胞团分离成单个细胞。
3、将ES 细胞培养在成纤维细胞的滋养层上，细胞将继续增殖，且能重复培养(滋养层是一种单层细胞，这种细胞经过处理，不能继续分裂，但能持续代谢，可创造像培养基一样的条件，使其他细胞能在其表面存活和生长) 。
4、ES 细胞可通过微注射进入囊胚中，然后同化进内胚层细胞团中，参与嵌合鼠许多组织的形成。 （十七）、什么是物理图谱，举例说明如何构建物理图谱？
1、物理图谱就是确定DNA 分子上不同限制性内切酶之间的相对位置。
2、以λDNA 为例，我们都知道λ有48.5Kb 长，Kpn1、Xba1和Xho1三个酶单酶解，Kpn1得到1.5Kb 、17.0Kb 和30.0Kb 三个片段，说明有两个Kpn1位点；Xba1得到24.0Kb 和24.5Kb 两个片段，Xho1得到15.0和33.5Kb 两个片段，说明Xba1和 Xho1位点各有一个。
3、紧接用Xba1和Xho1进行双酶解，得到9.0Kb 、15.0Kb 和24.5Kb 三个片段，通过分析得出这两个位点的相对位置只可能是一个 。
Xho1 Xba1
4、紧接着用Xba1和Kpn1进行双酶切产生1.5Kb ，6.0Kb 和17.0Kb 和24.0Kb 四个片段，可以判断这两个Kpn1位点是位于Xba1的24.5片段上；
5、至于两个位点的确切位置可以通过部分酶解来断定；用Kpn1部分酶解后产生1.5、17.0、18.5、30.0、31.5和48.5Kb 6 个片段，从这个部分酶解的结果可以分析出Kpn1两个位点应如下排列：
因此整个λDNA 上这三个酶切位点应是：
30.0 1.5 17.0
15.0 9.0 6.0 1.5 17.0
Xho1 Xba1 Kpn1 Kpn1
(十八) 、已知植物抗虫基因BT 已克隆到pUC18载体中，画出双元载体系统pBI121质粒TDNA 区的物理图谱，并将BT 基因转移到植物中，获得并证实为转基因植物。从双元载体系统的原理及叶盘法生产转BT 基因植物说明进行这个工作需要哪些步骤？
左边界－NOS 启动子－选择标记基因－NOS 终止子－35S 启动子－外源基因插入区－终止和加尾信号－右边界
1、将pUC18质粒上的BT 基因酶切下后，连接到微型质粒中。
2、将微型质粒通过冻融法转移到含有辅助质粒的农杆菌中。
3、实验材料的叶子表面进行消毒，再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片，即叶盘。
4、将叶盘放在上述土壤农杆菌培养液中浸泡4—5min ，然后用滤纸吸干。
5、将叶盘放在诱导培养基上进行培养。
6、转移到含有适当抗生素的选择培养基上进行培养.
7、在分化培养基分化出幼苗。
8、对这些幼苗的进一步进行分子检测(如PCR ，Southern 印迹法等) ，可以确定它们是否为转基因植物。 （十九）哺乳动物基因转移的遗传选择标记有哪些？
1、胸苷激酶(TK) 2、二氢叶酸还原酶(dhfr) 3、新霉素(neo) 4、氯霉素乙酰转移酶(cat).