L-精氨酸对兔缺血再灌注损伤肝脏能量代谢的影响
作者：陈亮1，颜王鑫1，唐兰兰2，郝卯林2，谢克俭3，王万铁2 作者单位：(1.温州市第三人民医院 外科，浙江 温州 325000;温州医学院，浙江 温州 325035，2.病理生理学教研室; 3.检验医学院分析中心)
【摘要】 目的 探讨L-精氨酸(L-Arg)对肝缺血再灌注损伤(HIRI)时肝细胞能量代谢的影响及其机制。方法 实验兔30只，随机分为对照组(C组)，模型组(HIRI组)和L-Arg干预组(L-Arg组)。在再灌注45 min时，分别检测肝组织内三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)含量，总腺苷酸量(TAN)，能荷(EC)，丙二醛浓度(MDA)，超氧化物歧化酶活性(SOD)，一氧化氮代谢产物(NO2-/NO3-)水平，血栓素B2(TXB2)和6-酮基-前列腺素F1Α
(6-keto-PGF1Α)含量以及TXB2/6-keto-PGF1Α(T/K)值。结果 L-Arg组与HIRI组比较，肝组织内ATP、NO2-/NO3-、6-keto-PGF1Α含量，EC和SOD活性均明显增高(P
【关键词】 再灌注损伤;肝脏;能量代谢;L-精氨酸
Abstract Objective To explore the positive effects of
L-arginine(L-Arg) on hepatocellular energy metabolism against the
reperfusion injury after hepatic ischemia in rabbits. Methods Thirty rabbits were randomly divided into three groups： control group(C
group)， model group (HIRI group) and L-Arg intervention group (L-Arg group)， the contents of adenosine triphosphate (ATP)， adenosine
diphosphate (ADP)， adenosine monophosphate (AMP)， total adenylic acid number (TAN)， energy charge (EC)， malondialdehyde (MDA)， superoxide dismutase (SOD)， nitric oxide products (NO2-/NO3-)，
thromboxane B2(TXB2)， 6-keto-prostaglandin F1Α (6-keto-PGF1Α) and TXB2/6-keto-PGF1Α(T/K) in the liver tissue were analyzed at 45 min after reperfusion. Results Compared with the HIRI group， L-Arg group showed a significant increase in contents of ATP， NO，
6-keto-PGF1Α， EC and SOD activity (P
metabolism against the reperfusion injury after liver ischemia by
decreasing oxygen free radical level， raising NO level and correcting the imbalance of TXA2/PGI2.
Key words reperfusion injury; liver; energe metablism;
L-Arginine 动物实验及临床研究证实，L-精氨酸(L-arginine，L-Arg)对肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI)具有较好的防治作用[1-4]。本研究在日本大耳白兔HIRI模型上，进一步观察L-Arg对肝缺血再灌注过程中高能磷酸化合物的干预，从而探讨其
对HIRI时肝细胞能量代谢的影响及其机制，为加强围手术期肝脏的保护提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 模型建立
日本大耳白兔30只，雌雄不拘，体质量1.8～2.8 kg，由温州医学院动物实验中心提供(温医动字：220002)。氨基甲酸乙酯1.0 g/kg静脉麻醉，消毒开腹，暴露肝门，于尾状叶上方游离肝左叶、中叶、右中叶及方形叶的血管、胆管，用无损伤钳夹闭血管，造成该四叶完全性缺血，45 min后松夹重新灌注45 min形成HIRI模型[5]。
1.2 实验分组
随机将实验兔分为3组，每组10只：?譹?訛对照组(C组)，仅行麻醉、开腹和游离肝叶等操作，不阻断肝血流。?譺?訛模型组(HIRI组)，行肝门阻断，缺血45 min后再灌注45 min。?譻?訛L-Arg干预组(L-Arg组)，分别在缺血前20 min及再灌注即刻静脉注射L-Arg溶液100 mg/kg(50 mg/mL，Sigma)，余同HIRI组。各组动物实验结束时，静脉注入10%氯化钾处死。
1.3 标本采集
3组动物均在再灌注45 min时取500 mg左中叶肝组织。一部分加5 mL HClO4(0.6 mol/L)制备匀浆，置高速冷冻离心机内1200 r/min共15 min，提取上清液，再加K2CO3(1.2 mol/L)1 mL，充分混匀，离心5000 r/min共10 min，取上清液以高效液相色谱法(HPLC)测定三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)含量;
另一部分制成10%匀浆，以测定NO2-/NO3-水平，MDA浓度，SOD活性，TXB2、6-keto-PGF1Α含量，检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;其余均为市售分析纯试剂。
1.4 检测方法
美国Beckman332 HPLC，色谱柱：OPSC18，检测波长：254 nm。HPLC测定ATP、ADP、AMP含量，并计算总腺苷酸(TAN)量(TAN=ATP+ADP+AMP)。肝细胞的能量状态用能荷(energy charge，EC)表示，计算公式：EC=(1/2ADP+ATP)/TAN。硝酸还原酶法检测一氧化氮代谢产物(NO2-/NO3-)浓度，硫代巴比妥酸法检测 MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定 SOD活性，放射免疫法测定TXB2、6-keto-PGF1Α含量，并计算T/K值。
1.5 统计学方法
所有数据以均数±标准差(x±s)表示，用SPSS17.0统计软件对数据进行统计学处理，组间分析采用单因素方差分析，双变量相关性检验采用Bivariate过程的Pearson相关分析法。
2 结果
2.1 肝组织ATP、ADP、AMP、TAN及能荷EC的变化 模型组与对照组比较，ATP、EC含量明显降低(P
ADP、AMP含量明显升高(P0.05)。见表1。
2.2 肝组织NO2-/NO3-、SOD、MDA、TXB2、6-keto-PGF1
Α及T/K值的变化
模型组与对照组比较，MDA和T/K值明显升高(P0.05);与模型组比较，L-Arg干预组NO2-/NO3-、SOD和6-keto-PGF1Α明显升高(P
P0.05)。见表2。
2.3 肝组织各指标之间的关系
直线相关分析显示：MDA、T/K与ATP水平之间存在明显的负相关关系，相关系数r分别为-0.616、-0.396，P分别
3 讨论
HIRI是临床工作经常面临的一个问题，如休克后的肝脏功能衰竭、肝移植及肝脏损伤和肿瘤的手术等。虽然肝细胞的损害可直接由缺血引起，但大量的证据说明大部分损伤发生于再灌注[6]。造成HIRI的原因是多因素的且十分复杂。业已证实，钙超载、氧自由基及其引发的脂质过氧化反应是HIRI形成的主要机制[7-8]。研究发现，高能磷酸化合物缺乏亦是HIRI的主要因素之一，川芎嗪注射液对肝细胞的高能磷酸化合物缺乏有不同程度地改善作用[9-10]。研究显示，L-Arg对HIRI有保护作用，其可能是通过抑制枯否氏细胞激活、 降低肿瘤坏死因子水平，从而减少氧自由基产生及减轻脂质过
氧化反应等来实现[11]。但有关L-Arg对HIRI时肝细胞能量代谢的影响，目前国内外鲜见报道。
从本实验结果可知，缺血再灌注处理后肝组织ATP含量及能荷EC明显降低，ADP、AMP含量明显升高，证实高能磷酸化合物缺乏是HIRI的主要因素之一。而用L-Arg干预后，ATP含量及EC均显著提高，提示外源性L-Arg可通过增加肝细胞的能量而减轻
HIRI。其机制可能是通过减少肝细胞ATP的分解，增加ATP的生成而延缓ATP的衰竭，进而加强肝细胞能量的储备，对肝细胞高能磷酸化合物具有明显保护作用。
本实验结果表明，用L-Arg对缺血再灌注肝脏进行干预后，肝组织SOD活性明显升高，MDA浓度显著降低，且两者与ATP水平之间呈显著正、负相关关系，提示外源性L-Arg能增加体内SOD活性，清除氧自由基，进而降低肝组织脂质过氧化程度，有效地改善肝细胞的能量代谢。本研究尚检测了再灌注45 min肝组织
NO2-/NO3-、6-keto-PGF1Α、TXB2水平，发现L-Arg干预后NO水平明显增高且与ATP水平之间存在正相关关系，表明外源性L-Arg可提高机体NO水平而发挥调控肝细胞能量代谢的作用，6-keto-PGF1Α水平亦显著提高，TXB2降低，T/K值显著减低，且T/K与ATP水平之间存在着明显的负相关关系，提示外源性L-Arg尚可通过提高体内PGI2水平及降低TXA2水平而有效地调控TXA2与PGI2间的失衡[12]，抑制血小板黏附、聚集[13]，改善肝脏血液灌流，确保肝细胞能量代谢的正常进行。
【参考文献】
[1] Tuncer MC， Ozturk H， Buyukbayram H， et al. Interaction of L-Arginine-methyl ester and Sonic hedgehog in liver
ischemia-reperfusion injury in the rats[J]. World J Gastroenterol，2007，13(28)：3841-3846.
[2] 王万铁，林丽娜，谢克俭，等. 左旋精氨酸对围手术期缺血-再灌注损伤肝脏的保护作用[J]. 中华消化杂志，2004，24(9)：560-561.
[3] Gong J， Lao XJ， Zhang SJ， et al. Protective effects of L-arginine against ischemia-reperfusion injury in non-heart beating rat liver graft[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2008，7(5)：481-484.
[4] 侍阳，钱海鑫，秦磊，等. 大鼠肝缺血/再灌注后肝组织一氧化氮和不同亚型一氧化氮合酶的变化[J]. 肝胆胰外科杂志，2008，20(1)：13-15.
[5] 王生兰，王丽华，李先加，等. 氧化应激在肝缺血再灌注损伤中的作用[J]. 青海医学院学报，2006，27(4)：251-253.
[6] 刘继明，朱兴国，朱华亭，等. IL-8单抗保护兔肝脏免受中性粒细胞介导的再灌注损伤[J]. 上海免疫学杂志，2001，21(1)：7-10.
[7] 杨少玲. 肝缺血再灌注损伤时血浆内毒的素动态变化和对肾的影响[J]. 包头医学院学报，2006，22(2)：139-141.
[8] 李旭明. 乌司他丁对肝缺血再灌注损伤患者血浆一氧化
氮/内皮素-1和炎症细胞因子的调控作用[J]. 实用医学杂志，2009，25(8)：1293-1295.
[9] 卢思聪，张峰，宋德静，等. 缺血预处理和缺血后处理联合应用对肝脏缺血/再灌注损伤的保护作用[J]. 江苏医药，2009，35(2)：194-196.
[10] 钱伟民，张中明，张伟，等. 磷酸肌酸、左旋精氨酸对移植供心保护作用的实验研究[J]. 徐州医学院学报，2006，26(2)：112-115.
[11] 王万铁，林丽娜，徐正祄，等. 肿瘤坏死因子在肝缺血-再灌注损伤中的作用及左旋精氨酸的干预[J]. 中国临床药理学与治疗学，2004，9(1)：92-94.
[12] 王万铁，徐正祄，林丽娜，等. 左旋精氨酸对缺血再灌注损伤肝脏的保护作用[J]. 中华肝脏病杂志，2000，8(6)：370-372.
[13] 王生兰. 肝缺血再灌注损伤的机制及药物保护作用[J]. 青海医学院学报，2005，26(1)：63-66.
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L-精氨酸对兔缺血再灌注损伤肝脏能量代谢的影响
作者：陈亮1，颜王鑫1，唐兰兰2，郝卯林2，谢克俭3，王万铁2 作者单位：(1.温州市第三人民医院 外科，浙江 温州 325000;温州医学院，浙江 温州 325035，2.病理生理学教研室; 3.检验医学院分析中心)
【摘要】 目的 探讨L-精氨酸(L-Arg)对肝缺血再灌注损伤(HIRI)时肝细胞能量代谢的影响及其机制。方法 实验兔30只，随机分为对照组(C组)，模型组(HIRI组)和L-Arg干预组(L-Arg组)。在再灌注45 min时，分别检测肝组织内三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)含量，总腺苷酸量(TAN)，能荷(EC)，丙二醛浓度(MDA)，超氧化物歧化酶活性(SOD)，一氧化氮代谢产物(NO2-/NO3-)水平，血栓素B2(TXB2)和6-酮基-前列腺素F1Α
(6-keto-PGF1Α)含量以及TXB2/6-keto-PGF1Α(T/K)值。结果 L-Arg组与HIRI组比较，肝组织内ATP、NO2-/NO3-、6-keto-PGF1Α含量，EC和SOD活性均明显增高(P
【关键词】 再灌注损伤;肝脏;能量代谢;L-精氨酸
Abstract Objective To explore the positive effects of
L-arginine(L-Arg) on hepatocellular energy metabolism against the
reperfusion injury after hepatic ischemia in rabbits. Methods Thirty rabbits were randomly divided into three groups： control group(C
group)， model group (HIRI group) and L-Arg intervention group (L-Arg group)， the contents of adenosine triphosphate (ATP)， adenosine
diphosphate (ADP)， adenosine monophosphate (AMP)， total adenylic acid number (TAN)， energy charge (EC)， malondialdehyde (MDA)， superoxide dismutase (SOD)， nitric oxide products (NO2-/NO3-)，
thromboxane B2(TXB2)， 6-keto-prostaglandin F1Α (6-keto-PGF1Α) and TXB2/6-keto-PGF1Α(T/K) in the liver tissue were analyzed at 45 min after reperfusion. Results Compared with the HIRI group， L-Arg group showed a significant increase in contents of ATP， NO，
6-keto-PGF1Α， EC and SOD activity (P
metabolism against the reperfusion injury after liver ischemia by
decreasing oxygen free radical level， raising NO level and correcting the imbalance of TXA2/PGI2.
Key words reperfusion injury; liver; energe metablism;
L-Arginine 动物实验及临床研究证实，L-精氨酸(L-arginine，L-Arg)对肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI)具有较好的防治作用[1-4]。本研究在日本大耳白兔HIRI模型上，进一步观察L-Arg对肝缺血再灌注过程中高能磷酸化合物的干预，从而探讨其
对HIRI时肝细胞能量代谢的影响及其机制，为加强围手术期肝脏的保护提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 模型建立
日本大耳白兔30只，雌雄不拘，体质量1.8～2.8 kg，由温州医学院动物实验中心提供(温医动字：220002)。氨基甲酸乙酯1.0 g/kg静脉麻醉，消毒开腹，暴露肝门，于尾状叶上方游离肝左叶、中叶、右中叶及方形叶的血管、胆管，用无损伤钳夹闭血管，造成该四叶完全性缺血，45 min后松夹重新灌注45 min形成HIRI模型[5]。
1.2 实验分组
随机将实验兔分为3组，每组10只：?譹?訛对照组(C组)，仅行麻醉、开腹和游离肝叶等操作，不阻断肝血流。?譺?訛模型组(HIRI组)，行肝门阻断，缺血45 min后再灌注45 min。?譻?訛L-Arg干预组(L-Arg组)，分别在缺血前20 min及再灌注即刻静脉注射L-Arg溶液100 mg/kg(50 mg/mL，Sigma)，余同HIRI组。各组动物实验结束时，静脉注入10%氯化钾处死。
1.3 标本采集
3组动物均在再灌注45 min时取500 mg左中叶肝组织。一部分加5 mL HClO4(0.6 mol/L)制备匀浆，置高速冷冻离心机内1200 r/min共15 min，提取上清液，再加K2CO3(1.2 mol/L)1 mL，充分混匀，离心5000 r/min共10 min，取上清液以高效液相色谱法(HPLC)测定三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)含量;
另一部分制成10%匀浆，以测定NO2-/NO3-水平，MDA浓度，SOD活性，TXB2、6-keto-PGF1Α含量，检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;其余均为市售分析纯试剂。
1.4 检测方法
美国Beckman332 HPLC，色谱柱：OPSC18，检测波长：254 nm。HPLC测定ATP、ADP、AMP含量，并计算总腺苷酸(TAN)量(TAN=ATP+ADP+AMP)。肝细胞的能量状态用能荷(energy charge，EC)表示，计算公式：EC=(1/2ADP+ATP)/TAN。硝酸还原酶法检测一氧化氮代谢产物(NO2-/NO3-)浓度，硫代巴比妥酸法检测 MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定 SOD活性，放射免疫法测定TXB2、6-keto-PGF1Α含量，并计算T/K值。
1.5 统计学方法
所有数据以均数±标准差(x±s)表示，用SPSS17.0统计软件对数据进行统计学处理，组间分析采用单因素方差分析，双变量相关性检验采用Bivariate过程的Pearson相关分析法。
2 结果
2.1 肝组织ATP、ADP、AMP、TAN及能荷EC的变化 模型组与对照组比较，ATP、EC含量明显降低(P
ADP、AMP含量明显升高(P0.05)。见表1。
2.2 肝组织NO2-/NO3-、SOD、MDA、TXB2、6-keto-PGF1
Α及T/K值的变化
模型组与对照组比较，MDA和T/K值明显升高(P0.05);与模型组比较，L-Arg干预组NO2-/NO3-、SOD和6-keto-PGF1Α明显升高(P
P0.05)。见表2。
2.3 肝组织各指标之间的关系
直线相关分析显示：MDA、T/K与ATP水平之间存在明显的负相关关系，相关系数r分别为-0.616、-0.396，P分别
3 讨论
HIRI是临床工作经常面临的一个问题，如休克后的肝脏功能衰竭、肝移植及肝脏损伤和肿瘤的手术等。虽然肝细胞的损害可直接由缺血引起，但大量的证据说明大部分损伤发生于再灌注[6]。造成HIRI的原因是多因素的且十分复杂。业已证实，钙超载、氧自由基及其引发的脂质过氧化反应是HIRI形成的主要机制[7-8]。研究发现，高能磷酸化合物缺乏亦是HIRI的主要因素之一，川芎嗪注射液对肝细胞的高能磷酸化合物缺乏有不同程度地改善作用[9-10]。研究显示，L-Arg对HIRI有保护作用，其可能是通过抑制枯否氏细胞激活、 降低肿瘤坏死因子水平，从而减少氧自由基产生及减轻脂质过
氧化反应等来实现[11]。但有关L-Arg对HIRI时肝细胞能量代谢的影响，目前国内外鲜见报道。
从本实验结果可知，缺血再灌注处理后肝组织ATP含量及能荷EC明显降低，ADP、AMP含量明显升高，证实高能磷酸化合物缺乏是HIRI的主要因素之一。而用L-Arg干预后，ATP含量及EC均显著提高，提示外源性L-Arg可通过增加肝细胞的能量而减轻
HIRI。其机制可能是通过减少肝细胞ATP的分解，增加ATP的生成而延缓ATP的衰竭，进而加强肝细胞能量的储备，对肝细胞高能磷酸化合物具有明显保护作用。
本实验结果表明，用L-Arg对缺血再灌注肝脏进行干预后，肝组织SOD活性明显升高，MDA浓度显著降低，且两者与ATP水平之间呈显著正、负相关关系，提示外源性L-Arg能增加体内SOD活性，清除氧自由基，进而降低肝组织脂质过氧化程度，有效地改善肝细胞的能量代谢。本研究尚检测了再灌注45 min肝组织
NO2-/NO3-、6-keto-PGF1Α、TXB2水平，发现L-Arg干预后NO水平明显增高且与ATP水平之间存在正相关关系，表明外源性L-Arg可提高机体NO水平而发挥调控肝细胞能量代谢的作用，6-keto-PGF1Α水平亦显著提高，TXB2降低，T/K值显著减低，且T/K与ATP水平之间存在着明显的负相关关系，提示外源性L-Arg尚可通过提高体内PGI2水平及降低TXA2水平而有效地调控TXA2与PGI2间的失衡[12]，抑制血小板黏附、聚集[13]，改善肝脏血液灌流，确保肝细胞能量代谢的正常进行。
【参考文献】
[1] Tuncer MC， Ozturk H， Buyukbayram H， et al. Interaction of L-Arginine-methyl ester and Sonic hedgehog in liver
ischemia-reperfusion injury in the rats[J]. World J Gastroenterol，2007，13(28)：3841-3846.
[2] 王万铁，林丽娜，谢克俭，等. 左旋精氨酸对围手术期缺血-再灌注损伤肝脏的保护作用[J]. 中华消化杂志，2004，24(9)：560-561.
[3] Gong J， Lao XJ， Zhang SJ， et al. Protective effects of L-arginine against ischemia-reperfusion injury in non-heart beating rat liver graft[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2008，7(5)：481-484.
[4] 侍阳，钱海鑫，秦磊，等. 大鼠肝缺血/再灌注后肝组织一氧化氮和不同亚型一氧化氮合酶的变化[J]. 肝胆胰外科杂志，2008，20(1)：13-15.
[5] 王生兰，王丽华，李先加，等. 氧化应激在肝缺血再灌注损伤中的作用[J]. 青海医学院学报，2006，27(4)：251-253.
[6] 刘继明，朱兴国，朱华亭，等. IL-8单抗保护兔肝脏免受中性粒细胞介导的再灌注损伤[J]. 上海免疫学杂志，2001，21(1)：7-10.
[7] 杨少玲. 肝缺血再灌注损伤时血浆内毒的素动态变化和对肾的影响[J]. 包头医学院学报，2006，22(2)：139-141.
[8] 李旭明. 乌司他丁对肝缺血再灌注损伤患者血浆一氧化
氮/内皮素-1和炎症细胞因子的调控作用[J]. 实用医学杂志，2009，25(8)：1293-1295.
[9] 卢思聪，张峰，宋德静，等. 缺血预处理和缺血后处理联合应用对肝脏缺血/再灌注损伤的保护作用[J]. 江苏医药，2009，35(2)：194-196.
[10] 钱伟民，张中明，张伟，等. 磷酸肌酸、左旋精氨酸对移植供心保护作用的实验研究[J]. 徐州医学院学报，2006，26(2)：112-115.
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[12] 王万铁，徐正祄，林丽娜，等. 左旋精氨酸对缺血再灌注损伤肝脏的保护作用[J]. 中华肝脏病杂志，2000，8(6)：370-372.
[13] 王生兰. 肝缺血再灌注损伤的机制及药物保护作用[J]. 青海医学院学报，2005，26(1)：63-66.
论文查重检测www.papersee.com