实验六
微生物培养基的制备和灭菌
实验项目性质：综合实验
所属课程名称：《微生物学实验》
实验计划学时：5学时
一、实验目的
1. 了解并掌握培养基的配制、分装方法；
2. 掌握各种实验室灭菌方法及技术。
二、实验原理
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH 值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
三、实验材料
1、器皿及材料
天平、称量纸、牛角匙、精密pH 试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。
2、药品试剂
蛋白胨、牛肉膏、NaCl 、K 2HPO 4、琼脂、NaNO 3、KCl 、MgSO 4、FeSO 4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。
3、流程
称药品→溶解→调pH 值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。
四、实验步骤
1 培养基的制备
1.1 称量药品
根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
1.2 溶解
用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。
1.3 调节pH
根据培养基对pH 的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH 。测定pH 可用pH 试纸或酸度计等。
1.4 溶化琼脂
固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热) 。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
1.5 过滤分装
分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞， 引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。
1.6 包扎标记
培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。
1.7 灭菌
上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121℃20min ，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。
1.8 倒平板
将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到45～50℃, 立刻倒平板。
2 灭菌方法
灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。
加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内 蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。
2.1 湿热灭菌
煮沸消毒法 ：注射器和解剖器械等均可采用此法。先将注射器等用纱布包好，然后放进煮沸消毒器内加水煮沸。对于细菌的营养体煮沸约15～30min ，对于芽孢则需煮沸约1～2h 。
高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min ，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。
2.2 操作方法和注意事项
加水：打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。
装料、加盖：灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使
蒸汽锅密闭，勿使漏气。
排气：打开排气口(也叫放气阀) 。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min ，使锅内冷空气完全排净。
升压、保压和降压：当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃，20min ）后，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。
灭菌后的培养基空白培养：灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养，经24h 培养无菌生长，可保存备用；斜面培养基取出后，立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后，空白培养。
2.2 干热灭菌法
通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160～170℃维持1～2h 。
干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。
2.2.1 灭菌前的准备
玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞，以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸，用棉绳以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心，轻轻捅入管口，松紧必须适中，管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去，灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌，也可用纸条斜着从吸管尖端包起，逐步向上卷，头端的纸卷捏扁并拧几下，再将包好的吸管集中灭菌。
2.2.2 干燥箱灭菌
将包扎好的物品放入干燥烘箱内，注意不要摆放太密，以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触。将烘箱的温度升至160～170℃并恒温1～2h ，注意勿使温度过高，超过170℃，器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧。如果是为了烤干玻璃器皿，温度为120℃持续30分钟即可。温度降至60～70℃时方可打开箱门，取出物品，否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。
用此法灭菌时，绝不能用油、蜡纸包扎物品。
2.2.3 火焰灭菌
直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻底。对于接种环，接种针或其它金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也采用通过火焰而达到灭菌的目的。
五、实验结果
1、记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件（温度、压力等）。
2、试述高压蒸汽灭菌的过程及注意事项。
六、思考题
1、制备培养基的一般程序是什么？
2、做过本次实验后，你认为在制备培养基时要注意些什么问题？
3、灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义？
4、试述高压蒸汽灭菌的操作方法和原理。
5、高压蒸汽灭菌时应注意哪些事项？
实验七
微生物的分离、培养和菌种保藏
实验项目性质：实验
所属课程名称：《微生物学实验》
实验计划学时：6学时
一、 实验目的
1、了解微生物分离和纯化的原理；
2、掌握常用的分离纯化微生物的方法；
3、掌握菌落特征的观察；
4、学习掌握微生物的几种接种技术；
5、 建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节。
二、实验原理
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求, 或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。
将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠，影响下一步工作的进行。
三、实验材料
1 培养基和菌种
淀粉琼脂培养基(高氏I 号培养基) ，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基，土壤（活性污泥）混合液。普通琼脂斜面和平板, 营养肉汤, 普通琼脂高层(直
立柱) 。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。
2 溶液或试剂
10%酚液，盛9ml 无菌水的试管，盛90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。 3 仪器或其它用具
无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板、涂布器等。酒精灯，玻璃铅笔，火柴，试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、移液管、三角型接种棒等接种工具。
四、实验步骤
1、流程
倒平板→制备梯度稀释液→涂布（或划线法）→培养→挑单菌落→保存。
2、步骤
2.1稀释涂布平板法
2.1.1 倒平板
将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I 号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶化待冷至55～60℃时，高氏I 号琼脂培养基中加入10%酚数滴，马丁氏培养中加入链霉素溶液(终浓度30μg/ml)，混合均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml ，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
2.1.2 制备土壤混合液稀释液
称取土样l0g ，放入盛90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min ，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支lml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的活性污泥混合液溶液，注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管。
2.1.3 涂布
将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6，从三管活性污泥混合液稀释液中各吸取0.1或0.2ml ，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。
用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～l0min ，使菌液浸入培养基。
2.1.4 培养
将高氏I 号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养3～5d ，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2～3d 。
2.1.5 观察并挑菌落
将培养后长出的单个菌落根据其大小、颜色、形状等特征进行观察，之后根据菌落不同特征分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基斜面上，分别置28℃和37℃温室培养。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
2.2 平板划线分离法
2.2.1 倒平板
按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期。
2.2.2 划线
在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-l 的活性污泥混合液悬液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
用接种环以无菌操作挑取活性污泥混合液悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。
2.2.3 挑菌落
同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。
3、常用四种接种方法操作指导：
斜面接种法：斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。将菌种斜面培养基(简称菌种管) 与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管) 持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈45～50度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。以右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S 形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管贴好标签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。
液体接种法：多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，其操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同，仅将不同点介绍如下：由斜面培养物接种至液体培养基：用接种环从斜面上沾取少许菌苔，接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次即可。如接种霉菌菌种时，若用接种环不易挑起培养物时，可用接种钩或接种铲进行。由液体培养物接种液体培养基时，可用接种环或接种针沾取少许液体移至新液体培养基即可。也可根据需要用吸管、滴管或注射器吸取培养液移至新液体培养基即可。接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿上，以免造成污染。如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内。
固体接种法：普通斜面和平板接种均属于固体接种，斜面接种法已讲了，不再赘述。固体接种的另一种形式是接种固体曲料，进行固体发酵。按所用菌种或种子菌来源不同可分为：用菌液接种固体料，包括用菌苔刮洗制成的菌悬液和直接培养的种子发酵液。接种时按无菌操作将菌液直接倒入固体料中，搅拌均匀。但要注意接种所用水容量要计算在固体料总加水量之内，否则会使接种后含水量加大，影响培养效果。用固体种子接种固体料。包括用孢子
粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌。将种子菌于无菌条件下直接倒入无菌的固体料中即可，但必须充分搅拌使之混合均匀。一般是先把种子菌和少部分固体料混匀后再拌大堆料。
穿刺接种法：此法多用于半固体、醋酸铅、三糖铁琼脂与明胶培养基的接种，操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同。但必须使用笔直的接种针，而不能使用接种环。接种柱状高层或半高层斜面培养管时，应向培养基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接种针。注意勿使接种针在培养基内左右移动，以使穿刺线整齐，便于观察生长结果。
五、实验结果
实验结果应该以所做涂布平板法和划线法较好地得到了单菌落为目的，如果不是，请分析其原因并重做。
六、思考题
1、如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？在平板上你分离得到哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。
2、为什么高氏I 号培养基和马丁氏培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做？
3、试述如何在接种中，贯彻无菌操作的原则?
4、以斜面上的菌种接种到新的斜面培养基为例说明操作方法和注意事项。
5、试设计一个实验，从土壤中分离酵母菌。
一、牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌用)
牛肉膏 3g
蛋白胨 10g
NaCl 5g
琼脂 15-20g
水 1000ml
pH 7．0-7．2
1．05kg/cm ，121．3℃灭菌20分钟。
二、淀粉琼脂培养基(高氏1号培养基，培养放线菌用)
可溶性淀粉 20g
KNO 3 1g
NaCl 0．5g 2
K 2 HPO 4 0．5g
MgSO 4 0．5g
FeSO 4 0．01g
琼脂 20g
水 1000ml
pH 7．2-7．4
配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，在火上加热，边搅拌边加水及其他成分，溶化后，补足水分至1000ml 。1．05kg/cm ，121．3℃灭菌20分钟。
三、查氏培养基(培养霉菌用)
NaNO 3 2g
K 2 HPO 4 1g
KCl 0．5g
MgSO 4 0．5g
FeSO 4 0．01g
蔗糖 30g
琼脂 15-20g
水 1000ml
pH 自然
1．05kg/cm ，121．3℃灭菌20分钟。
四、马丁氏(Martin)琼脂培养基(分离真菌用)
葡萄糖 10g
蛋白胨 5g
KH 2 PO 4 1g
MgSO 4 7H 2 O 0．5g 22
1/3000孟加拉红(rose bengal，玫瑰红水溶液)
100ml
琼脂 15-20g
pH 自然
蒸馏水 800ml
0．56kg/cm (8磅/英寸 ) ，112．6℃灭菌30分钟。
临用前加入0．03%链霉素稀释液100ml ，使每毫升培养基中含链霉素30μg 。
五、马铃薯培养基
马铃薯 200g
蔗糖(或葡萄糖) 20g
琼脂 15-20g
水 1000ml
pH 自然
马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000ml 。1．05kg/cm ，121．3℃灭菌20分钟。
六、麦芽汁琼脂培养基
1．取大麦或小麦若干，用水洗净，浸水6-12小时，置15℃阴暗处发芽，上盖纱布一块，每日早、中、晚淋水一次，麦根伸长至麦粒的两倍时，即停止发芽，摊开晒干或烘干，贮存备用。
2．将干麦芽磨碎，一份麦芽加四份水，在65℃水浴锅中糖化3-4小时，糖化程度可用碘滴定之。
3．将糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约20ml ，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。
4．将滤液稀释到5-6波美度，pH 约6．4，加入2%琼脂即成。
1．05kg/cm ，121．3℃灭菌20分钟。 2222
实验六
微生物培养基的制备和灭菌
实验项目性质：综合实验
所属课程名称：《微生物学实验》
实验计划学时：5学时
一、实验目的
1. 了解并掌握培养基的配制、分装方法；
2. 掌握各种实验室灭菌方法及技术。
二、实验原理
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH 值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
三、实验材料
1、器皿及材料
天平、称量纸、牛角匙、精密pH 试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。
2、药品试剂
蛋白胨、牛肉膏、NaCl 、K 2HPO 4、琼脂、NaNO 3、KCl 、MgSO 4、FeSO 4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。
3、流程
称药品→溶解→调pH 值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。
四、实验步骤
1 培养基的制备
1.1 称量药品
根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
1.2 溶解
用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。
1.3 调节pH
根据培养基对pH 的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH 。测定pH 可用pH 试纸或酸度计等。
1.4 溶化琼脂
固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热) 。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
1.5 过滤分装
分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞， 引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。
1.6 包扎标记
培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。
1.7 灭菌
上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121℃20min ，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。
1.8 倒平板
将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到45～50℃, 立刻倒平板。
2 灭菌方法
灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。
加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内 蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。
2.1 湿热灭菌
煮沸消毒法 ：注射器和解剖器械等均可采用此法。先将注射器等用纱布包好，然后放进煮沸消毒器内加水煮沸。对于细菌的营养体煮沸约15～30min ，对于芽孢则需煮沸约1～2h 。
高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min ，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。
2.2 操作方法和注意事项
加水：打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。
装料、加盖：灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使
蒸汽锅密闭，勿使漏气。
排气：打开排气口(也叫放气阀) 。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min ，使锅内冷空气完全排净。
升压、保压和降压：当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃，20min ）后，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。
灭菌后的培养基空白培养：灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养，经24h 培养无菌生长，可保存备用；斜面培养基取出后，立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后，空白培养。
2.2 干热灭菌法
通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160～170℃维持1～2h 。
干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。
2.2.1 灭菌前的准备
玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞，以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸，用棉绳以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心，轻轻捅入管口，松紧必须适中，管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去，灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌，也可用纸条斜着从吸管尖端包起，逐步向上卷，头端的纸卷捏扁并拧几下，再将包好的吸管集中灭菌。
2.2.2 干燥箱灭菌
将包扎好的物品放入干燥烘箱内，注意不要摆放太密，以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触。将烘箱的温度升至160～170℃并恒温1～2h ，注意勿使温度过高，超过170℃，器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧。如果是为了烤干玻璃器皿，温度为120℃持续30分钟即可。温度降至60～70℃时方可打开箱门，取出物品，否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。
用此法灭菌时，绝不能用油、蜡纸包扎物品。
2.2.3 火焰灭菌
直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻底。对于接种环，接种针或其它金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也采用通过火焰而达到灭菌的目的。
五、实验结果
1、记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件（温度、压力等）。
2、试述高压蒸汽灭菌的过程及注意事项。
六、思考题
1、制备培养基的一般程序是什么？
2、做过本次实验后，你认为在制备培养基时要注意些什么问题？
3、灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义？
4、试述高压蒸汽灭菌的操作方法和原理。
5、高压蒸汽灭菌时应注意哪些事项？
实验七
微生物的分离、培养和菌种保藏
实验项目性质：实验
所属课程名称：《微生物学实验》
实验计划学时：6学时
一、 实验目的
1、了解微生物分离和纯化的原理；
2、掌握常用的分离纯化微生物的方法；
3、掌握菌落特征的观察；
4、学习掌握微生物的几种接种技术；
5、 建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节。
二、实验原理
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求, 或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。
将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠，影响下一步工作的进行。
三、实验材料
1 培养基和菌种
淀粉琼脂培养基(高氏I 号培养基) ，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基，土壤（活性污泥）混合液。普通琼脂斜面和平板, 营养肉汤, 普通琼脂高层(直
立柱) 。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。
2 溶液或试剂
10%酚液，盛9ml 无菌水的试管，盛90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。 3 仪器或其它用具
无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板、涂布器等。酒精灯，玻璃铅笔，火柴，试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、移液管、三角型接种棒等接种工具。
四、实验步骤
1、流程
倒平板→制备梯度稀释液→涂布（或划线法）→培养→挑单菌落→保存。
2、步骤
2.1稀释涂布平板法
2.1.1 倒平板
将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I 号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基加热溶化待冷至55～60℃时，高氏I 号琼脂培养基中加入10%酚数滴，马丁氏培养中加入链霉素溶液(终浓度30μg/ml)，混合均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。
倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约15ml ，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
2.1.2 制备土壤混合液稀释液
称取土样l0g ，放入盛90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min ，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支lml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的活性污泥混合液溶液，注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支试管。
2.1.3 涂布
将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6，从三管活性污泥混合液稀释液中各吸取0.1或0.2ml ，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。
用无菌玻璃涂棒，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～l0min ，使菌液浸入培养基。
2.1.4 培养
将高氏I 号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养3～5d ，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2～3d 。
2.1.5 观察并挑菌落
将培养后长出的单个菌落根据其大小、颜色、形状等特征进行观察，之后根据菌落不同特征分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基斜面上，分别置28℃和37℃温室培养。若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
2.2 平板划线分离法
2.2.1 倒平板
按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期。
2.2.2 划线
在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-l 的活性污泥混合液悬液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论采用哪种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
用接种环以无菌操作挑取活性污泥混合液悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温室培养。
2.2.3 挑菌落
同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。
3、常用四种接种方法操作指导：
斜面接种法：斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。将菌种斜面培养基(简称菌种管) 与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管) 持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈45～50度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。以右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S 形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管贴好标签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。
液体接种法：多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，其操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同，仅将不同点介绍如下：由斜面培养物接种至液体培养基：用接种环从斜面上沾取少许菌苔，接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次即可。如接种霉菌菌种时，若用接种环不易挑起培养物时，可用接种钩或接种铲进行。由液体培养物接种液体培养基时，可用接种环或接种针沾取少许液体移至新液体培养基即可。也可根据需要用吸管、滴管或注射器吸取培养液移至新液体培养基即可。接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿上，以免造成污染。如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内。
固体接种法：普通斜面和平板接种均属于固体接种，斜面接种法已讲了，不再赘述。固体接种的另一种形式是接种固体曲料，进行固体发酵。按所用菌种或种子菌来源不同可分为：用菌液接种固体料，包括用菌苔刮洗制成的菌悬液和直接培养的种子发酵液。接种时按无菌操作将菌液直接倒入固体料中，搅拌均匀。但要注意接种所用水容量要计算在固体料总加水量之内，否则会使接种后含水量加大，影响培养效果。用固体种子接种固体料。包括用孢子
粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌。将种子菌于无菌条件下直接倒入无菌的固体料中即可，但必须充分搅拌使之混合均匀。一般是先把种子菌和少部分固体料混匀后再拌大堆料。
穿刺接种法：此法多用于半固体、醋酸铅、三糖铁琼脂与明胶培养基的接种，操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同。但必须使用笔直的接种针，而不能使用接种环。接种柱状高层或半高层斜面培养管时，应向培养基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接种针。注意勿使接种针在培养基内左右移动，以使穿刺线整齐，便于观察生长结果。
五、实验结果
实验结果应该以所做涂布平板法和划线法较好地得到了单菌落为目的，如果不是，请分析其原因并重做。
六、思考题
1、如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？在平板上你分离得到哪些类群的微生物？简述它们的菌落特征。
2、为什么高氏I 号培养基和马丁氏培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做？
3、试述如何在接种中，贯彻无菌操作的原则?
4、以斜面上的菌种接种到新的斜面培养基为例说明操作方法和注意事项。
5、试设计一个实验，从土壤中分离酵母菌。
一、牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌用)
牛肉膏 3g
蛋白胨 10g
NaCl 5g
琼脂 15-20g
水 1000ml
pH 7．0-7．2
1．05kg/cm ，121．3℃灭菌20分钟。
二、淀粉琼脂培养基(高氏1号培养基，培养放线菌用)
可溶性淀粉 20g
KNO 3 1g
NaCl 0．5g 2
K 2 HPO 4 0．5g
MgSO 4 0．5g
FeSO 4 0．01g
琼脂 20g
水 1000ml
pH 7．2-7．4
配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，在火上加热，边搅拌边加水及其他成分，溶化后，补足水分至1000ml 。1．05kg/cm ，121．3℃灭菌20分钟。
三、查氏培养基(培养霉菌用)
NaNO 3 2g
K 2 HPO 4 1g
KCl 0．5g
MgSO 4 0．5g
FeSO 4 0．01g
蔗糖 30g
琼脂 15-20g
水 1000ml
pH 自然
1．05kg/cm ，121．3℃灭菌20分钟。
四、马丁氏(Martin)琼脂培养基(分离真菌用)
葡萄糖 10g
蛋白胨 5g
KH 2 PO 4 1g
MgSO 4 7H 2 O 0．5g 22
1/3000孟加拉红(rose bengal，玫瑰红水溶液)
100ml
琼脂 15-20g
pH 自然
蒸馏水 800ml
0．56kg/cm (8磅/英寸 ) ，112．6℃灭菌30分钟。
临用前加入0．03%链霉素稀释液100ml ，使每毫升培养基中含链霉素30μg 。
五、马铃薯培养基
马铃薯 200g
蔗糖(或葡萄糖) 20g
琼脂 15-20g
水 1000ml
pH 自然
马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000ml 。1．05kg/cm ，121．3℃灭菌20分钟。
六、麦芽汁琼脂培养基
1．取大麦或小麦若干，用水洗净，浸水6-12小时，置15℃阴暗处发芽，上盖纱布一块，每日早、中、晚淋水一次，麦根伸长至麦粒的两倍时，即停止发芽，摊开晒干或烘干，贮存备用。
2．将干麦芽磨碎，一份麦芽加四份水，在65℃水浴锅中糖化3-4小时，糖化程度可用碘滴定之。
3．将糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约20ml ，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。
4．将滤液稀释到5-6波美度，pH 约6．4，加入2%琼脂即成。
1．05kg/cm ，121．3℃灭菌20分钟。 2222