摘要：目的：建立超高效液相色谱法测定血清中卡马西平的质量浓度。方法：血样经乙醚萃取后，经WATERS BEH C18（2.1×50mm，1.7μm）分离，甲醇-水为流动相进行色谱分析，检测波长为214nm。结果：本方法线性范围为1.0-20.0μg/mlμg/ml（r=0.9948），高、中、低血样的平均回收率分别为102.3%、103.2%、100.8%，日内、日间RSD小于10%。结论：本法操作简便，回收率高，精密度好，适用于临床常规检测卡马西平的血药浓度。 关键词：超高效液相色谱；卡马西平；血药浓度 UPLC determination of Carbamazepine concentrations in human serum Abstract Objective： To establish a UPLC method for detecting carbamazepine concentration in serum. Method： Carbamazepine was extracted from serum with diethyl and separated using a WATERS BEH C18（2.1×50mm，1.7μm）. Mobile phase was a mixture of methanol and water and the detected wavelength was at 214nm. Result： The linear range of carbamazepine was from 1.0μg/ml to 20.0μg/ml， r=0.9948. The recovery rate of low、moderate、high concentrations were 100.8%、103.2%、102.3%. The intraday and interday RSD were all less than 10%. Conclusions： This method was simple， accurate， precise and suitable for monitoring blood-drug concentration of carbamazepine. Key words： UPLC carbamazepine blood drug concentration 卡马西平（Carbamazepine，CBZ）于1970年开始用于癫痫治疗，是单纯及复杂部分性发作的首选药，目前广泛应用于三叉神经痛和舌咽神经痛发作、躁狂-抑郁症、中枢性部分性尿崩症和乙醇成瘾的戒断综合征。卡马西平口服吸收缓慢且不规律，使用周期长，经常合并用药[1]。由于本品诱导自身代谢的个体差异，抗癫痫作用起效时间相差很大，其有效血药浓度为4～12μg/ml（20～50μmol/L）[2]。由于其化学结构和三环类抗抑郁药相似，可能会也激发潜在精神病以及老年人的精神紊乱或激动不安。常见的不良反应为视力模糊、复视、眼球震颤等中枢神经系统反应，且发生率随着血药浓度的增高（大于8.5～10μg/ml）而增多[3]。临床应用为获得有效浓度控制癫痫发作又无明显不良反应，需常规监测卡马西平的血药浓度。 抗癫痫药物的测定方法有紫外分光光度法（UV）、薄层色谱分析（TLC）、酶联免疫法（EMIT）、荧光偏振免疫法（FPIA）和高效液相色谱法（HPLC）。高效液相色谱法具有灵敏、精确、同时测定多种药品等优点，在药物血药浓度监测中越来越常用。超高效液相色谱法（UPLC）较HPLC法具有快速、高分离度、高灵敏度、试剂成本低等特点，可以将分析能力迅速提升到20～30个样品/小时。本实验参考HPLC相关文献[4-8]拟建立血清中卡马西平的UPLC测定方法，并进行全面的方法学确证和评估，为推测卡马西平的治疗窗提供可行方法和理论依据。 1仪器与试药 1.1 仪器：WATERS Acquity UPLC超高效液相色谱仪（美国WATERS公司），包括WATERS Acquity UPLC PDA 检测器、Empower2色谱数据工作站；L8W离心机（上海跃进医疗器械厂）；WXH微型旋涡混合器（上海跃进医疗器械厂）；数显三用恒温水箱HH-W420（金坛市科析仪器有限公司）。 1.2试药：卡马西平对照品（Acros Organics，批号：A0272746，含量：99%）；甲醇为色谱纯，乙醚为分析纯，水为去离子水。 1.3溶液配制 卡马西平对照品溶液的配制：精密称取卡马西平对照品10mg于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配置成浓度为100μg/ml的标准储备液。置4℃冰箱中冷藏保存。 2方法与结果 2.1确定检测波长 称取适量的CBZ溶于乙醇中，配制成每1ml中含10μg的溶液，在200～410nm的范围进行紫外-可见分光光度法测定，结果见图1，发现CBZ在波长214处有最大吸收，因此以214nm为检测波长。 2.2色谱条件 色谱柱：WATERS BEH C18（2.1×50mm，1.7μm），加保护柱VanGuardTM Pre-Column 3/Pk 2.1×5mm Column；流动相：甲醇-水（40：60，V/V），流速为0.4 ml/min；柱温：30℃；进样量：1ul，检测波长：214nm。 2.3血样前处理 精密吸取样品血清100μl置10ml离心试管中，加4ml乙醚进行漩涡振荡萃取2min，2000r/min离心3min，吸取乙醚层，重复萃取3次，合并3次乙醚层，置40℃水浴蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，过滤后进样。 2.4色谱行为 在上述色谱条件下，色谱峰形对称，保留时间为4.200min。血中内源性物质不干扰样品测定。色谱图见图2。 2.5标准曲线及线性范围 精密量取卡马西平储备液适量，加入空白全血，配制成20.0、18.0、15.0、10.0、5.0、1.0μg/ml系列浓度，按照2.3前处理方法处理后，按照2.2色谱条件进行分析，记录色谱峰及面积。测定结果以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程：y=32010x - 20273，r=0.9948。结果表明，卡马西平浓度在1.0-20.0μg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。 2.6稳定性 精密量取卡马西平储备液适量，加入空白全血，配制成浓度为10.0μg/ml的溶液，按照2.3前处理方法处理后，按照2.2色谱条件连续重复进样6次进行分析，分别测其峰面积并计算RSD，结果RSD=0.47%（n=6），表明稳定性良好。 2.7回收率与精密度实验 精密量取卡马西平储备液适量，加入空白全血，配制成含量1.0，10.0，20.0μg /ml的血样，按照2.3前处理方法处理后，按照2.2色谱条件进行分析，每一浓度进行5样本分析。记录色谱峰及面积。以卡马西平峰面积A与未经提取处理的对照品卡马西平峰面积A0计算回收率及日内精密度，并连续测定5天，计算日间精密度。结果见下表。 3讨论 卡马西平是临床上常用的抗癫痫药，其有效血药浓度范围窄（4～12μg/ml）。由于诱导自身代谢的个体差异大，血药浓度与其疗效和不良反应关系密切，且抗癫痫治疗疗程长，医生仅凭经验与常规用药剂量难以有效控制癫痫发作[7-8]。因此需要测定血清中药物浓度，用以提示临床医师调整给药剂量，提高疗效，本实验采用UPLC法测定。 血样提取过程选用乙醚，主要是其毒性较小、沸点很低、容易挥发，提取效率高，可达到快速操作的目的。 本实验得到的方法回收率低、中、高浓度分别为100.8%、103.2%、102.3%，证明本实验结果可靠、准确；但相对标准偏差较大，提示血液中影响因素较多，临床用药不能只看数据，要综合多中因素，谨慎用药。 抗癫痫治疗中多数患者实通过长期用药以控制病情，但临床医师需根据血药浓度监测，结合临床症状，制定合理的给药方案，控制血药浓度在有效范围内。本实验建立的方法操作简便、快速，结果可靠，且重现性好，可用于临床常规检查。 参考文献： 1冯绍文，何小敏，容颖慈等.卡马西平血药浓度监测的临床意义[J].中国实用医药，2009，36（4）：41-42. 2陈新谦，金有豫，汤光.《新编药物学》[M].17版. 北京：人民卫生出版社，2011： 215. 3国家药典委员会编.中华人民共和国临床用药须知化学药盒生物制品卷[S].第1版.北京：中国医药科技出版社，2011：32-35. 4严娟，秦群等.卡马西平、苯妥英钠和苯巴比妥的血药浓度与不良反应及疗效相关性[J]. 中国医院药学杂志，2011，31（7）：580-584. 5郑仁达，洪冰.卡马西平血药浓度监测及应用[J].海峡药学，2010，22（11）：245-246. 6张轶昕，王海良，谢海萍.卡马西平治疗癫血药浓度监测及合理用药[J].实用药物与临床，2010，13（6）：420-425. 7刘超.卡马西平治疗58例癫疒间患者的血药浓度检测[J].中国医药导报，2009，6（11）：132-133. 8黄国平.卡马西平血药浓度监测7例及其分析[J].实用药物与临床，2007，10（5）： 293.
摘要：目的：建立超高效液相色谱法测定血清中卡马西平的质量浓度。方法：血样经乙醚萃取后，经WATERS BEH C18（2.1×50mm，1.7μm）分离，甲醇-水为流动相进行色谱分析，检测波长为214nm。结果：本方法线性范围为1.0-20.0μg/mlμg/ml（r=0.9948），高、中、低血样的平均回收率分别为102.3%、103.2%、100.8%，日内、日间RSD小于10%。结论：本法操作简便，回收率高，精密度好，适用于临床常规检测卡马西平的血药浓度。 关键词：超高效液相色谱；卡马西平；血药浓度 UPLC determination of Carbamazepine concentrations in human serum Abstract Objective： To establish a UPLC method for detecting carbamazepine concentration in serum. Method： Carbamazepine was extracted from serum with diethyl and separated using a WATERS BEH C18（2.1×50mm，1.7μm）. Mobile phase was a mixture of methanol and water and the detected wavelength was at 214nm. Result： The linear range of carbamazepine was from 1.0μg/ml to 20.0μg/ml， r=0.9948. The recovery rate of low、moderate、high concentrations were 100.8%、103.2%、102.3%. The intraday and interday RSD were all less than 10%. Conclusions： This method was simple， accurate， precise and suitable for monitoring blood-drug concentration of carbamazepine. Key words： UPLC carbamazepine blood drug concentration 卡马西平（Carbamazepine，CBZ）于1970年开始用于癫痫治疗，是单纯及复杂部分性发作的首选药，目前广泛应用于三叉神经痛和舌咽神经痛发作、躁狂-抑郁症、中枢性部分性尿崩症和乙醇成瘾的戒断综合征。卡马西平口服吸收缓慢且不规律，使用周期长，经常合并用药[1]。由于本品诱导自身代谢的个体差异，抗癫痫作用起效时间相差很大，其有效血药浓度为4～12μg/ml（20～50μmol/L）[2]。由于其化学结构和三环类抗抑郁药相似，可能会也激发潜在精神病以及老年人的精神紊乱或激动不安。常见的不良反应为视力模糊、复视、眼球震颤等中枢神经系统反应，且发生率随着血药浓度的增高（大于8.5～10μg/ml）而增多[3]。临床应用为获得有效浓度控制癫痫发作又无明显不良反应，需常规监测卡马西平的血药浓度。 抗癫痫药物的测定方法有紫外分光光度法（UV）、薄层色谱分析（TLC）、酶联免疫法（EMIT）、荧光偏振免疫法（FPIA）和高效液相色谱法（HPLC）。高效液相色谱法具有灵敏、精确、同时测定多种药品等优点，在药物血药浓度监测中越来越常用。超高效液相色谱法（UPLC）较HPLC法具有快速、高分离度、高灵敏度、试剂成本低等特点，可以将分析能力迅速提升到20～30个样品/小时。本实验参考HPLC相关文献[4-8]拟建立血清中卡马西平的UPLC测定方法，并进行全面的方法学确证和评估，为推测卡马西平的治疗窗提供可行方法和理论依据。 1仪器与试药 1.1 仪器：WATERS Acquity UPLC超高效液相色谱仪（美国WATERS公司），包括WATERS Acquity UPLC PDA 检测器、Empower2色谱数据工作站；L8W离心机（上海跃进医疗器械厂）；WXH微型旋涡混合器（上海跃进医疗器械厂）；数显三用恒温水箱HH-W420（金坛市科析仪器有限公司）。 1.2试药：卡马西平对照品（Acros Organics，批号：A0272746，含量：99%）；甲醇为色谱纯，乙醚为分析纯，水为去离子水。 1.3溶液配制 卡马西平对照品溶液的配制：精密称取卡马西平对照品10mg于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配置成浓度为100μg/ml的标准储备液。置4℃冰箱中冷藏保存。 2方法与结果 2.1确定检测波长 称取适量的CBZ溶于乙醇中，配制成每1ml中含10μg的溶液，在200～410nm的范围进行紫外-可见分光光度法测定，结果见图1，发现CBZ在波长214处有最大吸收，因此以214nm为检测波长。 2.2色谱条件 色谱柱：WATERS BEH C18（2.1×50mm，1.7μm），加保护柱VanGuardTM Pre-Column 3/Pk 2.1×5mm Column；流动相：甲醇-水（40：60，V/V），流速为0.4 ml/min；柱温：30℃；进样量：1ul，检测波长：214nm。 2.3血样前处理 精密吸取样品血清100μl置10ml离心试管中，加4ml乙醚进行漩涡振荡萃取2min，2000r/min离心3min，吸取乙醚层，重复萃取3次，合并3次乙醚层，置40℃水浴蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，过滤后进样。 2.4色谱行为 在上述色谱条件下，色谱峰形对称，保留时间为4.200min。血中内源性物质不干扰样品测定。色谱图见图2。 2.5标准曲线及线性范围 精密量取卡马西平储备液适量，加入空白全血，配制成20.0、18.0、15.0、10.0、5.0、1.0μg/ml系列浓度，按照2.3前处理方法处理后，按照2.2色谱条件进行分析，记录色谱峰及面积。测定结果以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线，计算得回归方程：y=32010x - 20273，r=0.9948。结果表明，卡马西平浓度在1.0-20.0μg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。 2.6稳定性 精密量取卡马西平储备液适量，加入空白全血，配制成浓度为10.0μg/ml的溶液，按照2.3前处理方法处理后，按照2.2色谱条件连续重复进样6次进行分析，分别测其峰面积并计算RSD，结果RSD=0.47%（n=6），表明稳定性良好。 2.7回收率与精密度实验 精密量取卡马西平储备液适量，加入空白全血，配制成含量1.0，10.0，20.0μg /ml的血样，按照2.3前处理方法处理后，按照2.2色谱条件进行分析，每一浓度进行5样本分析。记录色谱峰及面积。以卡马西平峰面积A与未经提取处理的对照品卡马西平峰面积A0计算回收率及日内精密度，并连续测定5天，计算日间精密度。结果见下表。 3讨论 卡马西平是临床上常用的抗癫痫药，其有效血药浓度范围窄（4～12μg/ml）。由于诱导自身代谢的个体差异大，血药浓度与其疗效和不良反应关系密切，且抗癫痫治疗疗程长，医生仅凭经验与常规用药剂量难以有效控制癫痫发作[7-8]。因此需要测定血清中药物浓度，用以提示临床医师调整给药剂量，提高疗效，本实验采用UPLC法测定。 血样提取过程选用乙醚，主要是其毒性较小、沸点很低、容易挥发，提取效率高，可达到快速操作的目的。 本实验得到的方法回收率低、中、高浓度分别为100.8%、103.2%、102.3%，证明本实验结果可靠、准确；但相对标准偏差较大，提示血液中影响因素较多，临床用药不能只看数据，要综合多中因素，谨慎用药。 抗癫痫治疗中多数患者实通过长期用药以控制病情，但临床医师需根据血药浓度监测，结合临床症状，制定合理的给药方案，控制血药浓度在有效范围内。本实验建立的方法操作简便、快速，结果可靠，且重现性好，可用于临床常规检查。 参考文献： 1冯绍文，何小敏，容颖慈等.卡马西平血药浓度监测的临床意义[J].中国实用医药，2009，36（4）：41-42. 2陈新谦，金有豫，汤光.《新编药物学》[M].17版. 北京：人民卫生出版社，2011： 215. 3国家药典委员会编.中华人民共和国临床用药须知化学药盒生物制品卷[S].第1版.北京：中国医药科技出版社，2011：32-35. 4严娟，秦群等.卡马西平、苯妥英钠和苯巴比妥的血药浓度与不良反应及疗效相关性[J]. 中国医院药学杂志，2011，31（7）：580-584. 5郑仁达，洪冰.卡马西平血药浓度监测及应用[J].海峡药学，2010，22（11）：245-246. 6张轶昕，王海良，谢海萍.卡马西平治疗癫血药浓度监测及合理用药[J].实用药物与临床，2010，13（6）：420-425. 7刘超.卡马西平治疗58例癫疒间患者的血药浓度检测[J].中国医药导报，2009，6（11）：132-133. 8黄国平.卡马西平血药浓度监测7例及其分析[J].实用药物与临床，2007，10（5）： 293.