四川医学 年 月第 卷 第 期
论著
细菌半定量培养新法 十二级法 研究报告
杨肇立 周 文 李俊如 李 键 杨锦云 任 萍 陈 旭 黄 静
凉山彝族自治州第一人民医院检验科 四川西昌
摘要 目的 建立开放部位非均质标本细菌半定量培养的新方法 十二级法 方法 采用 十二级法 和传统 四区划线法 即五级法 对 无呼吸道炎症人群 咽拭子及临床患者痰液标本进行细菌半定量培养 从重复性 区分细菌相对数量的细致性及临床诊断符合率等方面予以比较 结果 重复性 十二级法 和 四区划线法 均较差 平均变 和 但前者受操作等因素影响较小 结果差异多在 个档次之内 后者受操作等因素异系数分别为
区分细菌相对数量的细致性 无呼吸道炎症人群 咽拭子的非厌氧菌半定影响明显 同一标本的同种细菌为
溶血性链球菌 奈瑟菌 凝固酶阴性葡萄球菌 杆菌和酵母样真菌的平均携带量分量培养 若用 十二级法 判读 非
和 差别显著 若用 四区划线法 判读 以上各菌却有可能差别不大 诊断符合率 对别为
该菌口咽部正常携带量为 可疑感染于痰培养的机会致病菌 若与涂对中白细胞区域优势菌对应以 十二级法 菌量
与临床确诊加疑诊的符合率 若以其 四区划线法 菌量大于非 菌 判定标准 阳性率 溶血
漏诊较多 二者比较 性链球菌菌量为 可疑感染菌 判定标准 则阳性率仅
结论 十二级法 优于 四区划线法 值得选用 关键词 细菌半定量培养 十二级法 四区划线法
中图分类号 文献标识码 文章编号
细菌学检验标本中 痰液标本多为受到口咽正常菌群污染的自然咳出痰 其可疑感染菌识别困难 笔者拟参考量变到质变原理 从临床患者痰液与正常人群咽拭子内各种细菌数量的相比初中寻求答案 由于痰液是高粘稠性 难以定量吸取的非均质
基金项目 四川省卫生厅科研课题 编号
标本 进行定量培养 采用物理学 化学或生物学方法使之液化均质化又难免损伤其中的部分细菌 且费时费事 一般临床实验室不易实施 故选用半定量法 我室 年使用传统四区划线法
数月 感觉
其对细菌相对数量的判读过于粗略 受操作等因素
四川医学 年 月第 卷 第 期
影响较大 且阳性率低 便建立十二纫法
常规应用 年来 得到友邻医院和进修实习人员认可 文献强调良好的实验室规范 实践 要求必须仔细地选择新的或修改的方法 在常规应用之前对其性能在实验室条件下进行严格和公正的评价
因此 再次研究并报告如下 材料与方法 材料
标本 健康人群 例和无呼吸道炎症的住院患者 例 统称无呼吸道炎症人群 的咽拭子 份 年 月 年 月的h床痰液 份
h床资料 年 月 年 月 住院患者中痰培养可疑感染菌阳性 十二纫法 菌量大于该菌口咽部正常携带平均数量 病历
标准菌株 流感嗜血杆菌 肺炎链球菌
大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌 仪器 新加坡艺思科 二纫生物安全柜 美国
二氧化碳培养箱 美国德灵 自动微生物鉴定及药敏测试系统等
试剂 效期内的贝瑞特公司无菌血琼脂平板及巧克力琼脂平板 阳性复合 型检测板和阴性复合 型检测板等 方法
细菌半定量培养十二纫法 选取标本病理成分
区划线接种 培养 观察 于菌落散在区域计数 个 按各种菌落的相对数量判定结果 若某菌于各个平板均无 为
计数区没有而非计数区可见 或者于计数的 个菌落中仅有 个 为少量
个为 个为 个为 余者类推 纯培养为 菌落分布不匀者 计数 个区域 取平均值 自然咳吐的痰标本 尽可能于用药前采集漱洗口咽部 次后用力从气管深处咳出的第一口痰液 及时送检 接种同时涂片一张 革兰染色 油镜观察 按 全国h床检验操作规程 判定
纫及白细胞区域优势菌 细菌半定量培养四区划线法 即五纫法 选取标本病理成分 四区划线接种 培养 观察菌落 判读各种细菌的数量 若某菌仅见于一区 为 见于一 二区 为 见于一 二 三区 为 四个区皆有 为 四个区皆无 为 标本取送同十二纫法
两法的重复性探索 选取细菌种类较多的痰液标本一份 做一式二十份半定量培养 分别用十二纫法和四区划线法对非
溶血链球菌 奈瑟菌 葡萄球菌
杆菌和微球菌等其它菌作菌落计数 并统计其菌量
分布 均值 标准差及变异系数 十二纫法的 少量 按
计算 口咽部正常携带非厌氧菌的两法半定量比较 无呼吸道炎症人群咽拭子标本 份 分别用十二纫法和四区划线法培养 对各种细菌进行菌落计数 并统计携带率
h床痰液标本的两法培养阳性例率比较 分别用十二纫法和四区划线法培养 对机会致病菌的阳性例率进行比较 十二纫法以痰培养菌量大于该菌口咽部平均正常携带量且与涂片中白细胞区域优势菌对应为阳性 四区划线法以机会致病菌量大于正常菌群代表菌 非 溶血性链球和奈瑟菌 菌量为阳性 细菌半定量培养十二纫法分离菌与h床细菌感染出院诊断的符合率统计 金黄色葡萄球菌和 溶血链球菌等致病菌 不论数量多少 均视为可疑感染菌 肺炎链球菌 流感嗜血杆菌 铜绿假单胞菌 鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌等机会致病菌 用十二纫法的上述标准判断可疑感染菌阳性 查阅并统计分析本院 年 月 月 月住院患者中呼吸道铜绿假单胞菌 鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌阳性患者病历 出院时的感染诊断 由h床医生根据患者症状 体征 病原学检验 影像学检查 抗菌治疗效果等信息 按照相关诊治指南作出 文字确认和 或参考药敏报告治疗有效为确诊 文字否定和 或参考药敏报告治疗无效为否诊 介于二者之间者为疑诊 结 果
十二纫法和四区划线法的重复性比较 非 溶血链球菌 奈瑟菌 葡萄球菌
杆菌和微球菌等其它细菌的菌量 十二纫法分别为
和 四区划线法分别为 和 其平均变异系数 十二纫法为
四区划线法为 离散程度均较大 不过 十二纫法受操作等因素影响相对较小 结果差异大多在 个档次之内 四区划线法受操作等因素影响明显 同一标本的同种细菌如微球菌等 部分平皿仅见于 个区域 而部分平皿可见于 个区域 其半定量值为
无呼吸道炎症人群口咽部非厌氧菌的两法半定量比较 见表
四川医学 年 月第 卷 第 期
表 无呼吸道炎症人群咽拭子标本
份两法培养的部分结果
用于比较的细菌 非 溶血性链球菌凝固酶阴性葡萄球菌
奈瑟菌
杆菌
年 月临床痰液标本表 年 月
份的两法培养阳性例次
携带概率
十二级法平均菌量
四区划线法菌量范围
十二级法四区划线法
葡萄球菌
杆菌酵母样真菌
合 计
者未统计 连续 注 真菌半定量培养 十二级法 单次菌量
次以上阳性才作鉴定及药敏试验并报告 两法阳性率比较
酵母样真菌
十二级法 痰培养阳性与出院时感染诊断的符合率 见表
注 真菌为 例资料 均为念珠菌 均少量 其它菌为 例资料
临床痰液标本的两法培养阳性例率比较 见表
年 月十二级法痰培养阳性患者出院时的感染诊断符合率 表 年 月
位列前三的呼吸道 可疑感染菌 铜绿假单胞菌 鲍曼不动杆菌 肺炎克雷伯菌
菌量
确 诊
菌量
疑 诊
菌量
否诊
且与涂片中白细胞区域优势菌对应为阳性注 十二级法痰培养机会致病菌量 该菌口咽部正常携带量
讨 论
标本质量是影响检验质量的首要因素 对于自然咳出的痰标本 尽可能于用药前采集漱洗口咽部 次后用力自气管深处咳出的第一口痰 强化质量等级和白细胞区域优势菌的常规化染色观察 级标本不退回但如实报告 由医生决定是否复查 出院诊断系医生综合各方面信息 按照现行诊治标准所作出
结果显示十二级法和四区划线法的重复性均不佳 这由痰液的非均质性所决定 十二级法虽貌似繁 等数级 其杂 但经常应用的级别不过
实际应用并不困难 十二级法的等级设置为四区划线 借 用计数 个菌落中目标菌所占十分比法的
记录其菌量 决定了前者区分细菌相对数量的细致性必然优于后者 临床痰标本 份的两法培养发现 四区划线法机会致病菌量 非 溶血性链球菌量者 份 其十二级法菌量却分布较广 者 份 者 份 者 份 者 份 者 份 者 份
也证明了此点 者 份
建立方法的目的在于实际应用 评估方法的优劣也是如此 全国临床检验操作规程 认为 痰中的病原菌不少于属于机会致病菌 与正常菌群同在 在报告时应作说明 对于机会致病菌 一般仅当其数量超过正常菌群时才可报告鉴定结果及其敏感试验结果
非 溶血性链球和奈瑟菌 菌量为可疑感染菌 阳
导致较多假阴性 十二级性率仅
法以痰培养机会致病菌量大于该菌口咽部平均正常携带量且与涂片中白细胞区域优势菌对应为可疑感染 显著高于前者 与临床菌 阳性率
在细菌半定量培养 十二确诊 疑诊的符合率 级法 基础上 课题组坚持进行呼吸道感染病原学诊断意见的探索 年提出酵母样真菌感染的病原学诊断标准
推广试用后效果良好 近期 又探索了呼
吸道铜绿单胞菌 鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌的病原学诊断意见 部分数据见表 论文待发表 可见 十二级法的临床适用性也优于四区划线法
十二级法适合于痰液等开放部位非均质标本的细菌半定量培养 值得选用
参考文献
李影林主编 临床微生物学及检验 北京 人民卫生出版社
杨肇立 周文 郑遥奇 等 健康人群 例口咽部非厌氧菌半定
量调查报告 四川医学
叶应妩 王硫三 中子瑜主编 全国临床检验操作规程 第
版 南京 东南大学出版社
叶应妩 王硫三主编 全国临床检验操作规程 第 版 南京
东南大学出版社
杨肇立 胡酿生 李俊如 等 呼吸道真菌感染病原学标准的探讨
中华检验医学杂志
杨肇立 李俊如 李键 等 呼吸道真菌感染诊疗控制的科研前后
检验医学与临床 比较分析
收稿日期
四区划线法以机会致病菌菌量大于正常菌群代表菌
四川医学 年 月第 卷 第 期
论著
细菌半定量培养新法 十二级法 研究报告
杨肇立 周 文 李俊如 李 键 杨锦云 任 萍 陈 旭 黄 静
凉山彝族自治州第一人民医院检验科 四川西昌
摘要 目的 建立开放部位非均质标本细菌半定量培养的新方法 十二级法 方法 采用 十二级法 和传统 四区划线法 即五级法 对 无呼吸道炎症人群 咽拭子及临床患者痰液标本进行细菌半定量培养 从重复性 区分细菌相对数量的细致性及临床诊断符合率等方面予以比较 结果 重复性 十二级法 和 四区划线法 均较差 平均变 和 但前者受操作等因素影响较小 结果差异多在 个档次之内 后者受操作等因素异系数分别为
区分细菌相对数量的细致性 无呼吸道炎症人群 咽拭子的非厌氧菌半定影响明显 同一标本的同种细菌为
溶血性链球菌 奈瑟菌 凝固酶阴性葡萄球菌 杆菌和酵母样真菌的平均携带量分量培养 若用 十二级法 判读 非
和 差别显著 若用 四区划线法 判读 以上各菌却有可能差别不大 诊断符合率 对别为
该菌口咽部正常携带量为 可疑感染于痰培养的机会致病菌 若与涂对中白细胞区域优势菌对应以 十二级法 菌量
与临床确诊加疑诊的符合率 若以其 四区划线法 菌量大于非 菌 判定标准 阳性率 溶血
漏诊较多 二者比较 性链球菌菌量为 可疑感染菌 判定标准 则阳性率仅
结论 十二级法 优于 四区划线法 值得选用 关键词 细菌半定量培养 十二级法 四区划线法
中图分类号 文献标识码 文章编号
细菌学检验标本中 痰液标本多为受到口咽正常菌群污染的自然咳出痰 其可疑感染菌识别困难 笔者拟参考量变到质变原理 从临床患者痰液与正常人群咽拭子内各种细菌数量的相比初中寻求答案 由于痰液是高粘稠性 难以定量吸取的非均质
基金项目 四川省卫生厅科研课题 编号
标本 进行定量培养 采用物理学 化学或生物学方法使之液化均质化又难免损伤其中的部分细菌 且费时费事 一般临床实验室不易实施 故选用半定量法 我室 年使用传统四区划线法
数月 感觉
其对细菌相对数量的判读过于粗略 受操作等因素
四川医学 年 月第 卷 第 期
影响较大 且阳性率低 便建立十二纫法
常规应用 年来 得到友邻医院和进修实习人员认可 文献强调良好的实验室规范 实践 要求必须仔细地选择新的或修改的方法 在常规应用之前对其性能在实验室条件下进行严格和公正的评价
因此 再次研究并报告如下 材料与方法 材料
标本 健康人群 例和无呼吸道炎症的住院患者 例 统称无呼吸道炎症人群 的咽拭子 份 年 月 年 月的h床痰液 份
h床资料 年 月 年 月 住院患者中痰培养可疑感染菌阳性 十二纫法 菌量大于该菌口咽部正常携带平均数量 病历
标准菌株 流感嗜血杆菌 肺炎链球菌
大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌 仪器 新加坡艺思科 二纫生物安全柜 美国
二氧化碳培养箱 美国德灵 自动微生物鉴定及药敏测试系统等
试剂 效期内的贝瑞特公司无菌血琼脂平板及巧克力琼脂平板 阳性复合 型检测板和阴性复合 型检测板等 方法
细菌半定量培养十二纫法 选取标本病理成分
区划线接种 培养 观察 于菌落散在区域计数 个 按各种菌落的相对数量判定结果 若某菌于各个平板均无 为
计数区没有而非计数区可见 或者于计数的 个菌落中仅有 个 为少量
个为 个为 个为 余者类推 纯培养为 菌落分布不匀者 计数 个区域 取平均值 自然咳吐的痰标本 尽可能于用药前采集漱洗口咽部 次后用力从气管深处咳出的第一口痰液 及时送检 接种同时涂片一张 革兰染色 油镜观察 按 全国h床检验操作规程 判定
纫及白细胞区域优势菌 细菌半定量培养四区划线法 即五纫法 选取标本病理成分 四区划线接种 培养 观察菌落 判读各种细菌的数量 若某菌仅见于一区 为 见于一 二区 为 见于一 二 三区 为 四个区皆有 为 四个区皆无 为 标本取送同十二纫法
两法的重复性探索 选取细菌种类较多的痰液标本一份 做一式二十份半定量培养 分别用十二纫法和四区划线法对非
溶血链球菌 奈瑟菌 葡萄球菌
杆菌和微球菌等其它菌作菌落计数 并统计其菌量
分布 均值 标准差及变异系数 十二纫法的 少量 按
计算 口咽部正常携带非厌氧菌的两法半定量比较 无呼吸道炎症人群咽拭子标本 份 分别用十二纫法和四区划线法培养 对各种细菌进行菌落计数 并统计携带率
h床痰液标本的两法培养阳性例率比较 分别用十二纫法和四区划线法培养 对机会致病菌的阳性例率进行比较 十二纫法以痰培养菌量大于该菌口咽部平均正常携带量且与涂片中白细胞区域优势菌对应为阳性 四区划线法以机会致病菌量大于正常菌群代表菌 非 溶血性链球和奈瑟菌 菌量为阳性 细菌半定量培养十二纫法分离菌与h床细菌感染出院诊断的符合率统计 金黄色葡萄球菌和 溶血链球菌等致病菌 不论数量多少 均视为可疑感染菌 肺炎链球菌 流感嗜血杆菌 铜绿假单胞菌 鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌等机会致病菌 用十二纫法的上述标准判断可疑感染菌阳性 查阅并统计分析本院 年 月 月 月住院患者中呼吸道铜绿假单胞菌 鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌阳性患者病历 出院时的感染诊断 由h床医生根据患者症状 体征 病原学检验 影像学检查 抗菌治疗效果等信息 按照相关诊治指南作出 文字确认和 或参考药敏报告治疗有效为确诊 文字否定和 或参考药敏报告治疗无效为否诊 介于二者之间者为疑诊 结 果
十二纫法和四区划线法的重复性比较 非 溶血链球菌 奈瑟菌 葡萄球菌
杆菌和微球菌等其它细菌的菌量 十二纫法分别为
和 四区划线法分别为 和 其平均变异系数 十二纫法为
四区划线法为 离散程度均较大 不过 十二纫法受操作等因素影响相对较小 结果差异大多在 个档次之内 四区划线法受操作等因素影响明显 同一标本的同种细菌如微球菌等 部分平皿仅见于 个区域 而部分平皿可见于 个区域 其半定量值为
无呼吸道炎症人群口咽部非厌氧菌的两法半定量比较 见表
四川医学 年 月第 卷 第 期
表 无呼吸道炎症人群咽拭子标本
份两法培养的部分结果
用于比较的细菌 非 溶血性链球菌凝固酶阴性葡萄球菌
奈瑟菌
杆菌
年 月临床痰液标本表 年 月
份的两法培养阳性例次
携带概率
十二级法平均菌量
四区划线法菌量范围
十二级法四区划线法
葡萄球菌
杆菌酵母样真菌
合 计
者未统计 连续 注 真菌半定量培养 十二级法 单次菌量
次以上阳性才作鉴定及药敏试验并报告 两法阳性率比较
酵母样真菌
十二级法 痰培养阳性与出院时感染诊断的符合率 见表
注 真菌为 例资料 均为念珠菌 均少量 其它菌为 例资料
临床痰液标本的两法培养阳性例率比较 见表
年 月十二级法痰培养阳性患者出院时的感染诊断符合率 表 年 月
位列前三的呼吸道 可疑感染菌 铜绿假单胞菌 鲍曼不动杆菌 肺炎克雷伯菌
菌量
确 诊
菌量
疑 诊
菌量
否诊
且与涂片中白细胞区域优势菌对应为阳性注 十二级法痰培养机会致病菌量 该菌口咽部正常携带量
讨 论
标本质量是影响检验质量的首要因素 对于自然咳出的痰标本 尽可能于用药前采集漱洗口咽部 次后用力自气管深处咳出的第一口痰 强化质量等级和白细胞区域优势菌的常规化染色观察 级标本不退回但如实报告 由医生决定是否复查 出院诊断系医生综合各方面信息 按照现行诊治标准所作出
结果显示十二级法和四区划线法的重复性均不佳 这由痰液的非均质性所决定 十二级法虽貌似繁 等数级 其杂 但经常应用的级别不过
实际应用并不困难 十二级法的等级设置为四区划线 借 用计数 个菌落中目标菌所占十分比法的
记录其菌量 决定了前者区分细菌相对数量的细致性必然优于后者 临床痰标本 份的两法培养发现 四区划线法机会致病菌量 非 溶血性链球菌量者 份 其十二级法菌量却分布较广 者 份 者 份 者 份 者 份 者 份 者 份
也证明了此点 者 份
建立方法的目的在于实际应用 评估方法的优劣也是如此 全国临床检验操作规程 认为 痰中的病原菌不少于属于机会致病菌 与正常菌群同在 在报告时应作说明 对于机会致病菌 一般仅当其数量超过正常菌群时才可报告鉴定结果及其敏感试验结果
非 溶血性链球和奈瑟菌 菌量为可疑感染菌 阳
导致较多假阴性 十二级性率仅
法以痰培养机会致病菌量大于该菌口咽部平均正常携带量且与涂片中白细胞区域优势菌对应为可疑感染 显著高于前者 与临床菌 阳性率
在细菌半定量培养 十二确诊 疑诊的符合率 级法 基础上 课题组坚持进行呼吸道感染病原学诊断意见的探索 年提出酵母样真菌感染的病原学诊断标准
推广试用后效果良好 近期 又探索了呼
吸道铜绿单胞菌 鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌的病原学诊断意见 部分数据见表 论文待发表 可见 十二级法的临床适用性也优于四区划线法
十二级法适合于痰液等开放部位非均质标本的细菌半定量培养 值得选用
参考文献
李影林主编 临床微生物学及检验 北京 人民卫生出版社
杨肇立 周文 郑遥奇 等 健康人群 例口咽部非厌氧菌半定
量调查报告 四川医学
叶应妩 王硫三 中子瑜主编 全国临床检验操作规程 第
版 南京 东南大学出版社
叶应妩 王硫三主编 全国临床检验操作规程 第 版 南京
东南大学出版社
杨肇立 胡酿生 李俊如 等 呼吸道真菌感染病原学标准的探讨
中华检验医学杂志
杨肇立 李俊如 李键 等 呼吸道真菌感染诊疗控制的科研前后
检验医学与临床 比较分析
收稿日期
四区划线法以机会致病菌菌量大于正常菌群代表菌