实 验 技 术 与 管 理第３ＩＳＳＮ１００２－４９５６１卷 第７期 ２０１４年７月 ＣＮ１１－２０３４ＴＥｘｅｒｉｍｅｎｔａｌＴｅｃｈｎｏｌｏａｎｄＭａｎａｅｍｅｎｔ ｐｇｙｇＶｏｌ．３１ Ｎｏ．７ Ｊｕｌ．２０１４
蔗糖酶米氏常数测定实验方法的改进
吴梅芬，王晓岗，许新华
（）同济大学化学系，上海 ２０００９２
摘 要：介绍了蔗糖酶米氏常数测定的新方法，采用旋光仪测定蔗糖在蔗糖酶作用下分解为果糖和葡萄糖过通过测定一系列不同初始浓度蔗糖溶液转化过程的动力学曲线，采用计算机软件处程中溶液旋光度的变化，
理数据，得到蔗糖酶的米氏常数值。采用成熟的物理化学实验技术，原理清晰，配合计算机数据拟合方法，实快速。用于该校材料、化学等专业本科物理化学实验教学，取得良好的教学效果。验方法简便、
关键词：蔗糖酶；米氏常数；旋光度；教学实验
（）中图分类号：Ｏ６３３ 文献标志码：Ｂ 文章编号：１００２４９５６２０１４７－００４３－０３－－
Ｉｍｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｍｅａｓｕｒｉｎ ｐｐｇ
ｃｏｎｓｔａｎｔｏｆｉｎｖｅｒｔａｓｅＭｉｃｈａｅｌｉｓ
，Ｗ，ＷｕＭｅｉｆｅｎａｎＸｉａｏａｎＸｕＸｉｎｈｕａ ｇｇｇ
（，，）ＤｅａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒＴｏｎｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔＳｈａｎｈａｉ２０００９２，Ｃｈｉｎａ ｐｙｇｊｙｇ
：ＡＡｂｓｔｒａｃｔｎｅｗｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｍｅａｓｕｒｉｎＭｉｃｈａｅｌｉｓｃｏｎｓｔａｎｔｏｆｉｎｖｅｒｔａｓｅｉｓｄｅｓｃｒｉｂｅｄ．Ｔｈｅ ｐｇ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｃａｎｅｓｕｃｒｏｓｅｔｏｌｕｃｏｓｅａｎｄｆｒｕｃｔｏｓｅｉｓｃａｔａｌｚｅｄｂａｃｒｕｄｅｅｘｔｒａｃｔｆｒｏｍｔｈｅｔｈｅａｕｔｏｌｓｉｓｏｆａｄｒｉｅｄ － ｇｙｙｙ ，ｅａｓｔａｎｄｔｈｅａｎｌｅｏｆｒｏｔａｔｉｏｎｏｆｏｌａｒｉｚｅｄｌｉｈｔａｓｓｉｎｔｈｒｏｕｈｔｈｅｓｏｌｕｔｉｏｎｉｓｍｅａｓｕｒｅｄｗｉｔｈａｂａｋｅｒ＇ｓ ｙｐｐｇｇｇｇ ｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ．Ｔｈｅｋｉｎｅｔｉｃｃｕｒｖｅｓｏｆａｓｅｒｉｅｓｏｆｓｏｌｕｔｉｏｎｓｗｉｔｈｖａｒｉｅｄｉｎｉｔｉａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｃａｎｅｓｕｃｒｏｓｅａｒｅ ｐ
ｄａｔａａｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｃｏｍｕｔｅｒｓｏｆｔｗａｒｅａｎｄｔｈｅＭｉｃｈａｅｌｉｓｃｏｎｓｔａｎｔｏｆｉｎｖｅｒｔａｓｅｉｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．ｉｎｖｅｓｔｉａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｐｇ，ｈｓｉｃａｌＢｍｅａｎｓｏｆｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｔｅｃｈｎｏｌｏｏｆｃｈｅｍｉｓｔｒａｎｄｃｏｍｕｔｅｒｄａｔａｆｉｔｔｉｎｔｈｅｅｎｚｍｅ －ｐｙｙｐｇｙｙｐｇｙ ｕｉｃｋ．Ｔｈｅｈｓｉｃａｌｃａｔａｌｓｉｓｅｘｅｒｉｍｅｎｔｂｅｃｏｍｅｓｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔａｎｄｅｘｅｒｉｍｅｎｔｉｓａｌｉｅｄｉｎｔｈｅｌａｂｏｒａｔｏｒ ｑｐｙｙｐｐｐｐｙ ，ｃｈｅｍｉｓｔｒｏｏｄｃｕｒｒｉｃｕｌｕｍｆｏｒｔｈｅｕｎｄｅｒｒａｄｕａｔｅｓｍａｏｒｅｄｉｎｍａｔｅｒｉａｌａｎｄｃｈｅｍｉｓｔｒｉｎｗｈｉｃｈｅｆｆｅｃｔｓｏｆ ｙｇｊｙｇ ｔｅａｃｈｉｎａｒｅａｃｈｉｅｖｅｄ． ｇ
：；Ｍ；；Ｋｅｗｏｒｄｓｉｎｖｅｒｔａｓｅｉｃｈａｅｌｉｓｃｏｎｓｔａｎｔａｎｌｅｏｆｒｏｔａｔｉｏｎｔｅａｃｈｉｎｅｘｅｒｉｍｅｎｔ ｇｇｐｙ
酶催化反应动力学是生物化学和物理化学反应动
］１３－
。酶催化反应机理与均相（力学的重要内容［多相）催化反应机理有显著差别，通过实验比较两类反应动力学行为的差异，对学生掌握化学反应动力学基本理论和方法非常有益。蔗糖转化反应实验是经典的化学反应动力学实验之一。该反应可以用酸均相催化完也可以用蔗糖酶催化完成。在实验教学中，前者常成，
收稿日期：２０１３－１１－０４２０１３－１２－２６ 修改日期：
）；基金项目：上海市高校本科重点教改项目（同济大学第六期２００３ＴＪ０４
）精品实验项目建设（１３８０１０４０６７
，作者简介：吴梅芬（女，上海，博士，高级工程师，研究方向为物１９７０—）
理化学
：Ｅ－ｍａｉｌｗｕｍｆｔｏｎｉ．ｅｄｕ．ｃｎ＠ｇｊ
，通信作者：许新华（男，浙江黄岩，博士，讲师，从事物理化学及１９６７—）
实验的教学工作．
通信作者：ｘｘｈ０１＠ｔｏｎｉ．ｅｄｕ．ｃｎｇｊ
采用测定溶液旋光度的方法，连续测定反应的动力学
］４５－
；曲线，是典型的物理化学实验方法［后者则采用化
学淬灭法终止反应，取样分析获得初始反应速率值，是
］６７－
。由于实验方法的差异典型的生物化学实验方法［
性，学生在进行这两类实验时很难相互比较，无法将两因而不能完整理解和掌握化学反应者有机联系起来，动力学的相关理论。
１ 实验原理
本文研究开发了一种新的蔗糖酶催化蔗糖转化反应的实验体系，采用与均相酸催化蔗糖转化反应完全相同的实验技术和实验方法，连续测量蔗糖溶液在蔗通过数据拟合推算糖酶催化作用下的旋光度的变化，
反应的初始速率，然后用米氏方程求算相关酶促反应参数。
根据化学反应动力学理论，酶催化反应机理是
Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ和Ｍｅｎｔｅｎ应用酶反应过程中形成中间络合
］８９－
。蔗糖酶（物的学说导出的米氏方程［与底物蔗Ｅ）），糖（先形成中间化合物（然后中间化合物再进ＳＥＳ），和果糖（并释放出酶一步分解为产物葡萄糖（Ｇ）Ｆ）（。机理如下：Ｅ）
Ｓ＋Ｅ幑幐 →Ｇ＋Ｆ＋Ｅ
ｋ１－ｋ１
ｃＳ
／用０对ｃ作图得一直线，直线斜率为１截距为ｒＳｍ、０
ｒ０
由此求得米氏常数ＫＭ和最大速率ｒＫＭ／ｒｍ，ｍ值。
该实验方法简便、实用，物理化学概念清晰明了，实验技术也是学生熟练掌握的旋光度测定法，实验数据与酸催化蔗糖转化反应的实验结果对照性很强，有助于学生通过对比更好地理解掌握酶催化反应的特点和规律。
（）１
酶促反应速率 当反应温度和酶的总浓度确定时，
可以表示为
ｄｃｒｃＳｍＳ
（）ｒ＝－２＝
ｄｔＫＭ＋ｃＳ
式中ＫＭ为米氏常数，该方程称为米氏ｒｍ为最大速率，方程。
采用旋光度法测定反应体系中蔗糖浓度时，反应体系的旋光度与蔗糖浓度的关系为
２ 实验
２．１ 实验仪器及试剂
、电子天平、恒温水浴、锥形瓶（移液管１００ｍＬ）（、离心机、离心管、超级５ｍＬ、１０ｍＬ、２５ｍＬ）Ｈ计、ｐ
、恒温槽、旋光仪、旋光管（带夹套）玻璃漏斗、定性滤）、）、烘箱、鲜酵母、蔗糖（果糖（葡萄糖纸、Ａ．Ｒ．Ａ．Ｒ．（）、）、）、）、醋酸钠（甲苯（醋酸（Ａ．Ｒ．Ａ．Ｒ．Ａ．Ｒ．Ａ．Ｒ．
、具塞碘量瓶（１００ｍＬ）２．２ 实验步骤
１２］
（）蔗糖酶的制取［：取鲜酵母２１０ｇ于１００ｍＬ三角瓶中，加入１．搅拌１６ｇ醋酸钠，５～２０ｍｉｎ后使团块液化，再加３ｍ混和后摇动１放在Ｌ甲苯，０ｍｉｎ，恒温水浴中３取出后加入３．７℃保温６０ｈ左右；２
３
／的醋酸和１使ｐＨ值在４．４ｍｏｌｄｍ００ｍＬ水，５ｍＬ、
／左右；将混合物以３离０００ｒｍｉｎ的速度离心３０ｍｉｎ，
ｔ（）３Ｓ
αα∞００－
式中! ｔ为反应ｔ时刻反应体系的旋光度，! ０为反应初
ｃＳ＝
始时刻反应体系的旋光度，! " 为完全反应时反应体系的旋光度，为蔗糖的初始浓度。ｃＳ０
∞，ｔ，令θ＝则ｃ代入米氏方程中得到ｃθＳ＝Ｓ０
αα∞０－
ｒｃθｍＳｄｃＳ０·ｒ＝＝－ｃ＝Ｓ０
ｄｔｄｔＫＭ＋θｃＳ０
积分后得到
（）４
ｃＳＭ·０
（）（）ｔ＝１－θｌｎ５θ－ｒｒｍｍ
按上式直接拟合实验测定的ｔ 从原理上说，－θ数据就可以得到酶促反应参数ＫＭ和ｒ由于实ｍ。但是，验数据的不完备性、波动性以及酶制剂的质量问题，
心后形成３层，取中层的黄色液体；再以同样速度离心所得澄清的黄色液体即为蔗糖酶粗品；将此蔗３０ｍｉｎ，
糖酶用ｐ过滤后冷冻Ｈ＝４．６的缓冲溶液稀释１０倍，保存。
）蔗糖溶液初始旋光度（（! ０）标准曲线测定：准２确称取５溶解于２得１．３ｇ蔗糖溶液，５０ｍＬ容量瓶中，
３
／到０．的蔗糖溶液，分别用蒸馏水稀释配制６ｍｏｌｄｍ３
／的蔗糖溶液于５０．０４～０．３ｍｏｌｄｍ０ｍＬ容量瓶中，
ｔ－θ关系式中的拟合参数可能无法与上式中相关项的
定义一一对应。一般地，可以把实验测定的ｔ－θ关系表达为如下的普遍形式：
）（）ｔ＝Ａ（１－θｌｎ６θ－Ｂ经过数据拟合，可以得到拟合参数Ａ、并计算出蔗Ｂ，糖初始浓度为ｃ时的初始反应速率为Ｓ０
分别在３５℃下恒温１０ｍｉｎ后测定各溶液的初始旋光度! ０。
（）蔗糖完全分解后体系终止旋光度（! " ）标准曲３
用葡萄糖和果糖按摩尔比为１∶１配制０线测定：．０４～
３／的蔗糖水解最终模拟产物，分别在３０．３ｍｏｌｄｍ５℃下
恒温１分别将浓度０ｍｉｎ后测定各体系终止旋光度! " ；
ｃＳ０
（）７
Ａ＋Ｂ
配制一系列不同初始浓度ｃ的蔗糖溶 实验时，Ｓ０
ｒ０＝
液，并测得其α０和α∞。在相同实验温度和酶浓度条件下，分别测定每个溶液的反应时间ｔ和旋光度αｔ数据，并计算出θ值。拟合ｔＢ，－θ关系得到拟合参数Ａ、并计算每个溶液的初始反应速率ｒ由此得到一系列０，代入米氏方程中。根据Ｈｃｒａｎｅｓｏｏｌｆ作－－ＷＳ０数据，０
］１０１１－
，米氏方程可以变形为图法［
与得到的旋光度! ０、! " 列表并作图，然后拟合得到初始浓度与旋光度以及反应完全后浓度与最终旋光度的拟合方程。
（）蔗糖酶催化过程中不同蔗糖浓度体系的旋光４
３
／度变化值测定：取０．的蔗糖２６ｍｏｌｄｍ５ｍＬ溶液于再加入２５０ｍＬ容量瓶中，２ｍＬ、Ｈ＝４．６的缓冲溶ｐ
液，加入１再稀释至刻度线，得到０ｍＬ自制粗蔗糖酶，
３
／蔗糖浓度为０．的蔗糖酶催化反应溶液；移３ｍｏｌｄｍ
ｃＳＭ０
＝＋Ｓ０
ｒｒｒ０ｍｍ
（）８
入带夹套旋光管，在３５℃恒温条件下测定溶液旋光度随时间ｔ的变化! ｔ；然后采用同样的方法，分别取０．６
３
／的蔗糖溶液１ｄｍ２．５ｍＬ、１０ｍＬ、７ｍＬ、５ｍＬ和ｍｏｌ
３
／配制得到浓度为０．的蔗糖４ｍＬ，０４８～０．１５ｍｏｌｄｍ
表１ 不同初始浓度蔗糖溶液的初始反应速率及拟合参数
ｃｓ
０·ｍｏｌｄｍ－３
０．３０ ０．１５ ０．１２ ０．０８４ ０．０６ ０．０４８
拟合参数／Ａｓ
／Ｂｓ
４
ｒ１００#
－３－１·ｄｍｏｌｍ·ｓ
ｃｒＳ／０
０
－１ｓ
１６９３．２９６５．４０ ８ ７１９．２５２７．４９ ６ ５３７．７１４５．５５ ５ ５００．９１４２．３９ ４ １３０．９３５１．８１ ５ １６２．０８３５．２５ ４
１．１７２ １．１１４ １．１０８ ０．８９０ ０．８７９ ０．８０４
２５５８．６９１３４６．７４１０８３．２６９４３．３６８２．７４５９７．３２
酶蔗糖反应液，并分别测定其! ｔ。
２．３ 数据记录与处理
（）蔗糖溶液浓度ｃ! " 关系。采用蔗糖配１ｓ与! ０、制一系列标准溶液，并测定其旋光度! ０；采用葡萄糖并测定其旋光与果糖配制成１∶１的一系列标准浓度，度! " ，并将浓度与对应的旋光度作图，得到直线的线如图１所示
。性很好结果，
拟合直线，直线斜率为８） 将上述数据采用式（
／在纵轴上截距为ＫＭ／ｒ直线延伸于横轴交点１ｒｍ，ｍ，。实验测得３为$ＫＭ（见图３）５℃时本实验使用的粗
３
／，最大速率制蔗糖酶的米氏常数ＫＭ＝０．０２９ｍｏｌｄｍ］
－４３１２１３ －
／（·），。与文献值相符［ｒ１．３０#１０ｍｏｌｄｍｓｍ＝
图１ 蔗糖溶液浓度ｃ! " 值关系曲线（３５℃）ｓ与! ０、
３
（）在３／的蔗糖溶２５℃恒温下测定０．３ｍｏｌｄｍ液在蔗糖酶作用下，溶液的! ｔ～ｔ的关系数据。以θ为
用Ｏ作横坐标，ｔ为纵坐标作图，ｒｉｉｎ软件按方程（６）ｇ）
。得到拟合参数Ａ、见图２非线性拟合，Ｂ值（
图３ Ｈａｎｅｓｏｏｌｆ作图法计算米氏常数－Ｗ
３ 结果与讨论
本实验采用旋光仪对酶催化蔗糖转化反应体系中溶液的旋光度进行连续测定，使用的实验仪器与方法有利于学生将传统同酸催化蔗糖转化反应实验类似，
物理化学实验与生物化学实验的概念、方法和技术进行对比，加深对酶催化反应特点的认识。本实验适用于粗制蔗糖酶作为催化剂的酶催化反应动力学研究，所采用的数据处理方法能够有效消除干扰因素（如：酶制剂不纯等）对实验结果的影响，使用常规的物理化学仪器，用比较严密的实验方法获得酶催化反应的初始
图２ 蔗糖酶催化过程中旋光度随时间变化关系
反应速率数据，比较正确地描述了酶催化反应动力学并得到了与文献报道相近的动力学参数。方程，
本实验方法简便、准确、适用于大规模本科生物理化学实验教学，实验所使用的试剂和仪器价廉、易得、安全，有效填补了常规物理化学实验中酶催化动力学
（下转第４９页）
按同样方法作图计算得到一系列不同蔗糖初始浓度ｃ对应的Ａ、并列于表１中。按方程（计算Ｂ值，７）ｓ０每个ｃ对应的初始反应速率ｒｓ０值。０
表１ 实测数据表
／℃温度ｔ２
４０ ５０ ６０ ７０ ８０ ９０ １００ １２０
计数器读数Ｎ
１２ ２２ ３２ ４２ ５２ ６２ ７２ ９２
／ｍｍδ０．０６ ０．１１ ０．１６ ０．２１ ０．２６ ０．３１ ０．３６ ０．４６
６／℃０α×１
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１６．６１６．５１６．６１６．６１６．５１６．６１６．６１６．６
５ 结论
从以上测量的数据可知，铜在室温下ｌ＝３００ｍｍ下、其伸长量δ为０．ｔ在１２～９２℃时，０６～０．４６Δ
对应的脉冲个数为１ｍｍ，２～９２个。该实验装置测得的铜的线胀系数为α＝１准确值为α＝６．６×１０℃，
－６
两个值比较，误差很小。测量结果表１６．７×１０℃，
明，采用光栅尺测金属棒随温度变化而产生的长度微
－６
在操作上更为简便，小变化量和恒温控制法是可行的，
测量的物理量减少，测量的误差较小，测量结果较准确。该方法还可以作为高年级学生的设计性实验内容，以提高学生的实际应用能力。
櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍（上接第４５页）
实验项目的缺失，使学生获得更全面的物理化学实验训练，加深对物理化学基本原理和方法的理解和掌握。该实验体系在我校化学、材料等专业的实验教学中取得了良好的教学效果。）参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
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２７２９．－
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（，，）ＤｅａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒＴｏｎｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔＳｈａｎｈａｉ２０００９２，Ｃｈｉｎａ ｐｙｇｊｙｇ
：ＡＡｂｓｔｒａｃｔｎｅｗｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｍｅａｓｕｒｉｎＭｉｃｈａｅｌｉｓｃｏｎｓｔａｎｔｏｆｉｎｖｅｒｔａｓｅｉｓｄｅｓｃｒｉｂｅｄ．Ｔｈｅ ｐｇ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｃａｎｅｓｕｃｒｏｓｅｔｏｌｕｃｏｓｅａｎｄｆｒｕｃｔｏｓｅｉｓｃａｔａｌｚｅｄｂａｃｒｕｄｅｅｘｔｒａｃｔｆｒｏｍｔｈｅｔｈｅａｕｔｏｌｓｉｓｏｆａｄｒｉｅｄ － ｇｙｙｙ ，ｅａｓｔａｎｄｔｈｅａｎｌｅｏｆｒｏｔａｔｉｏｎｏｆｏｌａｒｉｚｅｄｌｉｈｔａｓｓｉｎｔｈｒｏｕｈｔｈｅｓｏｌｕｔｉｏｎｉｓｍｅａｓｕｒｅｄｗｉｔｈａｂａｋｅｒ＇ｓ ｙｐｐｇｇｇｇ ｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ．Ｔｈｅｋｉｎｅｔｉｃｃｕｒｖｅｓｏｆａｓｅｒｉｅｓｏｆｓｏｌｕｔｉｏｎｓｗｉｔｈｖａｒｉｅｄｉｎｉｔｉａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｃａｎｅｓｕｃｒｏｓｅａｒｅ ｐ
ｄａｔａａｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｃｏｍｕｔｅｒｓｏｆｔｗａｒｅａｎｄｔｈｅＭｉｃｈａｅｌｉｓｃｏｎｓｔａｎｔｏｆｉｎｖｅｒｔａｓｅｉｓｃａｌｃｕｌａｔｅｄ．ｉｎｖｅｓｔｉａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｐｇ，ｈｓｉｃａｌＢｍｅａｎｓｏｆｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｅｘｅｒｉｍｅｎｔａｌｔｅｃｈｎｏｌｏｏｆｃｈｅｍｉｓｔｒａｎｄｃｏｍｕｔｅｒｄａｔａｆｉｔｔｉｎｔｈｅｅｎｚｍｅ －ｐｙｙｐｇｙｙｐｇｙ ｕｉｃｋ．Ｔｈｅｈｓｉｃａｌｃａｔａｌｓｉｓｅｘｅｒｉｍｅｎｔｂｅｃｏｍｅｓｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔａｎｄｅｘｅｒｉｍｅｎｔｉｓａｌｉｅｄｉｎｔｈｅｌａｂｏｒａｔｏｒ ｑｐｙｙｐｐｐｐｙ ，ｃｈｅｍｉｓｔｒｏｏｄｃｕｒｒｉｃｕｌｕｍｆｏｒｔｈｅｕｎｄｅｒｒａｄｕａｔｅｓｍａｏｒｅｄｉｎｍａｔｅｒｉａｌａｎｄｃｈｅｍｉｓｔｒｉｎｗｈｉｃｈｅｆｆｅｃｔｓｏｆ ｙｇｊｙｇ ｔｅａｃｈｉｎａｒｅａｃｈｉｅｖｅｄ． ｇ
：；Ｍ；；Ｋｅｗｏｒｄｓｉｎｖｅｒｔａｓｅｉｃｈａｅｌｉｓｃｏｎｓｔａｎｔａｎｌｅｏｆｒｏｔａｔｉｏｎｔｅａｃｈｉｎｅｘｅｒｉｍｅｎｔ ｇｇｐｙ
酶催化反应动力学是生物化学和物理化学反应动
］１３－
。酶催化反应机理与均相（力学的重要内容［多相）催化反应机理有显著差别，通过实验比较两类反应动力学行为的差异，对学生掌握化学反应动力学基本理论和方法非常有益。蔗糖转化反应实验是经典的化学反应动力学实验之一。该反应可以用酸均相催化完也可以用蔗糖酶催化完成。在实验教学中，前者常成，
收稿日期：２０１３－１１－０４２０１３－１２－２６ 修改日期：
）；基金项目：上海市高校本科重点教改项目（同济大学第六期２００３ＴＪ０４
）精品实验项目建设（１３８０１０４０６７
，作者简介：吴梅芬（女，上海，博士，高级工程师，研究方向为物１９７０—）
理化学
：Ｅ－ｍａｉｌｗｕｍｆｔｏｎｉ．ｅｄｕ．ｃｎ＠ｇｊ
，通信作者：许新华（男，浙江黄岩，博士，讲师，从事物理化学及１９６７—）
实验的教学工作．
通信作者：ｘｘｈ０１＠ｔｏｎｉ．ｅｄｕ．ｃｎｇｊ
采用测定溶液旋光度的方法，连续测定反应的动力学
］４５－
；曲线，是典型的物理化学实验方法［后者则采用化
学淬灭法终止反应，取样分析获得初始反应速率值，是
］６７－
。由于实验方法的差异典型的生物化学实验方法［
性，学生在进行这两类实验时很难相互比较，无法将两因而不能完整理解和掌握化学反应者有机联系起来，动力学的相关理论。
１ 实验原理
本文研究开发了一种新的蔗糖酶催化蔗糖转化反应的实验体系，采用与均相酸催化蔗糖转化反应完全相同的实验技术和实验方法，连续测量蔗糖溶液在蔗通过数据拟合推算糖酶催化作用下的旋光度的变化，
反应的初始速率，然后用米氏方程求算相关酶促反应参数。
根据化学反应动力学理论，酶催化反应机理是
Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ和Ｍｅｎｔｅｎ应用酶反应过程中形成中间络合
］８９－
。蔗糖酶（物的学说导出的米氏方程［与底物蔗Ｅ）），糖（先形成中间化合物（然后中间化合物再进ＳＥＳ），和果糖（并释放出酶一步分解为产物葡萄糖（Ｇ）Ｆ）（。机理如下：Ｅ）
Ｓ＋Ｅ幑幐 →Ｇ＋Ｆ＋Ｅ
ｋ１－ｋ１
ｃＳ
／用０对ｃ作图得一直线，直线斜率为１截距为ｒＳｍ、０
ｒ０
由此求得米氏常数ＫＭ和最大速率ｒＫＭ／ｒｍ，ｍ值。
该实验方法简便、实用，物理化学概念清晰明了，实验技术也是学生熟练掌握的旋光度测定法，实验数据与酸催化蔗糖转化反应的实验结果对照性很强，有助于学生通过对比更好地理解掌握酶催化反应的特点和规律。
（）１
酶促反应速率 当反应温度和酶的总浓度确定时，
可以表示为
ｄｃｒｃＳｍＳ
（）ｒ＝－２＝
ｄｔＫＭ＋ｃＳ
式中ＫＭ为米氏常数，该方程称为米氏ｒｍ为最大速率，方程。
采用旋光度法测定反应体系中蔗糖浓度时，反应体系的旋光度与蔗糖浓度的关系为
２ 实验
２．１ 实验仪器及试剂
、电子天平、恒温水浴、锥形瓶（移液管１００ｍＬ）（、离心机、离心管、超级５ｍＬ、１０ｍＬ、２５ｍＬ）Ｈ计、ｐ
、恒温槽、旋光仪、旋光管（带夹套）玻璃漏斗、定性滤）、）、烘箱、鲜酵母、蔗糖（果糖（葡萄糖纸、Ａ．Ｒ．Ａ．Ｒ．（）、）、）、）、醋酸钠（甲苯（醋酸（Ａ．Ｒ．Ａ．Ｒ．Ａ．Ｒ．Ａ．Ｒ．
、具塞碘量瓶（１００ｍＬ）２．２ 实验步骤
１２］
（）蔗糖酶的制取［：取鲜酵母２１０ｇ于１００ｍＬ三角瓶中，加入１．搅拌１６ｇ醋酸钠，５～２０ｍｉｎ后使团块液化，再加３ｍ混和后摇动１放在Ｌ甲苯，０ｍｉｎ，恒温水浴中３取出后加入３．７℃保温６０ｈ左右；２
３
／的醋酸和１使ｐＨ值在４．４ｍｏｌｄｍ００ｍＬ水，５ｍＬ、
／左右；将混合物以３离０００ｒｍｉｎ的速度离心３０ｍｉｎ，
ｔ（）３Ｓ
αα∞００－
式中! ｔ为反应ｔ时刻反应体系的旋光度，! ０为反应初
ｃＳ＝
始时刻反应体系的旋光度，! " 为完全反应时反应体系的旋光度，为蔗糖的初始浓度。ｃＳ０
∞，ｔ，令θ＝则ｃ代入米氏方程中得到ｃθＳ＝Ｓ０
αα∞０－
ｒｃθｍＳｄｃＳ０·ｒ＝＝－ｃ＝Ｓ０
ｄｔｄｔＫＭ＋θｃＳ０
积分后得到
（）４
ｃＳＭ·０
（）（）ｔ＝１－θｌｎ５θ－ｒｒｍｍ
按上式直接拟合实验测定的ｔ 从原理上说，－θ数据就可以得到酶促反应参数ＫＭ和ｒ由于实ｍ。但是，验数据的不完备性、波动性以及酶制剂的质量问题，
心后形成３层，取中层的黄色液体；再以同样速度离心所得澄清的黄色液体即为蔗糖酶粗品；将此蔗３０ｍｉｎ，
糖酶用ｐ过滤后冷冻Ｈ＝４．６的缓冲溶液稀释１０倍，保存。
）蔗糖溶液初始旋光度（（! ０）标准曲线测定：准２确称取５溶解于２得１．３ｇ蔗糖溶液，５０ｍＬ容量瓶中，
３
／到０．的蔗糖溶液，分别用蒸馏水稀释配制６ｍｏｌｄｍ３
／的蔗糖溶液于５０．０４～０．３ｍｏｌｄｍ０ｍＬ容量瓶中，
ｔ－θ关系式中的拟合参数可能无法与上式中相关项的
定义一一对应。一般地，可以把实验测定的ｔ－θ关系表达为如下的普遍形式：
）（）ｔ＝Ａ（１－θｌｎ６θ－Ｂ经过数据拟合，可以得到拟合参数Ａ、并计算出蔗Ｂ，糖初始浓度为ｃ时的初始反应速率为Ｓ０
分别在３５℃下恒温１０ｍｉｎ后测定各溶液的初始旋光度! ０。
（）蔗糖完全分解后体系终止旋光度（! " ）标准曲３
用葡萄糖和果糖按摩尔比为１∶１配制０线测定：．０４～
３／的蔗糖水解最终模拟产物，分别在３０．３ｍｏｌｄｍ５℃下
恒温１分别将浓度０ｍｉｎ后测定各体系终止旋光度! " ；
ｃＳ０
（）７
Ａ＋Ｂ
配制一系列不同初始浓度ｃ的蔗糖溶 实验时，Ｓ０
ｒ０＝
液，并测得其α０和α∞。在相同实验温度和酶浓度条件下，分别测定每个溶液的反应时间ｔ和旋光度αｔ数据，并计算出θ值。拟合ｔＢ，－θ关系得到拟合参数Ａ、并计算每个溶液的初始反应速率ｒ由此得到一系列０，代入米氏方程中。根据Ｈｃｒａｎｅｓｏｏｌｆ作－－ＷＳ０数据，０
］１０１１－
，米氏方程可以变形为图法［
与得到的旋光度! ０、! " 列表并作图，然后拟合得到初始浓度与旋光度以及反应完全后浓度与最终旋光度的拟合方程。
（）蔗糖酶催化过程中不同蔗糖浓度体系的旋光４
３
／度变化值测定：取０．的蔗糖２６ｍｏｌｄｍ５ｍＬ溶液于再加入２５０ｍＬ容量瓶中，２ｍＬ、Ｈ＝４．６的缓冲溶ｐ
液，加入１再稀释至刻度线，得到０ｍＬ自制粗蔗糖酶，
３
／蔗糖浓度为０．的蔗糖酶催化反应溶液；移３ｍｏｌｄｍ
ｃＳＭ０
＝＋Ｓ０
ｒｒｒ０ｍｍ
（）８
入带夹套旋光管，在３５℃恒温条件下测定溶液旋光度随时间ｔ的变化! ｔ；然后采用同样的方法，分别取０．６
３
／的蔗糖溶液１ｄｍ２．５ｍＬ、１０ｍＬ、７ｍＬ、５ｍＬ和ｍｏｌ
３
／配制得到浓度为０．的蔗糖４ｍＬ，０４８～０．１５ｍｏｌｄｍ
表１ 不同初始浓度蔗糖溶液的初始反应速率及拟合参数
ｃｓ
０·ｍｏｌｄｍ－３
０．３０ ０．１５ ０．１２ ０．０８４ ０．０６ ０．０４８
拟合参数／Ａｓ
／Ｂｓ
４
ｒ１００#
－３－１·ｄｍｏｌｍ·ｓ
ｃｒＳ／０
０
－１ｓ
１６９３．２９６５．４０ ８ ７１９．２５２７．４９ ６ ５３７．７１４５．５５ ５ ５００．９１４２．３９ ４ １３０．９３５１．８１ ５ １６２．０８３５．２５ ４
１．１７２ １．１１４ １．１０８ ０．８９０ ０．８７９ ０．８０４
２５５８．６９１３４６．７４１０８３．２６９４３．３６８２．７４５９７．３２
酶蔗糖反应液，并分别测定其! ｔ。
２．３ 数据记录与处理
（）蔗糖溶液浓度ｃ! " 关系。采用蔗糖配１ｓ与! ０、制一系列标准溶液，并测定其旋光度! ０；采用葡萄糖并测定其旋光与果糖配制成１∶１的一系列标准浓度，度! " ，并将浓度与对应的旋光度作图，得到直线的线如图１所示
。性很好结果，
拟合直线，直线斜率为８） 将上述数据采用式（
／在纵轴上截距为ＫＭ／ｒ直线延伸于横轴交点１ｒｍ，ｍ，。实验测得３为$ＫＭ（见图３）５℃时本实验使用的粗
３
／，最大速率制蔗糖酶的米氏常数ＫＭ＝０．０２９ｍｏｌｄｍ］
－４３１２１３ －
／（·），。与文献值相符［ｒ１．３０#１０ｍｏｌｄｍｓｍ＝
图１ 蔗糖溶液浓度ｃ! " 值关系曲线（３５℃）ｓ与! ０、
３
（）在３／的蔗糖溶２５℃恒温下测定０．３ｍｏｌｄｍ液在蔗糖酶作用下，溶液的! ｔ～ｔ的关系数据。以θ为
用Ｏ作横坐标，ｔ为纵坐标作图，ｒｉｉｎ软件按方程（６）ｇ）
。得到拟合参数Ａ、见图２非线性拟合，Ｂ值（
图３ Ｈａｎｅｓｏｏｌｆ作图法计算米氏常数－Ｗ
３ 结果与讨论
本实验采用旋光仪对酶催化蔗糖转化反应体系中溶液的旋光度进行连续测定，使用的实验仪器与方法有利于学生将传统同酸催化蔗糖转化反应实验类似，
物理化学实验与生物化学实验的概念、方法和技术进行对比，加深对酶催化反应特点的认识。本实验适用于粗制蔗糖酶作为催化剂的酶催化反应动力学研究，所采用的数据处理方法能够有效消除干扰因素（如：酶制剂不纯等）对实验结果的影响，使用常规的物理化学仪器，用比较严密的实验方法获得酶催化反应的初始
图２ 蔗糖酶催化过程中旋光度随时间变化关系
反应速率数据，比较正确地描述了酶催化反应动力学并得到了与文献报道相近的动力学参数。方程，
本实验方法简便、准确、适用于大规模本科生物理化学实验教学，实验所使用的试剂和仪器价廉、易得、安全，有效填补了常规物理化学实验中酶催化动力学
（下转第４９页）
按同样方法作图计算得到一系列不同蔗糖初始浓度ｃ对应的Ａ、并列于表１中。按方程（计算Ｂ值，７）ｓ０每个ｃ对应的初始反应速率ｒｓ０值。０
表１ 实测数据表
／℃温度ｔ２
４０ ５０ ６０ ７０ ８０ ９０ １００ １２０
计数器读数Ｎ
１２ ２２ ３２ ４２ ５２ ６２ ７２ ９２
／ｍｍδ０．０６ ０．１１ ０．１６ ０．２１ ０．２６ ０．３１ ０．３６ ０．４６
６／℃０α×１
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１６．６１６．５１６．６１６．６１６．５１６．６１６．６１６．６
５ 结论
从以上测量的数据可知，铜在室温下ｌ＝３００ｍｍ下、其伸长量δ为０．ｔ在１２～９２℃时，０６～０．４６Δ
对应的脉冲个数为１ｍｍ，２～９２个。该实验装置测得的铜的线胀系数为α＝１准确值为α＝６．６×１０℃，
－６
两个值比较，误差很小。测量结果表１６．７×１０℃，
明，采用光栅尺测金属棒随温度变化而产生的长度微
－６
在操作上更为简便，小变化量和恒温控制法是可行的，
测量的物理量减少，测量的误差较小，测量结果较准确。该方法还可以作为高年级学生的设计性实验内容，以提高学生的实际应用能力。
櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍（上接第４５页）
实验项目的缺失，使学生获得更全面的物理化学实验训练，加深对物理化学基本原理和方法的理解和掌握。该实验体系在我校化学、材料等专业的实验教学中取得了良好的教学效果。）参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
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［］９ＬｉａｏＦ，ＴｉａｎＫＣ，ＹａｎＸ，ｅｔａｌ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓｕｂｓｔｒａｔｅｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂ ｇｑｙ
ｆｉｔｔｉｎｔｈｅｅｎｚｍｅｒｅａｃｔｉｏｎｃｕｒｖｅｔｏｔｈｅｉｎｔｅｒａｔｅｄＭｉｃｈａｅｌｉｓｅｎｔ －Ｍ－ｇｙｇ ［］（）：ｅｎｅｕａｔｉｏｎＪ．ＡｎａｌＢｉｏａｎａｌＣｈｅｍ，２００３３７５７５６７６２． －ｑ［］Ｈ［］１０ａｌｄａｎｅＪＢＳ．ＧｒａｈｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｍｅＣｈｅｍｉｓｔｒＪ．Ｎａ －ｐｙｙ
，（）：ｔｕｒｅ１９５７１７９８３２．
［］Ｈ１１ａｎｅｓＣＳ．ＳｔｕｄｉｅｓｏｎｌａｎｔａｍｌａｓｅｓＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓｔａｒｃｈｃｏｎｃｅｎ －ｐｙ
ｔｒａｔｉｏｎｕｏｎｔｈｅｖｅｌｏｃｉｔｏｆｈｄｒｏｌｓｉｓｂｔｈｅａｍｌａｓｅｏｆｅｒｍｉｎａ －ｐｙｙｙｙｙｇ ［］，（）：ｔｅｄｂａｒｌｅＪ．ＢｉｏｃｈｅｍＪ１９３２２６１４０６１４２１． －ｙ
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