第32卷第1期2009年1月
河北农业大学学报
JOURNALOFAGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI
Vol.32No.1Jan.2009
文章编号:1000-1573(2009)01-0103-04
¹
白藜芦醇-羟丙基-B-环糊精包合物的制备及鉴定
安伟娟, 锁 然, 李 娜, 胡珊珊
(河北农业大学食品科技学院,河北保定071001)
摘要:采用冷冻干燥法制备白藜芦醇-羟丙基-B-环糊精包合物。采用正交试验以包合率为指标筛选最佳工艺条件:白藜芦醇B羟丙基-B-环糊精为1B2(物质的量的比),包合温度为20e,包合时间为60min。以红外光谱、紫外光谱方法对包合物进行鉴定,初步证明包合物已形成。通过测定包合率的大小证明羟丙基-B-环糊精包合白藜芦醇效果较好。
关 键 词:白藜芦醇;羟丙基-B-环糊精;包合物中图分类号:R283文献标识码:A
Preparationandidentificationofinclusioncomplexesof
resveratrolwithhydroxypropyl-B-cyclodextrin
ANWe-ijuan,SUORan,LINa,HUShan-shan
(CollegeofFoodScienceandTechnology,AgricultureUniversityofHebei,Baoding071001,China)
Abstract:Theinclusioncomplexeswerepreparedbyfreeze-dryingmethod.Theoptimumprepara-tionconditionwasstudiedbyorthogonaltestwithencapsulationrateastheindexofevaluation:the
ratioofResveratroltoHP-B-CD1B2,inclusiontemperature20e,inclusiontime60minutes.ItsstructurewasidentifiedbyIR,UVabsorptionspectrum,hencepreliminarilyprovingthattheinclu-sioncomplexesofResveratrol-hydroxypropyl-B-cyclodextrinweresatisfactorilyformed.Keywords:resveratrol;hydroxyproply-B-cyclodextrin;inclusioncomplexes 有关专家认为:预防心、脑血管疾病、癌症、动脉硬化、延缓衰老等的保健药品将有着广阔的市场。而白藜芦醇正是这种心、脑血管疾病及癌症的天然化学预防剂。但白藜芦醇水溶性很差、不稳定,其应用范围受到了限制,因此提高其水溶性及稳定性是拓宽其应用范围的关键。
羟丙基-B-环糊精是具有广阔发展前景的优良药用辅料[2]。它不仅水溶性很高,一般大于75%,对热稳定,且对肾无毒,对肌肉和粘膜几乎无刺激。研究表明难溶性药物被羟丙基-B-环糊精包合后,不仅能增加药物的溶解度,还可以提高药物生物利用度[3]和稳定性[4],广泛应用于制药、食品及其它行业。目前,日本、美国、欧洲正将这一新兴
¹
[1]
辅料大量应用到制剂中,并且出现许多新型药物制
剂,我国也正在积极开发和利用这一多功能新兴辅料。为此,本试验用羟丙基-B-环糊精对白藜芦醇进行了包合研究。通过比较包合物中药物包合率,筛选出最佳制备工艺。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
白藜芦醇对照品:含量9919%;羟丙基-B-环糊精:山东新大精细化工有限公司;95%乙醇:分析纯,天津市化学试剂厂;双蒸水:自制;乙腈:色谱纯,上海市化学试剂厂;甲醇:色谱纯,天津市化学试剂厂;盐酸。
收稿日期:2008-10-06
:(),E-sohu.
104
河北农业大学学报第32卷
冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);78-1磁力加热搅拌器(国华电器有限公司);UV-2802H紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司);FTS3000傅立叶变换红外光谱仪配DTGS检测器(美国BIORAD公司);高效液相色谱仪配UV200Ò紫外检测器(大连依利特科学仪器有限公司);电子分析天平(美国Sartorius公司)。1.2 包合物的制备
称取适量羟丙基-B-环糊精,加水搅拌使其溶解;再将白藜芦醇用95%的乙醇溶解,在磁力搅拌器上,将白藜芦醇的乙醇溶液逐滴加入到羟丙基-B-环糊精溶液中,继续搅拌。静置一定时间,抽滤。将滤液倒入培养皿,放入冰箱过夜,待结成冰后用真空冷冻干燥机制成蓬松的块状物质研碎即得包合物。1.3 HPLC测定包合物中白藜芦醇的含量
色谱条件:色谱柱:DiamonsilC18柱(416mmi.d.@250mm,5Lm);流动相:乙腈:水(40B60);检测波长:306nm;流速:1mL/min;柱温:室温;进样量:10LL。
2 结果与分析
2.1 正交试验设计确定最佳工艺条件
本研究采用冷冻干燥法,试验中以包合率为评价指标。首先对影响包合率的诸因素如投料比、包合温度、包合时间、溶剂、搅拌时间等进行单因素考察。结果显示,白藜芦醇与羟丙基-B-环糊精物质量的比(A)、包合时间(B)、包合温度(C)对包合率影响较大,因此对这3个影响因素设计正交试验,采用L9(3)试验方法进行试验。
4
表1 正交实验结果
Table1 Theresultesoforthogonaltest
实验号Number123456789K1K2K3R
A(物质量的比)
Rate1:11:11:11:21:21:21:31:31:357.4363.2956.836.46
B(包合时间)/minInclusiontime
[***********]57.2959.4060.863.57
C(包合温度)/eInclusiontemperature
[***********]60.4160.0557.093.32
药物包合率/%Encapsulationrate
56.0358.8757.3859.0464.4866.3456.8054.8458.85
K1,K2,K3分别表示三个水平的方差,R表示极差.
表1表明,影响包合率的因素A>B>C。因此选择最佳包合条件为A2B3C1,即白藜芦醇与羟丙基-B-环糊精物质量的比为1B2,包合温度为20e,包合时间为60min。按最佳包合条件制备了3批样品,结果所制得的包合物固体晶莹透亮,其水溶液外观透明,室温静置4周后溶液仍澄清。而白藜芦醇水溶液在同样条件下放置后出现浑浊,初步说明包合物溶液较为稳定。
2.2 白藜芦醇-羟丙基-B环糊精包合物鉴定2.2.1 紫外光谱法 将适量白藜芦醇、羟丙基-B-环糊精、包合物、白藜芦醇和羟丙基-B-环糊精的物理混合物分别用40%乙醇定容到10mL容量瓶中;另取包合物适量用40%乙醇定容到25mL容量瓶中,加入适量的盐酸(0105~210mol/L),振荡。
见图1。
1.混合物;2.白藜芦醇;3.酸化后的包合物;4.包合物;5.羟丙基-B-环糊精
图1 紫外光谱图
Fig.1 UVabsorptionspectra
由图1可见,在200~400nm之间,羟丙基-B-,
第1期 安伟娟等:白藜芦醇-羟丙基-B-环糊精包合物的制备及鉴定
105
强度基本相同,这说明羟丙基-B-环糊精对测定无干扰;白藜芦醇-羟丙基-B-环糊精包合物没有吸收,这可以证明包合物已经形成。当用盐酸对包合物进行破坏后,在200~400nm又出现紫外吸收,这可验证包合物的形成。
2.2.2 红外光谱法 用KBr将白藜芦醇、羟丙基-B-环糊精、白藜芦醇和羟丙基-B-环糊精混合物、白藜芦醇-羟丙基-B-环糊精包合物压片,分别测试红外光谱(图2)
。
左上:包合物;左下:白藜芦醇;右上:羟丙基-B-环糊精;右下:混合物
图2 红外光谱图Fig.2 IRspectra
由图2可见,包合物与混合物的图谱明显不同,包合物有5个峰发生紫移:1607、1381、1154、988、610;有5个峰发生红移:3305、2929、1512、1445、832;且包合物的峰强度有所增加。9个峰消失:3023、1588、1327、1249、1035、1039、1011、966、676。这均表明羟丙基-B-环糊精与白藜芦醇产生了包合作用。
2.3 HPL测定白藜芦醇的含量
2.3.1 线性关系试验 精密称取白藜芦醇对照品适量,用40%甲醇定容到50mL棕色容量瓶中,作为储备液;分别精密吸取储备液5、2、1、015、012、011和0101mL,用40%甲醇定容到10mL,摇匀。用0145Lm微孔滤膜过滤。分别吸取10LL注入液相色谱仪。以色谱峰面积A为纵坐标,白藜芦醇浓度C为横坐标绘制标准曲线,得到回归方程A=49109C+353147,r=019994,n=6。可以看出500~10Lg/mL范围内线性关系良好。
2.3.2 精密度试验 分别精密称取包合物6份,用40%甲醇定容到10mL。加入适量盐酸,振荡,调pH值。分别注入液相色谱仪,记录峰面积。计算相2含量测定精密度较好。
2.3.3 加标回收率试验 精密称取同批五份白藜芦醇包合物适量,溶于40%的甲醇中。分别加入适量的白藜芦醇对照品,用40%甲醇定容。分别加入适量盐酸,摇匀。用0145Lm微孔滤膜过滤。按标准曲线项下同法测定,求得平均回收率为93188%,RSD为117%(n=5)。结果表明,该法用于白藜芦醇包合率的测定准确性较好。
2.3.4 包合率的测定 分别精密称取3份不同的包合物适量,用40%甲醇定容到25mL容量瓶中,摇匀。取10mL包合物溶液,加入适量盐酸,振荡;在上述液相条件下进样,记录色谱峰面积,代人回归方程,得到包合物中药物的含量。包合率=测定的包合物中药物的量/实际投入的药物的量@100%。计算得到白藜芦醇的平均包合率为63129%。
3 结论与讨论
用冷冻干燥法制备包合物,方法简便,制备时间短,条件易控制。由紫外图谱、红外光谱均可说明包合物确已形成,由紫外图谱可以证明白藜芦醇未发,
106
河北农业大学学报第32卷
羟丙基-B-环糊精在人体内基本上不被分解代谢,也不累积,口服绝大部分随大便排出体外,非肠道给药时基本上全部随尿液排出体外;羟丙基-B-环糊精在生物体内可以促使被包合物质迅速释放;羟丙基-B-环糊精比其他的环糊精的表面活性低、溶血活性低,使用更安全,故在药剂学方面有了更广泛的应用。
在包合率的测定中为使包合物中的白藜芦醇充分溶出,需进行脱包处理。在包合物溶液中加入适量的一定浓度的盐酸,可以破坏羟丙基-B-环糊精的结构,使白藜芦醇从结构中释放出来。由于白藜芦醇是酸性,盐酸不能对其产生破坏,性质也不会发生变化。
HPLC方法准确、可靠、重现性好,可作为白藜芦醇-羟丙基-B-环糊精包合物中白藜芦醇的含量测定方法。本实验药物包合率为63129%。分析包合率原因,是由于白藜芦醇在乙醇中溶解度依然
较低,使白藜芦醇与羟丙基-B-环糊精发生包合反应的几率较小。参考文献:
[1] MeishiangJ,LiningC.Cancerchemopreventiveactivity
ofresveratrol,anaturalproductderivedfromgrapes[J].Science,1997,275:218-2201.
[2] 陶涛.羟丙基-B-环糊精的特性及其药剂学应用
[J].中国医药工业杂志,2002,33(6):304.
[3] LinaresMS,LonghiMR.Effectsofhydroxypropyl-beta-cyclodextrinonthechemicalstabilityofanaph-thoquinoneinaqueoussolutionsPharmazie.2003,58(1):32-37.
[4] 张雪梅,刘中华.维生素D-B-环糊精包合物的测定
及热稳定性试验研究[J].营养学报,2006,28(4):352-353.
(编辑:张月清)
(上接第98页)
[3] 小岛雄次,小野晴美.
第32卷第1期2009年1月
河北农业大学学报
JOURNALOFAGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI
Vol.32No.1Jan.2009
文章编号:1000-1573(2009)01-0103-04
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白藜芦醇-羟丙基-B-环糊精包合物的制备及鉴定
安伟娟, 锁 然, 李 娜, 胡珊珊
(河北农业大学食品科技学院,河北保定071001)
摘要:采用冷冻干燥法制备白藜芦醇-羟丙基-B-环糊精包合物。采用正交试验以包合率为指标筛选最佳工艺条件:白藜芦醇B羟丙基-B-环糊精为1B2(物质的量的比),包合温度为20e,包合时间为60min。以红外光谱、紫外光谱方法对包合物进行鉴定,初步证明包合物已形成。通过测定包合率的大小证明羟丙基-B-环糊精包合白藜芦醇效果较好。
关 键 词:白藜芦醇;羟丙基-B-环糊精;包合物中图分类号:R283文献标识码:A
Preparationandidentificationofinclusioncomplexesof
resveratrolwithhydroxypropyl-B-cyclodextrin
ANWe-ijuan,SUORan,LINa,HUShan-shan
(CollegeofFoodScienceandTechnology,AgricultureUniversityofHebei,Baoding071001,China)
Abstract:Theinclusioncomplexeswerepreparedbyfreeze-dryingmethod.Theoptimumprepara-tionconditionwasstudiedbyorthogonaltestwithencapsulationrateastheindexofevaluation:the
ratioofResveratroltoHP-B-CD1B2,inclusiontemperature20e,inclusiontime60minutes.ItsstructurewasidentifiedbyIR,UVabsorptionspectrum,hencepreliminarilyprovingthattheinclu-sioncomplexesofResveratrol-hydroxypropyl-B-cyclodextrinweresatisfactorilyformed.Keywords:resveratrol;hydroxyproply-B-cyclodextrin;inclusioncomplexes 有关专家认为:预防心、脑血管疾病、癌症、动脉硬化、延缓衰老等的保健药品将有着广阔的市场。而白藜芦醇正是这种心、脑血管疾病及癌症的天然化学预防剂。但白藜芦醇水溶性很差、不稳定,其应用范围受到了限制,因此提高其水溶性及稳定性是拓宽其应用范围的关键。
羟丙基-B-环糊精是具有广阔发展前景的优良药用辅料[2]。它不仅水溶性很高,一般大于75%,对热稳定,且对肾无毒,对肌肉和粘膜几乎无刺激。研究表明难溶性药物被羟丙基-B-环糊精包合后,不仅能增加药物的溶解度,还可以提高药物生物利用度[3]和稳定性[4],广泛应用于制药、食品及其它行业。目前,日本、美国、欧洲正将这一新兴
¹
[1]
辅料大量应用到制剂中,并且出现许多新型药物制
剂,我国也正在积极开发和利用这一多功能新兴辅料。为此,本试验用羟丙基-B-环糊精对白藜芦醇进行了包合研究。通过比较包合物中药物包合率,筛选出最佳制备工艺。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
白藜芦醇对照品:含量9919%;羟丙基-B-环糊精:山东新大精细化工有限公司;95%乙醇:分析纯,天津市化学试剂厂;双蒸水:自制;乙腈:色谱纯,上海市化学试剂厂;甲醇:色谱纯,天津市化学试剂厂;盐酸。
收稿日期:2008-10-06
:(),E-sohu.
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河北农业大学学报第32卷
冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);78-1磁力加热搅拌器(国华电器有限公司);UV-2802H紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司);FTS3000傅立叶变换红外光谱仪配DTGS检测器(美国BIORAD公司);高效液相色谱仪配UV200Ò紫外检测器(大连依利特科学仪器有限公司);电子分析天平(美国Sartorius公司)。1.2 包合物的制备
称取适量羟丙基-B-环糊精,加水搅拌使其溶解;再将白藜芦醇用95%的乙醇溶解,在磁力搅拌器上,将白藜芦醇的乙醇溶液逐滴加入到羟丙基-B-环糊精溶液中,继续搅拌。静置一定时间,抽滤。将滤液倒入培养皿,放入冰箱过夜,待结成冰后用真空冷冻干燥机制成蓬松的块状物质研碎即得包合物。1.3 HPLC测定包合物中白藜芦醇的含量
色谱条件:色谱柱:DiamonsilC18柱(416mmi.d.@250mm,5Lm);流动相:乙腈:水(40B60);检测波长:306nm;流速:1mL/min;柱温:室温;进样量:10LL。
2 结果与分析
2.1 正交试验设计确定最佳工艺条件
本研究采用冷冻干燥法,试验中以包合率为评价指标。首先对影响包合率的诸因素如投料比、包合温度、包合时间、溶剂、搅拌时间等进行单因素考察。结果显示,白藜芦醇与羟丙基-B-环糊精物质量的比(A)、包合时间(B)、包合温度(C)对包合率影响较大,因此对这3个影响因素设计正交试验,采用L9(3)试验方法进行试验。
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表1 正交实验结果
Table1 Theresultesoforthogonaltest
实验号Number123456789K1K2K3R
A(物质量的比)
Rate1:11:11:11:21:21:21:31:31:357.4363.2956.836.46
B(包合时间)/minInclusiontime
[***********]57.2959.4060.863.57
C(包合温度)/eInclusiontemperature
[***********]60.4160.0557.093.32
药物包合率/%Encapsulationrate
56.0358.8757.3859.0464.4866.3456.8054.8458.85
K1,K2,K3分别表示三个水平的方差,R表示极差.
表1表明,影响包合率的因素A>B>C。因此选择最佳包合条件为A2B3C1,即白藜芦醇与羟丙基-B-环糊精物质量的比为1B2,包合温度为20e,包合时间为60min。按最佳包合条件制备了3批样品,结果所制得的包合物固体晶莹透亮,其水溶液外观透明,室温静置4周后溶液仍澄清。而白藜芦醇水溶液在同样条件下放置后出现浑浊,初步说明包合物溶液较为稳定。
2.2 白藜芦醇-羟丙基-B环糊精包合物鉴定2.2.1 紫外光谱法 将适量白藜芦醇、羟丙基-B-环糊精、包合物、白藜芦醇和羟丙基-B-环糊精的物理混合物分别用40%乙醇定容到10mL容量瓶中;另取包合物适量用40%乙醇定容到25mL容量瓶中,加入适量的盐酸(0105~210mol/L),振荡。
见图1。
1.混合物;2.白藜芦醇;3.酸化后的包合物;4.包合物;5.羟丙基-B-环糊精
图1 紫外光谱图
Fig.1 UVabsorptionspectra
由图1可见,在200~400nm之间,羟丙基-B-,
第1期 安伟娟等:白藜芦醇-羟丙基-B-环糊精包合物的制备及鉴定
105
强度基本相同,这说明羟丙基-B-环糊精对测定无干扰;白藜芦醇-羟丙基-B-环糊精包合物没有吸收,这可以证明包合物已经形成。当用盐酸对包合物进行破坏后,在200~400nm又出现紫外吸收,这可验证包合物的形成。
2.2.2 红外光谱法 用KBr将白藜芦醇、羟丙基-B-环糊精、白藜芦醇和羟丙基-B-环糊精混合物、白藜芦醇-羟丙基-B-环糊精包合物压片,分别测试红外光谱(图2)
。
左上:包合物;左下:白藜芦醇;右上:羟丙基-B-环糊精;右下:混合物
图2 红外光谱图Fig.2 IRspectra
由图2可见,包合物与混合物的图谱明显不同,包合物有5个峰发生紫移:1607、1381、1154、988、610;有5个峰发生红移:3305、2929、1512、1445、832;且包合物的峰强度有所增加。9个峰消失:3023、1588、1327、1249、1035、1039、1011、966、676。这均表明羟丙基-B-环糊精与白藜芦醇产生了包合作用。
2.3 HPL测定白藜芦醇的含量
2.3.1 线性关系试验 精密称取白藜芦醇对照品适量,用40%甲醇定容到50mL棕色容量瓶中,作为储备液;分别精密吸取储备液5、2、1、015、012、011和0101mL,用40%甲醇定容到10mL,摇匀。用0145Lm微孔滤膜过滤。分别吸取10LL注入液相色谱仪。以色谱峰面积A为纵坐标,白藜芦醇浓度C为横坐标绘制标准曲线,得到回归方程A=49109C+353147,r=019994,n=6。可以看出500~10Lg/mL范围内线性关系良好。
2.3.2 精密度试验 分别精密称取包合物6份,用40%甲醇定容到10mL。加入适量盐酸,振荡,调pH值。分别注入液相色谱仪,记录峰面积。计算相2含量测定精密度较好。
2.3.3 加标回收率试验 精密称取同批五份白藜芦醇包合物适量,溶于40%的甲醇中。分别加入适量的白藜芦醇对照品,用40%甲醇定容。分别加入适量盐酸,摇匀。用0145Lm微孔滤膜过滤。按标准曲线项下同法测定,求得平均回收率为93188%,RSD为117%(n=5)。结果表明,该法用于白藜芦醇包合率的测定准确性较好。
2.3.4 包合率的测定 分别精密称取3份不同的包合物适量,用40%甲醇定容到25mL容量瓶中,摇匀。取10mL包合物溶液,加入适量盐酸,振荡;在上述液相条件下进样,记录色谱峰面积,代人回归方程,得到包合物中药物的含量。包合率=测定的包合物中药物的量/实际投入的药物的量@100%。计算得到白藜芦醇的平均包合率为63129%。
3 结论与讨论
用冷冻干燥法制备包合物,方法简便,制备时间短,条件易控制。由紫外图谱、红外光谱均可说明包合物确已形成,由紫外图谱可以证明白藜芦醇未发,
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羟丙基-B-环糊精在人体内基本上不被分解代谢,也不累积,口服绝大部分随大便排出体外,非肠道给药时基本上全部随尿液排出体外;羟丙基-B-环糊精在生物体内可以促使被包合物质迅速释放;羟丙基-B-环糊精比其他的环糊精的表面活性低、溶血活性低,使用更安全,故在药剂学方面有了更广泛的应用。
在包合率的测定中为使包合物中的白藜芦醇充分溶出,需进行脱包处理。在包合物溶液中加入适量的一定浓度的盐酸,可以破坏羟丙基-B-环糊精的结构,使白藜芦醇从结构中释放出来。由于白藜芦醇是酸性,盐酸不能对其产生破坏,性质也不会发生变化。
HPLC方法准确、可靠、重现性好,可作为白藜芦醇-羟丙基-B-环糊精包合物中白藜芦醇的含量测定方法。本实验药物包合率为63129%。分析包合率原因,是由于白藜芦醇在乙醇中溶解度依然
较低,使白藜芦醇与羟丙基-B-环糊精发生包合反应的几率较小。参考文献:
[1] MeishiangJ,LiningC.Cancerchemopreventiveactivity
ofresveratrol,anaturalproductderivedfromgrapes[J].Science,1997,275:218-2201.
[2] 陶涛.羟丙基-B-环糊精的特性及其药剂学应用
[J].中国医药工业杂志,2002,33(6):304.
[3] LinaresMS,LonghiMR.Effectsofhydroxypropyl-beta-cyclodextrinonthechemicalstabilityofanaph-thoquinoneinaqueoussolutionsPharmazie.2003,58(1):32-37.
[4] 张雪梅,刘中华.维生素D-B-环糊精包合物的测定
及热稳定性试验研究[J].营养学报,2006,28(4):352-353.
(编辑:张月清)
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[3] 小岛雄次,小野晴美.