衡阳师范学院
毕业论文（设计）
题 目： 所 在 系： 化学与材料科学系 专 业： 化学生物学 学 号： 作者姓名： 指导教师：
2013年5月12日
转基因猪研究进展
化学与材料科学系 化学生物学专业
学号：2009280115 唐海林 指导老师：杨 海
摘 要：转基因动物是目前生物领域的研究热点之一，该技术可以通过改变动物的遗传组成，使动物按照人们的意愿进行表现。由于猪在解剖、组织、生理和营养代谢等方面均与人类最接近，又是一种重要家畜，所以转基因猪的研究越来越受重视。本文综述了转基因猪的常用技术方法、对猪生产的作用以及对转基因猪的问题分析和前景展望等方面的知识，分析得出通过研究遗传育种和器官移植的核心技术，将极大地促进含多种优良性状的转基因克隆猪的研究与产业化，为今后加速我国对猪的遗传性状进行转基因改良，提高其生产性能，并制作用于人类疾病动物模型及作为人类器官移植供体的转基因猪研究奠定基础，旨在为转基因猪的研究人员提供参考。
关键词：猪；转基因；研究进展
目录
1. 引言........................................................................................................................................1
2. 猪的主要品种概况................................................................................................................1
3. 转基因猪的研究进展............................................................................................................2
4. 猪的转基因技术概况............................................................................................................3 4.1 显微注射法 . ...................................................................................................................................... 3
4.2 精子载体法 . ....................................................................................................................................... 4
4.3 体细胞核移植法 . ............................................................................................................................... 4
4.4 胚胎干细胞介导法 . ........................................................................................................................... 5
5. 转基因猪的检测方法............................................................................................................5
5.1 PCR 法 ............................................................................................................................................... 5
5.2 DNA 斑点杂交 .................................................................................................................................. 5
5.3 Southern 印迹法 ................................................................................................................................ 6
5.4 性状（表型）检测 . ........................................................................................................................... 6
6. 转基因技术对猪生产的作用................................................................................................6
6.1 提高猪的生产性能 . ........................................................................................................................... 6
6.2 提高猪的抵抗力和适应性 . ............................................................................................................... 7
6.3 制作用于人类疾病动物模型 . ........................................................................................................... 7
6.4作为人类器官移植供体 . .................................................................................................................... 7
6.5用作生物反应器 . ................................................................................................................................ 8
7. 转基因猪研究的主要基因......................................................................................................8
7.1 猪脂肪和肌肉相关基因 . ................................................................................................................... 8
7.2 猪抗病相关基因 . ............................................................................................................................... 9
8. 转基因猪问题分析及前景展望..........................................................................................10
8.1 存在问题 . ......................................................................................................................................... 10
8.2前景及展望 . ...................................................................................................................................... 11
参考文献...................................................................................................................................12
致谢...........................................................................................................................................15 Abstract .....................................................................................................................................16
1. 引言
在农业中养猪生产占有极其重要的地位，是国民经济的重要组成部分，而提高养猪生产水平的关键因素是品种。据美国农业部(USDA)1996年对美国50年来畜牧生产中各种科学技术所起作用的总结，品种改良的作用居各项技术之首，占到40%，远远高于营养饲料(20%)、疾病防治(15%)和繁殖行为(10%)等[1]。在养猪生产中也是如此这就是发达国家对遗传育种大力度科技投入的主要原因。这就说明：谁把握住遗传育种的核心技术，谁就占有最大份额的市场。中国虽然是世界养猪第一大国核心种猪来源却长期依赖进口长期处于―引种→维持→退化→再引种‖的不良循环[2]，导致整个繁育体系受制于其他养猪先进国家，在全球经济一体化时代对我国这样的养猪大国来说是非常不利的。而转基因技术的出现，使猪育种的传统支柱路线发生重大转变，因此从这个角度加大对猪育种方面的研究对于提高我国养猪生产水平有着重要意义。
2. 猪的主要品种概况
世界猪的品种，文献报道过的共约300个，其中我国猪品种153个约占全世界的一半。育成品种主要产于欧美两洲，特别是英国、美国、丹麦、苏联等国的猪种，数量较多，历史较久，影响较大。但目前，在国际上分布广而影响较大的只有十多个品种，其中又以长白猪、约克夏、汉普夏、杜洛克、皮特兰、拉康白等几个品种较为突出[3]。在亚洲，各国有不少适应于当地自然条件的地方猪种。尤其是我国，我国拥有地方猪品种64个，为世界之首，包括东北民猪、香猪、太湖猪、金华猪、莆田黑猪、西北八眉猪、荣昌猪、藏猪等。澳非两洲，养猪数量不多，猪的品种则大部分有欧美国家输入。
目前，世界猪品种资源的保存和利用存在着两种倾向。发达国家随着各国经济的发展，人们对蛋白质食品需求量的增加，在家畜育种方面，一直把高瘦肉率和高生长速度作为选种的主要目标，高产品种或专门化品系大量涌现，应用人工授精进行大规模杂交改良，致使原有地方品种迅速减少。发展中国家，虽有较丰富的猪种资源，但由于保种不当和盲目引进外来品种杂交，也造成原有品种数量
锐减和质量下降。这两种倾向都导致世界性的品种资源危机，也就是猪种基因库的枯竭。世界性的品种资源危机，已引起了国际组织和许多国家政府的重视。
世界猪品种的分类方法很多，归纳起来大致有如下十种：
（一）按用途分为瘦肉型、脂肪型、肉脂兼用型三种；
（二）按毛色分为白猪、黑猪、黑白花猪、棕猪四种；
（三）按体成熟迟早分为早熟种、中熟种和晚熟种三种；
（四）按体型大小分为大型猪、中型猪、小型猪三种；
（五）按耳型大小分为大耳猪和小耳猪两种；
（六）按脸形分为大花脸、二花脸和小花脸三种；
（七）按头骨分为直面、凹面、突凹面三种；
（八）按培育程度分为原始种、优良种、改良种三种；
（九）按体质类型分为粗糙型、细致型和结实匀称型三种；
（十）按产地分为华南猪、华北猪、苏联大白猪等。
3. 转基因猪的研究进展
2000年，Polejaeva 等用猪成纤维细胞作为供体细胞获得世界首例体细胞核移植猪。
2001年4月11日，PPL 公司利用表达GFP 基因的猪体细胞成功地克隆出5只―转基因克隆猪‖。
2002年1月2日，PPL 公司培育出有一个ot ．1，3-半乳糖基转移酶基因处于被―关闭‖状态的新型转基因克隆猪。
2002年，L 脚等利用同源重组的方法获得敲除了d ．1，3-半乳糖基转移酶基因的转基因克隆猪。
2003年，英国PPL 公司和ROSLIN 研究所合作成功地克隆出了a ．1，3-半乳糖基转移酶基因双敲除克隆猪。
2005年，韩国忠南大学培育出产生用作抗癌辅助治疗剂的蛋白质(粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子的蛋白质GM-CSF) 转基因克隆猪。
2005年8月8日，中国农业大学获得国内第一例体细胞克隆猪，并获得GFP 转基因猪囊胚，但未见转基因克隆猪出生的报道。
2006年lO 月12日，我们实验室获得国内首例成体体细胞克隆猪，同时也是第一例克隆东北民猪。
2006年12月24日，我们实验室获得国内第一例转基因克隆猪，此克隆猪表达了来自水母的外源基因绿色荧光蛋白(GFP)。
2008年8月，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所和军事医学科学院生物工程研究所合作同样获得了转有ω-3脂肪酸去饱和酶基因的转基因克隆猪。
2008年9月，吉林大学农学部畜牧兽医学院和军事医学科学院第十一所合作，得到了带有抗猪瘟病毒转基因猪的克隆后代，经检测3只克隆猪均带有抗猪瘟病毒基因。
2009年生产高比例的抗原特异性人源抗体的转染色体牛的出生，是转基因动物生产药用蛋白的又一个里程碑。
4. 猪的转基因技术概况
4.1 显微注射法
该技术的基本原理就是用精细的显微注射针将外源基因直接注入猪受精卵的雄原核，使外源基因整合到动物的基因组，从而获得转基因猪。该方法的优点是基因导入确实可靠，基因用量很省。在转基因猪的研究中，显微注射法是最主要的方法之一。但其成功率较低，一般为1%～2%[4]。因此，许多研究者分别从基因构件的设计、显微注射各技术环节的改进与完善等方面进行研究，以期提高生产转基因猪的效率。但是显微注射法操作程序复杂、对胚胎损伤大，对技术、设备要求高，特别是在牛羊猪等有开发应用价值的大型哺乳动物上的低效率(低于1%)[5]，极大地制约了该技术的应用前景。世界上首次报道的转基因猪就是Hammer 等(1985) 用原核注射技术得到的。
4.2 精子载体法
精子载体法相对于显微注射法来讲是最简单易行的方法，可对大量的精子细胞进行处理，且不损伤卵母细胞，在短时间内便能生产出转基因胚胎。大多数研究表明，外源DNA 吸附在精子表面或存在于细胞质中，不能整合到染色体上。但最近意大利科学家将克隆的目的基因与成熟的小鼠精子在缓冲液中孵育15min 后，精子捕获了目的DNA 。目前精子携带外源基因的机理正不断被揭示。Spermdio 等运用精子载体法携带pSV-CAT 基因，通过人工授精, 得到82头仔猪，经检测获得5只转基因仔猪。新疆畜牧科学院绵羊中心农业部畜牧兽医生物技术重点实验室运用精子载体法得到的145头仔猪,8头为转基因猪[6]。
4.3 体细胞核移植法
体细胞核移植是近些年新出现的的一种转基因技术。克隆绵羊―多莉‖的诞生是转基因动物史上的里程碑[7]。其基本的制作过程是：先把外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞的细胞核转移到去核的卵母细胞组成重构胚胎，再把其移植到假孕母体，待其妊娠、分娩后便可获得转基因的克隆动物。这种方法具有相对较大的优越性：成功率高，约是显微注射法的2 倍；可以预先鉴定供体细胞与外源基因是否融合；可对基因整合状况及整合位点进行鉴定和评估；可以预测基因的表达情况；没有位置效应，节省供体和受体动物的数量及费用。
尽管如此，猪的体细胞克隆效率仍然很低，许多环节的机制尚不清楚。2000 年，Polejaeva 等采用的二步移植法(Double nuclear transfer) 也获得了体细胞核移植仔猪。该法使用M Ⅱ期卵母细胞在受精时已被精子激活，从而避免了人工电激活对NT 胚造成的不良影响。因此，被认为比较适合用于猪成体细胞核移植。2001 年，Booth 等将除去透明带的卵母细胞用作猪体细胞核移植的受体，并证明了无透明带技术也可应用于猪的核移植。2002 年，Yin 等报道用Demecolcine 处理M Ⅱ期卵母细胞，简化了技术方法，具有一定的实用意义。美国密苏里大学通过克隆技术培育出了含荧光水母基因的小猪。2006 年12 月24 日，东北农业大学刘忠华教授的转基因克隆猪获得成功，3 头含绿色荧光蛋白的转基因克隆猪自然分娩，这是继美国、韩国和日本之后第四例成功通过体细胞核移植方式生产出的绿色荧光蛋白转基因克隆猪。
4.4 胚胎干细胞介导法
胚胎干细胞(ES)是从早期胚胎的内细胞团里分离出来的, 能在体外培养的一种高度未分化的细胞。将ES 细胞植入动物囊胚后, 可参与宿主胚胎的形成, 直至达到种系嵌合[8]。因此, 可将其作为一种载体, 把外源DNA 导入ES 细胞就可以实现由此发育而成的转基因动物。ES 细胞在严谨的生长条件下, 在滋养层细胞上可以在较长时间内以稳定的细胞系形式维持在未分化状态, 因而可以像普通的体细胞那样通过磷酸钙沉淀、逆转录病毒感染和电穿孔等方法转染, 进而筛选细胞克隆。
除上述方法外，还有逆转录病毒载体法、基因打靶法、电脉冲法、磷酸钙共沉淀法、电穿孔法等转基因方法。
5. 转基因猪的检测方法
检测转基因动物根本方法是进行核酸检测，通过分子生物学和细胞生物学手段分析基因整合状况、转录活性、表达活性和遗传稳定性等指标。除了以上方法外，还需要从遗传学上，动物整体水平上观察表型的改变，分析基因型对动物整体性状和生理功能的影响，来进一步鉴定基因的性质。具体主要有以下几种方法：
5.1 PCR 法
PCR 法是在体外扩增外源基因特异DNA 片段，从而对外源基因进行检测。其基本原理同体内DNA 的复制一样，经过变性、退火及延伸三个过程，在短时内可将两引物间模板扩增至百万倍。在PCR 反应中这个过程是靠温度的调整和聚合酶的共同作用完成的。由于PCR 所需样品少，灵敏度高而且操作简便因而是最长用的转基因动物外源基因整合、表达的检测方法。但该方法要求待分析的基因组DNA 样品应尽可能纯化且无污染，否则会干扰本反应，出现假阳性和重复性差。
5.2 DNA 斑点杂交
首先将待测的DNA 样品变性，点在尼龙膜（或硝酸纤维素膜）等固体支持物上使其附着，然后与外源基因特异性探针杂交，从而在样品中检测外源基因的有无。为避免假阳性，外源基因的探针应与与内源基因组DNA 无同源性，同时为避免假阴性，可用质粒DNA 作阳性对照。该方法对样品纯度要求低、简单、
快速、经济、灵敏度高（能从2μg～5μg的基因组DNA 中检出单拷贝基因），尤其对大批子代动物的粗筛颇具优越性，应作为首选方法。
5.3 Southern 印迹法
Southern Blot法是通过外源基因特异性探针与已附着于固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜) 上的经酶切、电泳分离的变性DNA 链杂交，检测样品中是否存在外源基因目的DNA 片段的方法。该方法灵敏准确，因而广泛用于转基因动物的筛选和鉴定。但此方法费用高，操作烦琐，且对DNA 样品的质量和纯度要求较高。
5.4 性状（表型）检测
通过转基因技术获得的转基因猪在其体型、生长速率、瘦肉率等方面都比一般品种的猪要优越，可以通过观察转基因猪的生长速率、体型及相对于一般品种的猪的瘦肉率判定是否为转基因猪。1988年，澳大利亚scammark 教授将猪生长激素基因注入猪的受精卵，获得了―超级猪‖，这是生物工程在家畜基因工程育种上的一大突破。我国的陈永福等用融合基因omT/pGH进行基因转移，转基因猪的生长速度提高11.8% ～ 14.2%，饲料利用率提高10%，瘦肉率也有所增加。我国在―七五‖，―八五‖期间获生长激素转基因猪的第2、3、4代共215头。并初步建立生产转基因猪的技术体系。转基因猪核心群的生长水平比非转基因猪提高20%，生产效率提高5%。
6. 转基因技术对猪生产的作用
6.1 提高猪的生产性能
转基因技术应用打破了自然界不同种群繁殖的种间隔离，使基因能在中间进行流动和传递，实现了动物种间遗传物质的重组和交换，能够培育出生产性能突出的优良品种。Hamme 等将人的生长素基因导入猪的受精卵获得成功。同窝的转基因猪和非转基因猪比较，生长速度和饲料利用率显著提高，胴体脂肪率也明显下降[9]。我国陈永福、魏庆信等也取得了类似的结果，用自己构建的融合基因DMT/PGH 获得了转基因猪，其生长速度提高了11.8% ～ 14.2%，饲料利用率提高了10%，但这些转基因猪在获得生产性状提高的同时，也留下了一些后遗症，如关节病、肾病及生殖能力丧失等。
6.2 提高猪的抵抗力和适应性
当今威胁养殖业首要问题就是疾病，综合性病毒感染成为发病的主要原因。转基因技术的使用可以使某些抗疾病的基因表达，增强他们的抵抗力。另外猪的应急性反应也是猪生病的重要原因，如果可以通过转基因技术的实施，可以表达适应性强的基因。因此可以降低动物的发病率。1993年，Suetlali 等将含有编码小鼠Mxl 蛋白的cDNA 的3种基因构件分别转移到猪体内中，获得Mx1-转基因猪, 但基因转移效率很低[10]。
6.3 制作用于人类疾病动物模型
利用转基因动物建立人类疾病模型，来研究探索人类遗传性疾病的机理及治疗方法，是转基因动物近年来研究的热点之一。到目前为止，建立转基因小鼠模型的遗传性疾病有：动脉粥样硬化病、镰刀形细胞贫血症、老年痴呆症，自身免疫病，淋巴系统病，皮炎和前列腺癌等。猪已被广泛用于生物医学研究，包括皮肤、消化器管和心血管系统。这是因为猪与人类具有许多生物学相似性。尽管转基因猪的人类猪疾病模型的研究报道较少，但今后可能成为研究和治疗人类疾病的理想材料。2008 年G.A.Wyszyrnska-Pawelec 等人成功进行了转基因猪做为人骨髓贡献者的研究。同样，2008 年C. Costa 等人进行了转基因猪的软骨作为今后临床应用的材料的研究。
6.4作为人类器官移植供体
很久以前人们就希望将动物的器官组织移植到人体内，挽救人们的生命和补救器官缺陷，但异种器官移植的一个主要障碍就是由补体介导的超敏排斥反应。为了克服异体移植的排异现象，近来提出了两条解决途径：其一是清除受体血液中的补体，其二是通过转基因技术，克隆受体的补体调节蛋白基因并转移至供体动物基因组中，使之在供体心血管内上皮表达。采用这种受体的先天性补体系统缺陷或用抑制剂抑制受体的补体系统就可延长异种器官移植存活, 从而可以克服异种器官移植而引起的排异反应。英国剑桥伊姆朗公司1993 年6 月宣布已培育成功37 头具有人类基因的转基因猪。这种猪含加速人体基因退化因子，可防止人们对新移植器官产生排斥现象。2008年Ekser B 等人研究了异种器官的应用，猪的器官转移到灵长类动物身上的应用获得了很好的结果。
6.5用作生物反应器
转基因动物的问世，为利用基因工程手段获得低成本，高活性和高表达的产物开辟了一条重要途径。人们可以将编码罕见的，具有医用价值的人体蛋白基因转移给猪，使其在猪体的血液或乳腺等组织中表达，从而可以在乳汁或血液中获取转基因表达产物。这些表达产物不仅产量高，易提纯且具有稳定的生物活性。作为生物反应器的转基因猪又可无限扩繁，且饲养成本低。目前，生物反应器主要利用转基因动物的乳腺组织和血液组织进行定位表达，特别是利用乳腺组织生产具有生物活性的多肽药物和具有特殊营养价值的蛋白质，已经逐步形成一个新兴的转基因高技术、高效益的制药产业。近年来，这方面的研究已获得了突破性的进展。Wall 等(1991)[11]将小鼠编码乳清酸蛋白(WAP)的基因转移给猪，通过检测三头转基因猪整个泌乳期发现鼠的WAP 在奶中的浓度为1 g ／L ，相应的mRNA 只存在于乳腺中。Swanson [12]等(1992)用β-球蛋白的4个核酸酶I 的高敏位点连接入α-球蛋白基因的两个拷贝和人β-球蛋白基因的一个拷贝组成的融合基因的转基因猪与鼠的原型相似，产生的血红蛋白二聚体占血红蛋白总量的9%，且重组人血红蛋白的氧平衡曲线与天然的人血红蛋白基本相同。Sharma 等(1994)[13]用同源性猪β-球蛋白基因作启动子连接入β球蛋白基因组编码区在转基因猪中得到表达，在一个转基因猪中表达的最高水平是含有24%人血红蛋白(32g/L)和30%人α／猪β杂化血红蛋白(40g/L)。该头猪又繁殖了5头可以高水平表达人血红蛋白的转基因猪。Welancler(1992)等将人体C 蛋白的cDNA 插入小鼠WAP 基因的第一个外显子后构成的基因获得了转基因猪，其表达水平高达1g ／L 。这表明，通过转基因猪大现模生产人类医用稀有蛋白和纯化的人血红蛋白是可能的。随着此项技术研究的深入开展，必将为人类医学和人类健康提供更加广阔的空间。
7. 转基因猪研究的主要基因
7. 1 猪脂肪和肌肉相关基因
研究成果最显著的是两个近乎质量性状基因的肉质控制座位，即氟烷基因（Hal ）和酸肉基因（RN ）。氟烷基因（Hal ）中的氟烷敏感等位基因（Hal n ）已被Fujii et al. [10]和Leach et al. [14] (1991)证明能促进肌肉生长，抑制脂肪沉积并能导致 PSE 肉的发生，已清楚这些效应是由基因本身所致酸肉基因(RN)是另一个可以确定为主效基因的少数基因之一，其中的等位基因 RN -使得猪肉加工后失
重多、引起酸肉状态，并在育种实践中成功应用[15—16]。生长激素基因（GH ）和类胰岛素生长因子基因（IGF-II ）由于在生长轴中调控地位的重要性而曾被当作肌肉生长性状的候选基因[17—20] 。心脏脂肪酸结合蛋白基因（H-FABP ）和脂肪组织脂肪酸结合蛋白基因（A-FABP ）作为肌内脂肪含量（IMF ）的候选标记已引起了国内外学者的关注意，并有部分肯定性的研究结果[21—23] 。此外te PAS等（1999）认为肌细胞生成素基因（MYOG ）和初生重、生长速度及瘦肉率相关[24] 。钙蛋白酶抑制蛋白基因（CAST ）和抑肌素基因（MSTN ）是肌肉生长的重要候选基因之一[25] 。与脂肪酸代谢有关酶类、结合蛋白基因是背膘厚和瘦肉率的重要候选基因，如激素敏感脂肪酶基因（HSL ）、肥胖基因（OB ）等。
综合目前的研究文献看，与肌肉生长或脂肪沉积相关的QTL 在1、2、3、4、6、7、9、12、13、15和 18号染色体上均有发现。在这些研究中，QTL 的加性效应及在染色体上的位置的重复性不高、稳定性差，基因产生的生物学效应的分子机制多基于人为推测。除了氟烷基因（Hal ）和酸肉基因（RN ）这类近乎质量性状基因的主基因外，对于肌肉生长、脂肪沉积这类典型数量性状的研究尚没有普遍认可的结果，所鉴定的基因或标记还远达不到分子育种应用的程度。
7.2 猪抗病相关基因
ETEC F4有3种抗原类型(F4ab, F4ac, F4ad)。F4ac 受体被定位于猪13号染色体的微卫星标记SW207与SW225之间，按孟德尔型两等位基因遗传，显性基因S 控制有受体，猪只表现对F4ac 敏感型； 隐性基因s 为无受体，表现为抗性型。目前的研究表明，与F4ac 受体连锁的转铁蛋白基因和微卫星SW458可望作为ETECF4抗性选育的遗传标记[26—27]。ETEC F18受体的候选基因是α(1,2)岩藻糖转移酶基因1(FUT1)，定位于猪染色体6q1.1，在第307位碱基发生了由G 改变为A 的点突变。GG 型为敏感型, 呈显性遗传； AA 型为抗性型，呈隐性遗传，且显示出对肉质和胴体性状的正遗传效应，这对在抗病选育中利用该基因很有利[28]。
杀菌通透性增强蛋白(BPI)是人和哺乳动物内源性阳离子蛋白质，它存在于多形核白细胞的嗜苯胺蓝颗粒中，首次由Weiss 等[29]从人中性粒细胞中分离纯化得到。它具有很强的杀革兰氏阴性菌活性、中和内毒素活性和调理作用。对猪源BPI 的体内外生物活性研究显示其具有相同的作用。对不同猪种BPI 基因进行RFLP 分析，其外显子4和10存在多态性。通过攻毒试验表明，其基因型与猪沙门氏菌的易感性有关。其基因型是否对其他细菌具有抗性，目前还不清楚。
以NRAMP1基因作为猪抗病力候选基因的研究中，Christopher 等[30]发现猪NRAMP1基因存在5个多态性位点，通过攻毒试验表明其基因型与猪沙门氏菌的易感性有关。Sun 等[31]研究显示所测试猪品种中的NRAMP1等位基因频率差异很大， A 等位基因只在母系(白色) 中存在，相应的C 等位基因只在公猪(有色) 品种发现。猪的不同NRAMP1基因型与抗病力差异之间的关系， 以及对不同病原菌显示的抗性怎样，还需进一步研究。
有关猪Mx1蛋白抗病毒活性以及其多态性研究的试验，皆显示其具有抵抗某些特定病毒感染的功能或使猪个体产生抗性的可能。Chung 等[32]通过急性感染猪繁殖呼吸综合症病毒(PRRSV)的猪细胞INF-α和Mx1的表达研究，发现INF-α和Mx1对宿主早期抵抗PRRSV 的感染有很重要的作用。Morozumi 等[33]，在不同猪种检测到猪Mx1基因14外显子分别存在一个缺失和一个点突变，他们认为产生缺失的突变有可能成为一种抗黏液病毒的基因型。
8. 转基因猪问题分析及前景的展望
8.1存在问题
转基因猪的研究，在短短的几十年里取得了很大成就，目前，仍处于发展阶段，需要尽快解决的问题有：外源基因导入和检测的方法还需要改进和完善；要改变目前转化率低、整合率低的缺点；要解决如何控制目的基因在体内的定点表 达问题；要改变目前这种获得的转基因数量少且常有畸形的状况；要控制外源基因在转基因猪表达时所出现的时间或空间的问题，即有异位表达和个体发育不适宜阶段表达的问题。
存在这些问题的关键是，我们目前对猪的基因图谱的认识还远远不够，在研究中难免有盲目性，而且，我们常常只注意对局部的某个基因和器官的研究，而没有看到整体的功能。
随着时间的推移和科学技术的发展，我们必定会解决这一系列的问题，转基因猪的研究将会取得更卓越的成绩，必将为人类带来更大的利益。
8.2 前景及展望
从1985年Hammer 等得到第1批转基因猪到现在，有关转基因猪的研究已有20几年的历史，转基因猪(Transgenic swine)是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因内稳定整合并能稳定表达的一类动物。它的研究建立在经典遗传学、分子遗传学、结构遗传学和DNA 重组技术的基础之上。相比传统的育种方式转基因，转基因技术的出现己在基因功能及表达研究、动物品种改良及新品种培育、人类疾病模型建立、器官移植材料供应、珍贵医药用蛋白生产等各方面显示出巨大的优越性和广阔的应用前景。从转基因猪的诞生至今20年时间里，转基因猪的研究经历了起步期、平台期、发展期的历程。近几年来，随着核移植等转基因技术的不断完善和分子生物学的迅猛发展，转基因猪的研究进展很快。将转基因猪技术研究与家畜育种学、医药学和市场研发等学科密切结合，将满足市场对高产优质的家畜育种、人类器官移植供体和动物生物反应器多方面的需求，前景十分美好。
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致 谢
在论文完成之际，我首先向关心帮助和指导我的指导老师杨海老师表示衷心的感谢并致以崇高的敬意！在学校的学习生活即将结束，回顾四年来的学习经历，面对现在的收获，我感到无限欣慰。为此，我向热心帮助过我的所有老师和同学表示由衷的感谢! 在论文工作中，遇到了许许多多这样那样的问题，有的是专业上的问题，有的是论文格式上的问题，一直得到杨海老师的亲切关怀和悉心指导，使我的论文可以又快又好的完成，杨海老师以其渊博的学识、严谨的治学态度、求实的工作作风和他敏捷的思维给我留下了深刻的印象，我将终生难忘我的指导老师对我的亲切关怀和悉心指导，再一次向他表示衷心的感谢，感谢他为学生营造的浓郁学术氛围，以及学习、生活上的无私帮助! 值此论文完成之际，谨向杨海老师致以最崇高的谢意! 最后，衷心地感谢在百忙之中评阅论文和参加答辩的各位专家、教授!
Progress in Transgenic Swine
Department of Chemistry and Material science Chemistry and Biology Number ：2009280115 Author ：Tang Hailin Director:Yang Hai
Abstract: Transgenic animal is one of the hotspots in biology, its composition by changing the animal to animal genetic, transformation according to the will of the people. Because of swine in anatomy, organization, physiology and metabolism are closest to humans, and is a kind of important livestock, so the study of transgenic pig has been paid more and more attention. This paper reviews the technical methods used, transgenic pig to pig production and the role of transgenic pig analysis and Prospect of knowledge, analysis of core technologies through research on genetic breeding and organ transplantation, will greatly promote the research and industrialization with some excellent characteristics of transgenic cloned pigs, for the future to accelerate the genetic traits of pigs in China were genetically modified, enhancing the production performance, and lay the foundation for studying the animal models of human disease and transgenic pigs as organ donors for humans, in order to transgenic pigs to provide reference for researchers.
Keyword: swine; transgene; research progress
衡阳师范学院
毕业论文（设计）
题 目： 所 在 系： 化学与材料科学系 专 业： 化学生物学 学 号： 作者姓名： 指导教师：
2013年5月12日
转基因猪研究进展
化学与材料科学系 化学生物学专业
学号：2009280115 唐海林 指导老师：杨 海
摘 要：转基因动物是目前生物领域的研究热点之一，该技术可以通过改变动物的遗传组成，使动物按照人们的意愿进行表现。由于猪在解剖、组织、生理和营养代谢等方面均与人类最接近，又是一种重要家畜，所以转基因猪的研究越来越受重视。本文综述了转基因猪的常用技术方法、对猪生产的作用以及对转基因猪的问题分析和前景展望等方面的知识，分析得出通过研究遗传育种和器官移植的核心技术，将极大地促进含多种优良性状的转基因克隆猪的研究与产业化，为今后加速我国对猪的遗传性状进行转基因改良，提高其生产性能，并制作用于人类疾病动物模型及作为人类器官移植供体的转基因猪研究奠定基础，旨在为转基因猪的研究人员提供参考。
关键词：猪；转基因；研究进展
目录
1. 引言........................................................................................................................................1
2. 猪的主要品种概况................................................................................................................1
3. 转基因猪的研究进展............................................................................................................2
4. 猪的转基因技术概况............................................................................................................3 4.1 显微注射法 . ...................................................................................................................................... 3
4.2 精子载体法 . ....................................................................................................................................... 4
4.3 体细胞核移植法 . ............................................................................................................................... 4
4.4 胚胎干细胞介导法 . ........................................................................................................................... 5
5. 转基因猪的检测方法............................................................................................................5
5.1 PCR 法 ............................................................................................................................................... 5
5.2 DNA 斑点杂交 .................................................................................................................................. 5
5.3 Southern 印迹法 ................................................................................................................................ 6
5.4 性状（表型）检测 . ........................................................................................................................... 6
6. 转基因技术对猪生产的作用................................................................................................6
6.1 提高猪的生产性能 . ........................................................................................................................... 6
6.2 提高猪的抵抗力和适应性 . ............................................................................................................... 7
6.3 制作用于人类疾病动物模型 . ........................................................................................................... 7
6.4作为人类器官移植供体 . .................................................................................................................... 7
6.5用作生物反应器 . ................................................................................................................................ 8
7. 转基因猪研究的主要基因......................................................................................................8
7.1 猪脂肪和肌肉相关基因 . ................................................................................................................... 8
7.2 猪抗病相关基因 . ............................................................................................................................... 9
8. 转基因猪问题分析及前景展望..........................................................................................10
8.1 存在问题 . ......................................................................................................................................... 10
8.2前景及展望 . ...................................................................................................................................... 11
参考文献...................................................................................................................................12
致谢...........................................................................................................................................15 Abstract .....................................................................................................................................16
1. 引言
在农业中养猪生产占有极其重要的地位，是国民经济的重要组成部分，而提高养猪生产水平的关键因素是品种。据美国农业部(USDA)1996年对美国50年来畜牧生产中各种科学技术所起作用的总结，品种改良的作用居各项技术之首，占到40%，远远高于营养饲料(20%)、疾病防治(15%)和繁殖行为(10%)等[1]。在养猪生产中也是如此这就是发达国家对遗传育种大力度科技投入的主要原因。这就说明：谁把握住遗传育种的核心技术，谁就占有最大份额的市场。中国虽然是世界养猪第一大国核心种猪来源却长期依赖进口长期处于―引种→维持→退化→再引种‖的不良循环[2]，导致整个繁育体系受制于其他养猪先进国家，在全球经济一体化时代对我国这样的养猪大国来说是非常不利的。而转基因技术的出现，使猪育种的传统支柱路线发生重大转变，因此从这个角度加大对猪育种方面的研究对于提高我国养猪生产水平有着重要意义。
2. 猪的主要品种概况
世界猪的品种，文献报道过的共约300个，其中我国猪品种153个约占全世界的一半。育成品种主要产于欧美两洲，特别是英国、美国、丹麦、苏联等国的猪种，数量较多，历史较久，影响较大。但目前，在国际上分布广而影响较大的只有十多个品种，其中又以长白猪、约克夏、汉普夏、杜洛克、皮特兰、拉康白等几个品种较为突出[3]。在亚洲，各国有不少适应于当地自然条件的地方猪种。尤其是我国，我国拥有地方猪品种64个，为世界之首，包括东北民猪、香猪、太湖猪、金华猪、莆田黑猪、西北八眉猪、荣昌猪、藏猪等。澳非两洲，养猪数量不多，猪的品种则大部分有欧美国家输入。
目前，世界猪品种资源的保存和利用存在着两种倾向。发达国家随着各国经济的发展，人们对蛋白质食品需求量的增加，在家畜育种方面，一直把高瘦肉率和高生长速度作为选种的主要目标，高产品种或专门化品系大量涌现，应用人工授精进行大规模杂交改良，致使原有地方品种迅速减少。发展中国家，虽有较丰富的猪种资源，但由于保种不当和盲目引进外来品种杂交，也造成原有品种数量
锐减和质量下降。这两种倾向都导致世界性的品种资源危机，也就是猪种基因库的枯竭。世界性的品种资源危机，已引起了国际组织和许多国家政府的重视。
世界猪品种的分类方法很多，归纳起来大致有如下十种：
（一）按用途分为瘦肉型、脂肪型、肉脂兼用型三种；
（二）按毛色分为白猪、黑猪、黑白花猪、棕猪四种；
（三）按体成熟迟早分为早熟种、中熟种和晚熟种三种；
（四）按体型大小分为大型猪、中型猪、小型猪三种；
（五）按耳型大小分为大耳猪和小耳猪两种；
（六）按脸形分为大花脸、二花脸和小花脸三种；
（七）按头骨分为直面、凹面、突凹面三种；
（八）按培育程度分为原始种、优良种、改良种三种；
（九）按体质类型分为粗糙型、细致型和结实匀称型三种；
（十）按产地分为华南猪、华北猪、苏联大白猪等。
3. 转基因猪的研究进展
2000年，Polejaeva 等用猪成纤维细胞作为供体细胞获得世界首例体细胞核移植猪。
2001年4月11日，PPL 公司利用表达GFP 基因的猪体细胞成功地克隆出5只―转基因克隆猪‖。
2002年1月2日，PPL 公司培育出有一个ot ．1，3-半乳糖基转移酶基因处于被―关闭‖状态的新型转基因克隆猪。
2002年，L 脚等利用同源重组的方法获得敲除了d ．1，3-半乳糖基转移酶基因的转基因克隆猪。
2003年，英国PPL 公司和ROSLIN 研究所合作成功地克隆出了a ．1，3-半乳糖基转移酶基因双敲除克隆猪。
2005年，韩国忠南大学培育出产生用作抗癌辅助治疗剂的蛋白质(粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子的蛋白质GM-CSF) 转基因克隆猪。
2005年8月8日，中国农业大学获得国内第一例体细胞克隆猪，并获得GFP 转基因猪囊胚，但未见转基因克隆猪出生的报道。
2006年lO 月12日，我们实验室获得国内首例成体体细胞克隆猪，同时也是第一例克隆东北民猪。
2006年12月24日，我们实验室获得国内第一例转基因克隆猪，此克隆猪表达了来自水母的外源基因绿色荧光蛋白(GFP)。
2008年8月，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所和军事医学科学院生物工程研究所合作同样获得了转有ω-3脂肪酸去饱和酶基因的转基因克隆猪。
2008年9月，吉林大学农学部畜牧兽医学院和军事医学科学院第十一所合作，得到了带有抗猪瘟病毒转基因猪的克隆后代，经检测3只克隆猪均带有抗猪瘟病毒基因。
2009年生产高比例的抗原特异性人源抗体的转染色体牛的出生，是转基因动物生产药用蛋白的又一个里程碑。
4. 猪的转基因技术概况
4.1 显微注射法
该技术的基本原理就是用精细的显微注射针将外源基因直接注入猪受精卵的雄原核，使外源基因整合到动物的基因组，从而获得转基因猪。该方法的优点是基因导入确实可靠，基因用量很省。在转基因猪的研究中，显微注射法是最主要的方法之一。但其成功率较低，一般为1%～2%[4]。因此，许多研究者分别从基因构件的设计、显微注射各技术环节的改进与完善等方面进行研究，以期提高生产转基因猪的效率。但是显微注射法操作程序复杂、对胚胎损伤大，对技术、设备要求高，特别是在牛羊猪等有开发应用价值的大型哺乳动物上的低效率(低于1%)[5]，极大地制约了该技术的应用前景。世界上首次报道的转基因猪就是Hammer 等(1985) 用原核注射技术得到的。
4.2 精子载体法
精子载体法相对于显微注射法来讲是最简单易行的方法，可对大量的精子细胞进行处理，且不损伤卵母细胞，在短时间内便能生产出转基因胚胎。大多数研究表明，外源DNA 吸附在精子表面或存在于细胞质中，不能整合到染色体上。但最近意大利科学家将克隆的目的基因与成熟的小鼠精子在缓冲液中孵育15min 后，精子捕获了目的DNA 。目前精子携带外源基因的机理正不断被揭示。Spermdio 等运用精子载体法携带pSV-CAT 基因，通过人工授精, 得到82头仔猪，经检测获得5只转基因仔猪。新疆畜牧科学院绵羊中心农业部畜牧兽医生物技术重点实验室运用精子载体法得到的145头仔猪,8头为转基因猪[6]。
4.3 体细胞核移植法
体细胞核移植是近些年新出现的的一种转基因技术。克隆绵羊―多莉‖的诞生是转基因动物史上的里程碑[7]。其基本的制作过程是：先把外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞的细胞核转移到去核的卵母细胞组成重构胚胎，再把其移植到假孕母体，待其妊娠、分娩后便可获得转基因的克隆动物。这种方法具有相对较大的优越性：成功率高，约是显微注射法的2 倍；可以预先鉴定供体细胞与外源基因是否融合；可对基因整合状况及整合位点进行鉴定和评估；可以预测基因的表达情况；没有位置效应，节省供体和受体动物的数量及费用。
尽管如此，猪的体细胞克隆效率仍然很低，许多环节的机制尚不清楚。2000 年，Polejaeva 等采用的二步移植法(Double nuclear transfer) 也获得了体细胞核移植仔猪。该法使用M Ⅱ期卵母细胞在受精时已被精子激活，从而避免了人工电激活对NT 胚造成的不良影响。因此，被认为比较适合用于猪成体细胞核移植。2001 年，Booth 等将除去透明带的卵母细胞用作猪体细胞核移植的受体，并证明了无透明带技术也可应用于猪的核移植。2002 年，Yin 等报道用Demecolcine 处理M Ⅱ期卵母细胞，简化了技术方法，具有一定的实用意义。美国密苏里大学通过克隆技术培育出了含荧光水母基因的小猪。2006 年12 月24 日，东北农业大学刘忠华教授的转基因克隆猪获得成功，3 头含绿色荧光蛋白的转基因克隆猪自然分娩，这是继美国、韩国和日本之后第四例成功通过体细胞核移植方式生产出的绿色荧光蛋白转基因克隆猪。
4.4 胚胎干细胞介导法
胚胎干细胞(ES)是从早期胚胎的内细胞团里分离出来的, 能在体外培养的一种高度未分化的细胞。将ES 细胞植入动物囊胚后, 可参与宿主胚胎的形成, 直至达到种系嵌合[8]。因此, 可将其作为一种载体, 把外源DNA 导入ES 细胞就可以实现由此发育而成的转基因动物。ES 细胞在严谨的生长条件下, 在滋养层细胞上可以在较长时间内以稳定的细胞系形式维持在未分化状态, 因而可以像普通的体细胞那样通过磷酸钙沉淀、逆转录病毒感染和电穿孔等方法转染, 进而筛选细胞克隆。
除上述方法外，还有逆转录病毒载体法、基因打靶法、电脉冲法、磷酸钙共沉淀法、电穿孔法等转基因方法。
5. 转基因猪的检测方法
检测转基因动物根本方法是进行核酸检测，通过分子生物学和细胞生物学手段分析基因整合状况、转录活性、表达活性和遗传稳定性等指标。除了以上方法外，还需要从遗传学上，动物整体水平上观察表型的改变，分析基因型对动物整体性状和生理功能的影响，来进一步鉴定基因的性质。具体主要有以下几种方法：
5.1 PCR 法
PCR 法是在体外扩增外源基因特异DNA 片段，从而对外源基因进行检测。其基本原理同体内DNA 的复制一样，经过变性、退火及延伸三个过程，在短时内可将两引物间模板扩增至百万倍。在PCR 反应中这个过程是靠温度的调整和聚合酶的共同作用完成的。由于PCR 所需样品少，灵敏度高而且操作简便因而是最长用的转基因动物外源基因整合、表达的检测方法。但该方法要求待分析的基因组DNA 样品应尽可能纯化且无污染，否则会干扰本反应，出现假阳性和重复性差。
5.2 DNA 斑点杂交
首先将待测的DNA 样品变性，点在尼龙膜（或硝酸纤维素膜）等固体支持物上使其附着，然后与外源基因特异性探针杂交，从而在样品中检测外源基因的有无。为避免假阳性，外源基因的探针应与与内源基因组DNA 无同源性，同时为避免假阴性，可用质粒DNA 作阳性对照。该方法对样品纯度要求低、简单、
快速、经济、灵敏度高（能从2μg～5μg的基因组DNA 中检出单拷贝基因），尤其对大批子代动物的粗筛颇具优越性，应作为首选方法。
5.3 Southern 印迹法
Southern Blot法是通过外源基因特异性探针与已附着于固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜) 上的经酶切、电泳分离的变性DNA 链杂交，检测样品中是否存在外源基因目的DNA 片段的方法。该方法灵敏准确，因而广泛用于转基因动物的筛选和鉴定。但此方法费用高，操作烦琐，且对DNA 样品的质量和纯度要求较高。
5.4 性状（表型）检测
通过转基因技术获得的转基因猪在其体型、生长速率、瘦肉率等方面都比一般品种的猪要优越，可以通过观察转基因猪的生长速率、体型及相对于一般品种的猪的瘦肉率判定是否为转基因猪。1988年，澳大利亚scammark 教授将猪生长激素基因注入猪的受精卵，获得了―超级猪‖，这是生物工程在家畜基因工程育种上的一大突破。我国的陈永福等用融合基因omT/pGH进行基因转移，转基因猪的生长速度提高11.8% ～ 14.2%，饲料利用率提高10%，瘦肉率也有所增加。我国在―七五‖，―八五‖期间获生长激素转基因猪的第2、3、4代共215头。并初步建立生产转基因猪的技术体系。转基因猪核心群的生长水平比非转基因猪提高20%，生产效率提高5%。
6. 转基因技术对猪生产的作用
6.1 提高猪的生产性能
转基因技术应用打破了自然界不同种群繁殖的种间隔离，使基因能在中间进行流动和传递，实现了动物种间遗传物质的重组和交换，能够培育出生产性能突出的优良品种。Hamme 等将人的生长素基因导入猪的受精卵获得成功。同窝的转基因猪和非转基因猪比较，生长速度和饲料利用率显著提高，胴体脂肪率也明显下降[9]。我国陈永福、魏庆信等也取得了类似的结果，用自己构建的融合基因DMT/PGH 获得了转基因猪，其生长速度提高了11.8% ～ 14.2%，饲料利用率提高了10%，但这些转基因猪在获得生产性状提高的同时，也留下了一些后遗症，如关节病、肾病及生殖能力丧失等。
6.2 提高猪的抵抗力和适应性
当今威胁养殖业首要问题就是疾病，综合性病毒感染成为发病的主要原因。转基因技术的使用可以使某些抗疾病的基因表达，增强他们的抵抗力。另外猪的应急性反应也是猪生病的重要原因，如果可以通过转基因技术的实施，可以表达适应性强的基因。因此可以降低动物的发病率。1993年，Suetlali 等将含有编码小鼠Mxl 蛋白的cDNA 的3种基因构件分别转移到猪体内中，获得Mx1-转基因猪, 但基因转移效率很低[10]。
6.3 制作用于人类疾病动物模型
利用转基因动物建立人类疾病模型，来研究探索人类遗传性疾病的机理及治疗方法，是转基因动物近年来研究的热点之一。到目前为止，建立转基因小鼠模型的遗传性疾病有：动脉粥样硬化病、镰刀形细胞贫血症、老年痴呆症，自身免疫病，淋巴系统病，皮炎和前列腺癌等。猪已被广泛用于生物医学研究，包括皮肤、消化器管和心血管系统。这是因为猪与人类具有许多生物学相似性。尽管转基因猪的人类猪疾病模型的研究报道较少，但今后可能成为研究和治疗人类疾病的理想材料。2008 年G.A.Wyszyrnska-Pawelec 等人成功进行了转基因猪做为人骨髓贡献者的研究。同样，2008 年C. Costa 等人进行了转基因猪的软骨作为今后临床应用的材料的研究。
6.4作为人类器官移植供体
很久以前人们就希望将动物的器官组织移植到人体内，挽救人们的生命和补救器官缺陷，但异种器官移植的一个主要障碍就是由补体介导的超敏排斥反应。为了克服异体移植的排异现象，近来提出了两条解决途径：其一是清除受体血液中的补体，其二是通过转基因技术，克隆受体的补体调节蛋白基因并转移至供体动物基因组中，使之在供体心血管内上皮表达。采用这种受体的先天性补体系统缺陷或用抑制剂抑制受体的补体系统就可延长异种器官移植存活, 从而可以克服异种器官移植而引起的排异反应。英国剑桥伊姆朗公司1993 年6 月宣布已培育成功37 头具有人类基因的转基因猪。这种猪含加速人体基因退化因子，可防止人们对新移植器官产生排斥现象。2008年Ekser B 等人研究了异种器官的应用，猪的器官转移到灵长类动物身上的应用获得了很好的结果。
6.5用作生物反应器
转基因动物的问世，为利用基因工程手段获得低成本，高活性和高表达的产物开辟了一条重要途径。人们可以将编码罕见的，具有医用价值的人体蛋白基因转移给猪，使其在猪体的血液或乳腺等组织中表达，从而可以在乳汁或血液中获取转基因表达产物。这些表达产物不仅产量高，易提纯且具有稳定的生物活性。作为生物反应器的转基因猪又可无限扩繁，且饲养成本低。目前，生物反应器主要利用转基因动物的乳腺组织和血液组织进行定位表达，特别是利用乳腺组织生产具有生物活性的多肽药物和具有特殊营养价值的蛋白质，已经逐步形成一个新兴的转基因高技术、高效益的制药产业。近年来，这方面的研究已获得了突破性的进展。Wall 等(1991)[11]将小鼠编码乳清酸蛋白(WAP)的基因转移给猪，通过检测三头转基因猪整个泌乳期发现鼠的WAP 在奶中的浓度为1 g ／L ，相应的mRNA 只存在于乳腺中。Swanson [12]等(1992)用β-球蛋白的4个核酸酶I 的高敏位点连接入α-球蛋白基因的两个拷贝和人β-球蛋白基因的一个拷贝组成的融合基因的转基因猪与鼠的原型相似，产生的血红蛋白二聚体占血红蛋白总量的9%，且重组人血红蛋白的氧平衡曲线与天然的人血红蛋白基本相同。Sharma 等(1994)[13]用同源性猪β-球蛋白基因作启动子连接入β球蛋白基因组编码区在转基因猪中得到表达，在一个转基因猪中表达的最高水平是含有24%人血红蛋白(32g/L)和30%人α／猪β杂化血红蛋白(40g/L)。该头猪又繁殖了5头可以高水平表达人血红蛋白的转基因猪。Welancler(1992)等将人体C 蛋白的cDNA 插入小鼠WAP 基因的第一个外显子后构成的基因获得了转基因猪，其表达水平高达1g ／L 。这表明，通过转基因猪大现模生产人类医用稀有蛋白和纯化的人血红蛋白是可能的。随着此项技术研究的深入开展，必将为人类医学和人类健康提供更加广阔的空间。
7. 转基因猪研究的主要基因
7. 1 猪脂肪和肌肉相关基因
研究成果最显著的是两个近乎质量性状基因的肉质控制座位，即氟烷基因（Hal ）和酸肉基因（RN ）。氟烷基因（Hal ）中的氟烷敏感等位基因（Hal n ）已被Fujii et al. [10]和Leach et al. [14] (1991)证明能促进肌肉生长，抑制脂肪沉积并能导致 PSE 肉的发生，已清楚这些效应是由基因本身所致酸肉基因(RN)是另一个可以确定为主效基因的少数基因之一，其中的等位基因 RN -使得猪肉加工后失
重多、引起酸肉状态，并在育种实践中成功应用[15—16]。生长激素基因（GH ）和类胰岛素生长因子基因（IGF-II ）由于在生长轴中调控地位的重要性而曾被当作肌肉生长性状的候选基因[17—20] 。心脏脂肪酸结合蛋白基因（H-FABP ）和脂肪组织脂肪酸结合蛋白基因（A-FABP ）作为肌内脂肪含量（IMF ）的候选标记已引起了国内外学者的关注意，并有部分肯定性的研究结果[21—23] 。此外te PAS等（1999）认为肌细胞生成素基因（MYOG ）和初生重、生长速度及瘦肉率相关[24] 。钙蛋白酶抑制蛋白基因（CAST ）和抑肌素基因（MSTN ）是肌肉生长的重要候选基因之一[25] 。与脂肪酸代谢有关酶类、结合蛋白基因是背膘厚和瘦肉率的重要候选基因，如激素敏感脂肪酶基因（HSL ）、肥胖基因（OB ）等。
综合目前的研究文献看，与肌肉生长或脂肪沉积相关的QTL 在1、2、3、4、6、7、9、12、13、15和 18号染色体上均有发现。在这些研究中，QTL 的加性效应及在染色体上的位置的重复性不高、稳定性差，基因产生的生物学效应的分子机制多基于人为推测。除了氟烷基因（Hal ）和酸肉基因（RN ）这类近乎质量性状基因的主基因外，对于肌肉生长、脂肪沉积这类典型数量性状的研究尚没有普遍认可的结果，所鉴定的基因或标记还远达不到分子育种应用的程度。
7.2 猪抗病相关基因
ETEC F4有3种抗原类型(F4ab, F4ac, F4ad)。F4ac 受体被定位于猪13号染色体的微卫星标记SW207与SW225之间，按孟德尔型两等位基因遗传，显性基因S 控制有受体，猪只表现对F4ac 敏感型； 隐性基因s 为无受体，表现为抗性型。目前的研究表明，与F4ac 受体连锁的转铁蛋白基因和微卫星SW458可望作为ETECF4抗性选育的遗传标记[26—27]。ETEC F18受体的候选基因是α(1,2)岩藻糖转移酶基因1(FUT1)，定位于猪染色体6q1.1，在第307位碱基发生了由G 改变为A 的点突变。GG 型为敏感型, 呈显性遗传； AA 型为抗性型，呈隐性遗传，且显示出对肉质和胴体性状的正遗传效应，这对在抗病选育中利用该基因很有利[28]。
杀菌通透性增强蛋白(BPI)是人和哺乳动物内源性阳离子蛋白质，它存在于多形核白细胞的嗜苯胺蓝颗粒中，首次由Weiss 等[29]从人中性粒细胞中分离纯化得到。它具有很强的杀革兰氏阴性菌活性、中和内毒素活性和调理作用。对猪源BPI 的体内外生物活性研究显示其具有相同的作用。对不同猪种BPI 基因进行RFLP 分析，其外显子4和10存在多态性。通过攻毒试验表明，其基因型与猪沙门氏菌的易感性有关。其基因型是否对其他细菌具有抗性，目前还不清楚。
以NRAMP1基因作为猪抗病力候选基因的研究中，Christopher 等[30]发现猪NRAMP1基因存在5个多态性位点，通过攻毒试验表明其基因型与猪沙门氏菌的易感性有关。Sun 等[31]研究显示所测试猪品种中的NRAMP1等位基因频率差异很大， A 等位基因只在母系(白色) 中存在，相应的C 等位基因只在公猪(有色) 品种发现。猪的不同NRAMP1基因型与抗病力差异之间的关系， 以及对不同病原菌显示的抗性怎样，还需进一步研究。
有关猪Mx1蛋白抗病毒活性以及其多态性研究的试验，皆显示其具有抵抗某些特定病毒感染的功能或使猪个体产生抗性的可能。Chung 等[32]通过急性感染猪繁殖呼吸综合症病毒(PRRSV)的猪细胞INF-α和Mx1的表达研究，发现INF-α和Mx1对宿主早期抵抗PRRSV 的感染有很重要的作用。Morozumi 等[33]，在不同猪种检测到猪Mx1基因14外显子分别存在一个缺失和一个点突变，他们认为产生缺失的突变有可能成为一种抗黏液病毒的基因型。
8. 转基因猪问题分析及前景的展望
8.1存在问题
转基因猪的研究，在短短的几十年里取得了很大成就，目前，仍处于发展阶段，需要尽快解决的问题有：外源基因导入和检测的方法还需要改进和完善；要改变目前转化率低、整合率低的缺点；要解决如何控制目的基因在体内的定点表 达问题；要改变目前这种获得的转基因数量少且常有畸形的状况；要控制外源基因在转基因猪表达时所出现的时间或空间的问题，即有异位表达和个体发育不适宜阶段表达的问题。
存在这些问题的关键是，我们目前对猪的基因图谱的认识还远远不够，在研究中难免有盲目性，而且，我们常常只注意对局部的某个基因和器官的研究，而没有看到整体的功能。
随着时间的推移和科学技术的发展，我们必定会解决这一系列的问题，转基因猪的研究将会取得更卓越的成绩，必将为人类带来更大的利益。
8.2 前景及展望
从1985年Hammer 等得到第1批转基因猪到现在，有关转基因猪的研究已有20几年的历史，转基因猪(Transgenic swine)是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因内稳定整合并能稳定表达的一类动物。它的研究建立在经典遗传学、分子遗传学、结构遗传学和DNA 重组技术的基础之上。相比传统的育种方式转基因，转基因技术的出现己在基因功能及表达研究、动物品种改良及新品种培育、人类疾病模型建立、器官移植材料供应、珍贵医药用蛋白生产等各方面显示出巨大的优越性和广阔的应用前景。从转基因猪的诞生至今20年时间里，转基因猪的研究经历了起步期、平台期、发展期的历程。近几年来，随着核移植等转基因技术的不断完善和分子生物学的迅猛发展，转基因猪的研究进展很快。将转基因猪技术研究与家畜育种学、医药学和市场研发等学科密切结合，将满足市场对高产优质的家畜育种、人类器官移植供体和动物生物反应器多方面的需求，前景十分美好。
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致 谢
在论文完成之际，我首先向关心帮助和指导我的指导老师杨海老师表示衷心的感谢并致以崇高的敬意！在学校的学习生活即将结束，回顾四年来的学习经历，面对现在的收获，我感到无限欣慰。为此，我向热心帮助过我的所有老师和同学表示由衷的感谢! 在论文工作中，遇到了许许多多这样那样的问题，有的是专业上的问题，有的是论文格式上的问题，一直得到杨海老师的亲切关怀和悉心指导，使我的论文可以又快又好的完成，杨海老师以其渊博的学识、严谨的治学态度、求实的工作作风和他敏捷的思维给我留下了深刻的印象，我将终生难忘我的指导老师对我的亲切关怀和悉心指导，再一次向他表示衷心的感谢，感谢他为学生营造的浓郁学术氛围，以及学习、生活上的无私帮助! 值此论文完成之际，谨向杨海老师致以最崇高的谢意! 最后，衷心地感谢在百忙之中评阅论文和参加答辩的各位专家、教授!
Progress in Transgenic Swine
Department of Chemistry and Material science Chemistry and Biology Number ：2009280115 Author ：Tang Hailin Director:Yang Hai
Abstract: Transgenic animal is one of the hotspots in biology, its composition by changing the animal to animal genetic, transformation according to the will of the people. Because of swine in anatomy, organization, physiology and metabolism are closest to humans, and is a kind of important livestock, so the study of transgenic pig has been paid more and more attention. This paper reviews the technical methods used, transgenic pig to pig production and the role of transgenic pig analysis and Prospect of knowledge, analysis of core technologies through research on genetic breeding and organ transplantation, will greatly promote the research and industrialization with some excellent characteristics of transgenic cloned pigs, for the future to accelerate the genetic traits of pigs in China were genetically modified, enhancing the production performance, and lay the foundation for studying the animal models of human disease and transgenic pigs as organ donors for humans, in order to transgenic pigs to provide reference for researchers.
Keyword: swine; transgene; research progress