特殊磷脂酶产生菌的筛选研究总结报告
摘要：磷脂酶A1是专一水解天然磷脂sn一1位酰基的酶，可以得到Sn-2~基溶血磷脂和脂肪酸。磷脂酶在商业上可用于在炼油过程(油脱胶)磷脂的去除。本研究从土样采集环节即针对磷脂酶酶的特点，选择特异性生境（油菜、花生等富含脂质的根际土壤或豆腐乳等）进行土壤采集，依据细菌、放线菌、真菌的特点分别设置适宜的培养条件进行目标菌株筛选，并采用平板透明圈法以及溴甲酚紫显色法建立筛选模型，对初筛性能优秀的菌株，进行复筛。 关键词：磷脂酶A1；初筛；复筛；GPC
引言
磷脂酶是脂肪酶的一种，同时具有脂肪酶活性和磷脂酶活性，但是在一定的反应体系中，会优先表现出一种特定的酶活，磷脂酶可以催化酯交换、酯转移、水解等反应，对磷脂的结构进行各种改变或修饰，得到不同结构和用途的磷脂，所以在油脂工业中广泛应用。磷脂酶A1(PLA1，EC 3．1．1．32)催化磷脂第一位酯酰键的水解，生成溶血磷脂和脂肪酸，在工业上主要用于食品和非食品的磷脂乳化剂的修饰，增加油／水混合物的乳化以及植物油脱胶等。同传统的脱胶方法相比，酶法脱胶可大大节约化学物质的消耗量，几乎不产生废水，是一种经济节约、高效稳定、绿色环保的具有国际领先水平的油脂脱胶方法。PLA1在烘焙应用中对于提高生面团或烘焙产品质量特别有用。此外，PLA1水解卵磷脂的产物甘油磷酸胆碱具有调节多种细胞机制的生理功能，因而引起人们特殊的研究兴趣。本研究从土样采集环节即针对磷脂酶酶的特点，选择特异性生境（大豆、油菜、花生等富含脂质的根际土壤或炼油厂周边的土壤）进行土壤采集，依据细菌、放线菌、真菌的特点分别设置适宜的培养条件进行目标菌株筛选，并采用平板透明圈法以及溴甲酚紫显色法建立筛选模型，对初筛性能优秀的菌株，模拟实际生产过程，用非水相反应体系进行复筛。
1.土样的采取
针对磷脂酶的特点，为了提高获得磷脂酶的可能性，我们组采用的是花生地，菜园地，油菜地的土壤以及豆腐乳来做筛选。以下是我们组做过的土壤及数量：
2.菌株的分离纯化
2.1 培养基的制备
NA（分离细菌：加入放线菌酮以抑制真菌生长）：(w/v)牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1.0%，NaCl 0.5 %，琼脂 2.0%，pH 7.2；
高氏一号（分离放线菌：加入放线菌酮以抑制真菌生长）：(w/v) KNO3 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.05%，NaCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05 %，FeSO4·7H2O 0.001 %，琼脂 2.0%，pH 7.2；
PDA（分离真菌：加入青霉素以抑制细菌生长）：(w/v)马铃薯20.0%，葡萄糖2.0%，琼脂2.0%；(注：因为土豆培养基的制备比较麻烦，后面我们使用的是买来的孟加拉红培养基）
放线菌分离纯化图片
细菌分离纯化图片
真菌分离纯化图片
3.产生菌的初筛
3.1初筛第一步
将纯化的待筛菌株接种于筛选培养基上（原培养基的碳源和氮源均改为大豆卵磷脂），培养基配方如下：
细菌筛选培养基：(w/v) 大豆卵磷脂 1.0%，NaNO3 1.0%，K2HPO4·3H2O 0.4%，MgSO4·7H2O 0.06%，琼脂 2.0%，pH 7.2；
放线菌筛选培养基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，KNO3 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.05%，NaCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05 %，FeSO4·7H2O 0.001 %，，琼脂 2.0%，pH 7.2；
真菌筛选培养基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，(NH4)2SO4 0.2%，NaH2PO4·H2O 0.05%， K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2 0.10%，琼脂 2.0%，pH 7.2；
初筛第一步结果如下：
细菌初筛平板
真菌初筛平板
放线菌初筛平板
3.2 初筛第二步
再将初筛第一步长出的菌株接种于将含有溴甲酚紫的初筛平板培养，由于脂肪酸与溴甲酚紫（溴甲酚紫变色范围的pH值为5.2-6.8）反应形成黄色的透明圈，通过有无透明圈可以判断菌株在分解卵磷脂时有无产生副产物脂肪酸。培养基配方如下：
细菌筛选培养基：(w/v) 大豆卵磷脂 1.0%，NaNO3 1.0%，K2HPO4·3H2O 0.4%，MgSO4·7H2O 0.06%，琼脂 2.0%，溴甲酚紫1%,pH 7.2；
放线菌筛选培养基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，KNO3 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.05%，NaCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05 %，FeSO4·7H2O 0.001 %,琼脂 2.0%，溴甲酚紫1%，pH 7.2；
真菌筛选培养基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，(NH4)2SO4 0.2%，NaH2PO4·H2O 0.05%， K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2 0.10%，溴甲酚紫1%，琼脂 2.0%，pH 7.2；
细菌含溴甲酚紫的筛选平板
放线菌含溴甲酚紫的初筛平板
3.产生菌的复筛（难点）
3.1 发酵
（1）液体培养基的制备，每瓶大概100ml左右，具体配方如下： 细菌液体培养基：(w/v) 大豆卵磷脂 1.0%，NaNO3 1.0%，K2HPO4·3H2O 0.4%，MgSO4·7H2O 0.06%，pH 7.2；
放线菌液体培养基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，KNO3 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.05%，NaCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05 %，FeSO4·7H2O 0.001 %，pH 7.2；
真菌液体培养基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，(NH4)2SO4 0.2%，NaH2PO4·H2O 0.05%， K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2 0.10%，pH 7.2；（
（2）接入菌株，放入摇床恒温发酵 （3）发酵液离心，去上清液（胞外酶） 注：刚开始老师要求我们不仅要做胞外酶还要做胞内酶，所以还需要用清水洗涤细胞沉淀两次，然后用超声波进行破碎。 3.2 反应体系的构建
特注：由于实验室并没有可以让我们用来复筛的成熟方法，所以产生菌的复筛工作是我们此次创新实验的难点。以下描述体现的是我们组摸索成熟复筛方法的过程： 方法一（2014年11月至12月）：
A.底物的配制：2.0g卵磷脂:6.3ml异辛烷:0.9ml正丁醇 B.微乳体系的构建
反应组： 4ml底物+600µl发酵液
阴性对照：4ml底物+600µl缓冲液（ph=4的CH3COOH/CH3COONa缓冲液） 阳性对照：4ml底物+200µl标准酶液+400µl缓冲液
将装有反应液的塑料管放入55℃250rpm摇床中16h（注意每次反应时间保持一致） C.取样点板
(1)由于反应液比较粘稠，用毛细管点不上，所以对反应液进行了如下处理：取小离心管，每只分别加入200µl反应液+400µl甲醇+400µl蒸馏水，摇匀5min后，然后离心5min，取下清液点板。
(2) 我们使用的是GF254硅胶板，每个板上除了点上反应组之外，还需点上阳性组，阴性组和GPC标准，点完后用吹风机吹干
D展开
展开剂：CH3OH:CH2Cl2:H2O 12:7:1
将点好的板放入展开剂中，注意展开剂不能没过板上的点。待展开剂爬到顶端，取出硅胶板吹干后放入碘缸染色15min,观察结果。
结果：该方法反应结果不太理想，我们尝试着用其他的方法 方法二（2015年3月至4月）：
A.底物的配制：10g卵磷脂：100ml水 B.乳化体系的构建
反应组：
2ml底物+30ml发酵液
阴性对照：2ml底物+未接菌种的发酵液
阳性对照：2ml底物+30ml水+200µl标准酶液 上述放55℃,250rpm摇床16h C.取样点板展开
这次我们使用的展开剂是氨水（5mol/l)和正丙醇，但是比例还需要调整，我们试验了以下比例：
氨水（5mol/l)：正丙醇=1:9 氨水（5mol/l)：正丙醇=3：7 氨水（5mol/l)：正丙醇=2:8 氨水（5mol/l)：正丙醇=7:13
经过试验发现比例为3:7的效果最好。
4.实验总结 4.1实验小结
本实验中我们共处理了8份土样（包括三块豆腐乳），分离纯化了167株细菌、44株放线菌、
32株真菌。第一步初筛得到了79株细菌、16株放线菌、8株真菌；第二步初筛得到了24株细菌、9株放线菌、8株真菌。通过对以上的41株菌株的复筛，最终确定菌株LE-1是我们所需要的菌株。下图中LE-1和对照的阳性菌产生了相同的点，而与之对应的阴性菌没有，我们可以初步判断LE_1是我们所需要的特殊磷脂酶产生菌。
4.2菌株LE-1生理生化研究
（1)下图是菌株LE-1的电镜图片，菌丝宽706nm，孢子直径为1.36µm。
菌株LE-1的电镜图片
（2）通过革兰氏染色以及甲基红实验、V-P实验可知菌株LE-1是革兰氏阳性菌
革兰氏染色
甲基红实验结果
V-P实验结果
5.实验中的困难与建议
本实验中最大的困难就是复筛方法的确定，开始我们使用的是微乳体系和组成为CH3OH:CH2Cl2:H2O 12:7:1的展开剂，实验结果并不理想。后来我们开始调整体系为乳化体系，展开剂为氨水（5mol/l)和正丙醇，但是二者的比例仍需我们试验摸索，最后确定氨水（5mol/l)：正丙醇=7:13时的效果最好。由于时间有限，方法还存在很多不足，仍然有许多不完善的的地方需要我们改进。
本实验所有的操作主要是在昇华楼613和620完成，由于菌株的保存需要使用到613的4℃冰箱。但是由于613冰箱老化严重，导致我们保存的菌株经常结冰而没法使用，严重影响到了我们的实验进程。在此向院领导建议，能够完善实验室的相关设施，给我们创新实验提供良好的工作条件。
6.经费使用情况
特殊磷脂酶产生菌的筛选研究总结报告
摘要：磷脂酶A1是专一水解天然磷脂sn一1位酰基的酶，可以得到Sn-2~基溶血磷脂和脂肪酸。磷脂酶在商业上可用于在炼油过程(油脱胶)磷脂的去除。本研究从土样采集环节即针对磷脂酶酶的特点，选择特异性生境（油菜、花生等富含脂质的根际土壤或豆腐乳等）进行土壤采集，依据细菌、放线菌、真菌的特点分别设置适宜的培养条件进行目标菌株筛选，并采用平板透明圈法以及溴甲酚紫显色法建立筛选模型，对初筛性能优秀的菌株，进行复筛。 关键词：磷脂酶A1；初筛；复筛；GPC
引言
磷脂酶是脂肪酶的一种，同时具有脂肪酶活性和磷脂酶活性，但是在一定的反应体系中，会优先表现出一种特定的酶活，磷脂酶可以催化酯交换、酯转移、水解等反应，对磷脂的结构进行各种改变或修饰，得到不同结构和用途的磷脂，所以在油脂工业中广泛应用。磷脂酶A1(PLA1，EC 3．1．1．32)催化磷脂第一位酯酰键的水解，生成溶血磷脂和脂肪酸，在工业上主要用于食品和非食品的磷脂乳化剂的修饰，增加油／水混合物的乳化以及植物油脱胶等。同传统的脱胶方法相比，酶法脱胶可大大节约化学物质的消耗量，几乎不产生废水，是一种经济节约、高效稳定、绿色环保的具有国际领先水平的油脂脱胶方法。PLA1在烘焙应用中对于提高生面团或烘焙产品质量特别有用。此外，PLA1水解卵磷脂的产物甘油磷酸胆碱具有调节多种细胞机制的生理功能，因而引起人们特殊的研究兴趣。本研究从土样采集环节即针对磷脂酶酶的特点，选择特异性生境（大豆、油菜、花生等富含脂质的根际土壤或炼油厂周边的土壤）进行土壤采集，依据细菌、放线菌、真菌的特点分别设置适宜的培养条件进行目标菌株筛选，并采用平板透明圈法以及溴甲酚紫显色法建立筛选模型，对初筛性能优秀的菌株，模拟实际生产过程，用非水相反应体系进行复筛。
1.土样的采取
针对磷脂酶的特点，为了提高获得磷脂酶的可能性，我们组采用的是花生地，菜园地，油菜地的土壤以及豆腐乳来做筛选。以下是我们组做过的土壤及数量：
2.菌株的分离纯化
2.1 培养基的制备
NA（分离细菌：加入放线菌酮以抑制真菌生长）：(w/v)牛肉膏 0.5%，蛋白胨 1.0%，NaCl 0.5 %，琼脂 2.0%，pH 7.2；
高氏一号（分离放线菌：加入放线菌酮以抑制真菌生长）：(w/v) KNO3 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.05%，NaCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05 %，FeSO4·7H2O 0.001 %，琼脂 2.0%，pH 7.2；
PDA（分离真菌：加入青霉素以抑制细菌生长）：(w/v)马铃薯20.0%，葡萄糖2.0%，琼脂2.0%；(注：因为土豆培养基的制备比较麻烦，后面我们使用的是买来的孟加拉红培养基）
放线菌分离纯化图片
细菌分离纯化图片
真菌分离纯化图片
3.产生菌的初筛
3.1初筛第一步
将纯化的待筛菌株接种于筛选培养基上（原培养基的碳源和氮源均改为大豆卵磷脂），培养基配方如下：
细菌筛选培养基：(w/v) 大豆卵磷脂 1.0%，NaNO3 1.0%，K2HPO4·3H2O 0.4%，MgSO4·7H2O 0.06%，琼脂 2.0%，pH 7.2；
放线菌筛选培养基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，KNO3 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.05%，NaCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05 %，FeSO4·7H2O 0.001 %，，琼脂 2.0%，pH 7.2；
真菌筛选培养基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，(NH4)2SO4 0.2%，NaH2PO4·H2O 0.05%， K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2 0.10%，琼脂 2.0%，pH 7.2；
初筛第一步结果如下：
细菌初筛平板
真菌初筛平板
放线菌初筛平板
3.2 初筛第二步
再将初筛第一步长出的菌株接种于将含有溴甲酚紫的初筛平板培养，由于脂肪酸与溴甲酚紫（溴甲酚紫变色范围的pH值为5.2-6.8）反应形成黄色的透明圈，通过有无透明圈可以判断菌株在分解卵磷脂时有无产生副产物脂肪酸。培养基配方如下：
细菌筛选培养基：(w/v) 大豆卵磷脂 1.0%，NaNO3 1.0%，K2HPO4·3H2O 0.4%，MgSO4·7H2O 0.06%，琼脂 2.0%，溴甲酚紫1%,pH 7.2；
放线菌筛选培养基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，KNO3 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.05%，NaCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05 %，FeSO4·7H2O 0.001 %,琼脂 2.0%，溴甲酚紫1%，pH 7.2；
真菌筛选培养基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，(NH4)2SO4 0.2%，NaH2PO4·H2O 0.05%， K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2 0.10%，溴甲酚紫1%，琼脂 2.0%，pH 7.2；
细菌含溴甲酚紫的筛选平板
放线菌含溴甲酚紫的初筛平板
3.产生菌的复筛（难点）
3.1 发酵
（1）液体培养基的制备，每瓶大概100ml左右，具体配方如下： 细菌液体培养基：(w/v) 大豆卵磷脂 1.0%，NaNO3 1.0%，K2HPO4·3H2O 0.4%，MgSO4·7H2O 0.06%，pH 7.2；
放线菌液体培养基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，KNO3 0.1%，K2HPO4·3H2O 0.05%，NaCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05 %，FeSO4·7H2O 0.001 %，pH 7.2；
真菌液体培养基：(w/v) 大豆卵磷脂1.0%，(NH4)2SO4 0.2%，NaH2PO4·H2O 0.05%， K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2 0.10%，pH 7.2；（
（2）接入菌株，放入摇床恒温发酵 （3）发酵液离心，去上清液（胞外酶） 注：刚开始老师要求我们不仅要做胞外酶还要做胞内酶，所以还需要用清水洗涤细胞沉淀两次，然后用超声波进行破碎。 3.2 反应体系的构建
特注：由于实验室并没有可以让我们用来复筛的成熟方法，所以产生菌的复筛工作是我们此次创新实验的难点。以下描述体现的是我们组摸索成熟复筛方法的过程： 方法一（2014年11月至12月）：
A.底物的配制：2.0g卵磷脂:6.3ml异辛烷:0.9ml正丁醇 B.微乳体系的构建
反应组： 4ml底物+600µl发酵液
阴性对照：4ml底物+600µl缓冲液（ph=4的CH3COOH/CH3COONa缓冲液） 阳性对照：4ml底物+200µl标准酶液+400µl缓冲液
将装有反应液的塑料管放入55℃250rpm摇床中16h（注意每次反应时间保持一致） C.取样点板
(1)由于反应液比较粘稠，用毛细管点不上，所以对反应液进行了如下处理：取小离心管，每只分别加入200µl反应液+400µl甲醇+400µl蒸馏水，摇匀5min后，然后离心5min，取下清液点板。
(2) 我们使用的是GF254硅胶板，每个板上除了点上反应组之外，还需点上阳性组，阴性组和GPC标准，点完后用吹风机吹干
D展开
展开剂：CH3OH:CH2Cl2:H2O 12:7:1
将点好的板放入展开剂中，注意展开剂不能没过板上的点。待展开剂爬到顶端，取出硅胶板吹干后放入碘缸染色15min,观察结果。
结果：该方法反应结果不太理想，我们尝试着用其他的方法 方法二（2015年3月至4月）：
A.底物的配制：10g卵磷脂：100ml水 B.乳化体系的构建
反应组：
2ml底物+30ml发酵液
阴性对照：2ml底物+未接菌种的发酵液
阳性对照：2ml底物+30ml水+200µl标准酶液 上述放55℃,250rpm摇床16h C.取样点板展开
这次我们使用的展开剂是氨水（5mol/l)和正丙醇，但是比例还需要调整，我们试验了以下比例：
氨水（5mol/l)：正丙醇=1:9 氨水（5mol/l)：正丙醇=3：7 氨水（5mol/l)：正丙醇=2:8 氨水（5mol/l)：正丙醇=7:13
经过试验发现比例为3:7的效果最好。
4.实验总结 4.1实验小结
本实验中我们共处理了8份土样（包括三块豆腐乳），分离纯化了167株细菌、44株放线菌、
32株真菌。第一步初筛得到了79株细菌、16株放线菌、8株真菌；第二步初筛得到了24株细菌、9株放线菌、8株真菌。通过对以上的41株菌株的复筛，最终确定菌株LE-1是我们所需要的菌株。下图中LE-1和对照的阳性菌产生了相同的点，而与之对应的阴性菌没有，我们可以初步判断LE_1是我们所需要的特殊磷脂酶产生菌。
4.2菌株LE-1生理生化研究
（1)下图是菌株LE-1的电镜图片，菌丝宽706nm，孢子直径为1.36µm。
菌株LE-1的电镜图片
（2）通过革兰氏染色以及甲基红实验、V-P实验可知菌株LE-1是革兰氏阳性菌
革兰氏染色
甲基红实验结果
V-P实验结果
5.实验中的困难与建议
本实验中最大的困难就是复筛方法的确定，开始我们使用的是微乳体系和组成为CH3OH:CH2Cl2:H2O 12:7:1的展开剂，实验结果并不理想。后来我们开始调整体系为乳化体系，展开剂为氨水（5mol/l)和正丙醇，但是二者的比例仍需我们试验摸索，最后确定氨水（5mol/l)：正丙醇=7:13时的效果最好。由于时间有限，方法还存在很多不足，仍然有许多不完善的的地方需要我们改进。
本实验所有的操作主要是在昇华楼613和620完成，由于菌株的保存需要使用到613的4℃冰箱。但是由于613冰箱老化严重，导致我们保存的菌株经常结冰而没法使用，严重影响到了我们的实验进程。在此向院领导建议，能够完善实验室的相关设施，给我们创新实验提供良好的工作条件。
6.经费使用情况