牛Gtl2基因cDNA序列分析及启动子预测

牛Gtl2基因cDNA序列分析及启动子预测

苏红，侯晓慧，李世杰

（河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071001）

摘要： 本研究利用RT-PCR和RACE方法克隆得到了牛Gtl2基因cDNA全序列。生物信息学分析表明：该序列有8个外显子，含有一个最长645 bp的开放读码框，但没有发现与Kozak规则相匹配的翻译起始序列。Gtl2基因在物种间具有保守性，尤其是第1个外显子表现出了较强的保守性。基因进化树分析表明，牛Gtl2基因与绵羊Gtl2基因的亲缘关系最近。使用启动子预测在线软件对牛Gtl2基因第一个外显子上游5000 bp的5′侧翼序列分析，得出了潜在的启动子区域，这些区域含有TATA，CAAT框和GC框，并存在一些转录因子结合位点，而且在5′侧翼区域发现有3个CpG岛。转录因子结合位点和CpG岛可能与牛Gtl2基因的转录及其表达调控有关。以上研究结果将为进一步分析该基因的生物学功能以及揭示其分子调控机制奠定了基础。 关键词： 牛Gtl2基因；生物信息学分析；启动子；转录因子结合位点 中国图书分类号： Q38，Q341 文献标识码： A

Sequencing analysis of bovine Gtl2 cDNA and promoter

prediction

SU Hong，HOU Xiao-hui，LI Shi-jie*

(College of Life Science，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China)

Abstract: In our study, we obtained the full length cDNA of bovine Gtl2 gene using the method of RT-PCR and RACE. The bioinformatic analysis revealed that 8 exons existed in the Gtl2 gene and the longest opening reading frame(ORF)of this gene is 645 bp. However, none of the ATGs is consistent with Kozak consensus sequence. Gtl2 gene is conserved among species, especially for exon 1. Phylogenetic tree analysis showed that the bovine Gtl2 gene shares the high identity to the sheep homology. Then we predicted the potential promoter with TATA-box, CAAT-box and GC box in 5′-Flanking sequence. The 5'-flanking region contained many potential transcriptional factor binding sites and three CpG islands which might have an important effect on transcription activation and expression regulation. These results are essential to analyze the biological function and the molecular regulation mechanism of bovine Gtl2 gene.

Key Words: bovine Gtl2 gene; bioinformatic analysis; promoter; transcription factor binding site

基因组印记（genomic imprinting）是指来自双亲的等位基因依赖亲本特异性而导致单等位基因表达的一种非孟德尔遗传现象[1]，具有这种现象的基因称为印记基因（imprinted gene）。父系等位基因不表达而母系等位基因表达的基因称为父源印记基因；如果只表达父收稿日期：

基金项目：国家自然科学基金(30972098)。

作者简介：苏红(1987-)，女，河北邢台人，在读硕士，研究方向：基因工程。E-mail:[email protected]。 通讯作者：李世杰(1971-)，女，河北承德人，博士，教授，硕士生导师，主要从事动物转基因克隆技术，动物分子遗传和基因工程药物等方面的研究。E-mail: [email protected]。

系等位基因，母系等位基因不表达的基因则称为母源印记基因。目前，在人和鼠中已经被鉴定的印记基因有100多个，此外，在牛、羊和猪等家畜中也相继发现了印记基因。哺乳动物印记基因大多数成簇存在，包含一个起顺式调控作用的DNA序列，称为印记控制中

[6]

心(imprintingcontrolregion，ICR) 或差异甲基化区域DMR（Differential methylated region）。大多数印记基因在调控胚胎发育和出生后的生长中起重要作用。

DLK1-DIO3印记区域在人和鼠中研究的比较多，定位于小鼠12号染色体、人14号染色体及绵羊的18号染色体上[4,7,8]，并且Dlk1-Dio3印记区域在这3种哺乳动物中高度保守。该印记域内的印记基因参与胚胎和胎盘的生长发育调控。研究表明鼠12号染色体末端父源基因双表达会导致胚胎/新生死亡以及生长过速，若12号染色体末端母源基因双表达会导致胚胎致死以及生长受阻。人14号染色体长臂上印迹基因的双表达所表现出的症状与鼠12号染色体末端印迹基因的双表达所表现出的症状相似

[9,10]

[2]

[3-5]

。

[11]

[12]

Gtl2 (gene trap locus2) 基因是位于DLK1-DIO3印记区域内一个母源表达的印记基因，其作用是作为一种RNA降解分子调控目的mRNA的转录。1996年，Schuster等人在基因捕获研究中得了Gtl2插入突变的转基因小鼠，并证实Gtl2为母源表达的非编码RNA[13]，并调控胚胎早期生长发育速度。2000年，Schmidt等人发现Gtl2与父源表达基因DLK1相互印记[7]。随后，Meg3，小鼠Gtl2的同源异型基因被定位于人14号染色体末端，且被证实为母系表达的印记非编码RNA。研究发现Meg3在人的很多组织中都表达，尤其是在脑组织中表达量高[14]。

目前，人、小鼠、羊和猪中的Gtl2基因cDNA序列已经被成功克隆，但牛Gtl2基因全序列的克隆还未见报道。为此，本研究采用RT-PCR与RACE方法克隆了牛Gtl2基因的cDNA全序列，运用生物信息学方法分析该基因的结构，并对Gtl2基因5'侧翼序列进行了启动子预测，以期为进一步揭示该基因的生物学功能以及研究其分子遗传机制奠定基础。

[8]

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物及样品采集 实验动物为当地屠宰场中待宰的成年正常荷斯坦奶牛，屠宰后，采集其肺脏组织样本，装入事先准备好的采样袋，立即投入液氮中，-70℃冰箱保存备用。 1.1.2 主要试剂 TRIzol试剂盒购自Invitrogen公司、反转录试剂盒及pMD18-T 载体购自

TM

TaKaRa公司、SMARTRACE试剂盒购自Clontech公司、UNIQ-10胶回收试剂盒购自上海Sangon公司。

1.2 牛Gtl2基因cDNA全序列的克隆

1.2.1 总RNA提取和cDNA的合成 利用TRIzol试剂盒提取牛肺脏组织总RNA，用无RNA酶的DNase-I去除可能的DNA污染，-70℃保存待用。利用反转录试剂盒进行cDNA的合成。 1.2.2 RT-PCR 以反转录生成的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，根据GenBank上公布的羊、人和鼠Gtl2基因保守序列，利用Oligo6. 0软件设计一对引物R1，L1（表1），进行PCR扩增获得目的片段。PCR反应程序为：94℃ 5 min, 以下运行35个循环：94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s，后续72℃延伸10 min。PCR产物回收后纯化、克隆至pMD18-T载体，进行测序。

TM

1.2.3 3′RACE和5′RACE RACE扩增按照SMARTRACE cDNA Amplification Kit说明操作。根据上述试验所获得的Gtl2部分序列分别设计3′RACE特异性引物3′GSP1、3′GSP2 和5′RACE 特异性引物5′GSP1、5′GSP2。3′RACE PCR扩增采用巢式PCR，以UPM和3′GSP1作为引物进行第一轮PCR，将第一轮PCR产物稀释5倍用引物NUP与3′GSP2进行第二轮PCR。反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 2 min，2个循环；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 2 min，2个循环；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，5个循环；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，25个循环；72℃ 7 min。5′RACE与3′RACE反应条件相同。RACE使用的引物序列见表1。PCR产物回收后纯化、克隆至pMD18-T载体，进行测序。

引物 Primer R1 L1 3′ GSP1 3′ GSP2 5′ GSP1 5′ GSP2

引物序列 (5' to 3') Primer sequence CACGCGAGAACCTCCCTA TCGGACCAACACTCACAACA GTGTTGAAACCAGTGCCCTAGTG GCACTGGCTAACCTCGGACTTTCG AAGGTGAGGAAGGAAGACAGCGA GGGGTGGACTGAGAAAGACTGAC

1.3 牛Gtl2基因全长的获得及其序列分析

根据已获得保守区片断的序列及3′RACE和5′RACE所得序列，进行序列拼接得到全长cDNA。应用NCBI程序、DNAMAN软件、UCSC(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start)和CpG Plot预测软件 (www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/)等对序列进行分析。 1.4 牛Gtl2基因启动子预测

将得到的牛Gtl2基因cDNA序列应用NCBI/Blast程序进行序列比对，得到其在牛基因组上的位置，确定第一个外显子在DNA上的定位，找出第一个外显子5′端上游5000 bp序列, 该序列包含着潜在的启动子序列。应用启动子在线分析软件对其进行启动子预测。启动子在线分析软件：

Promoter2.0：www.cbs.dtu.dk/services/promoter；

Neural Network Promoter Prediction：www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html； Promoter SCAN：http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/proscan； TFSEARCH：http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html。

2 结果与分析

2.1 牛Gtl2基因cDNA序列的克隆

利用所设计的一对引物R1和L1，扩增出一条653 bp的目的片段（图1）。根据已获得牛Gtl2部分序列设计RACE特异性引物，获得了长度为508 bp和533 bp的5′RACE产物（图2A）和1359 bp，1053 bp，786 bp，541 bp的3′RACE产物（图2B）。结果表明牛Gtl2基因存在可变剪切，所得的七个牛Gtl2 cDNA序列已提交至NCBI，登录号为HQ325845-HQ325851。通过已经获得的保守区序列与3′RACE、5′RACE 序列的拼接得到了基因的全长cDNA序列,全长为1730bp。

M. 100bp plus II DNA Ladder; 1. PCR扩增产物

图1 RT-PCR结果

Fig. 1 Results of RT-PCR amplification

M. 100bp DNA Ladder; A1. 5′RACE扩增产物; B1. 3′RACE扩增产物

图2 5′RACE和3′RACE结果

Fig. 2 Results of 5′RACE and 3′RACE amplif ication

2.2 牛Gtl2基因序列的生物信息学分析

应用NCBI/Blast程序进行序列比对，发现该序列位于牛21号染色体上，核苷酸的位置为nt683180-nt703642。利用UCSC在线软件分析也发现序列位于21号染色体上，且含有8个外显子。应用NCBI中的ORF finder程序进行开放阅读框(ORF)分析，发现该cDNA序列含有一个最长645 bp的ORF（图4），但没有发现与Kozak规则相匹配的翻译起始序列。利用CpG Plot 在线分析软件对牛Gtl2基因序列分析表明，该cDNA序列含有1个长266 bp的CpG岛，位于816 bp-1081 bp处。

图3 牛Gtl2基因开放阅读框的预测

Fig. 3 Putative open reading frames(ORFs) of bovine Gtl2 gene predicated by six frames at

NCBI.ORFs are represented by green boxs.

2.3 牛Gtl2基因序列的同源性比对及cDNA序列的遗传进化树分析

通过DNAMAN软件比对分析表明，牛Gtl2基因核酸序列与人(GenBank Accession no. AY314975)、羊(GenBank Accession no. AY0l7220)、鼠(GenBank Accession no. Y13832)和猪（GenBank Accession no. EF517525）序列分别有58.88%、84.91%、48.34%和67.49%的相似性。根据各个物种的Gtl2核苷酸序列构建了系统进化树（图5），结果表明，所获得的牛Gtl2基因与羊的亲缘关系最近。虽然Gtl2基因在牛、人和鼠三个物种中保守性不高，但Gtl2基因的第一个外显子在牛、人和鼠三个物种中有着很高的保守性（图6）。外显子1在人和牛中相似性为87.36%，鼠和牛的相似性为78.31%，人和鼠的相似性也达到了75%。

图4 几种物种Gtl2基因cDNA序列构建的系统进化树

Fig.4 Cladogram tree of the Gtl2 cDNA sequences of several species.

图5 牛、人和鼠三个物种Gtl2基因第一个外显子序列比对

Fig.5 Alignment of Gtl2 exon1 sequences between Bos,Homo and Mus.

2.4 牛

Gtl2基因启动子预测和转录因子结合位点分析

对牛Gtl2基因第一个外显子上游5000bp的5′侧翼序列进行Promoter2.0和Neural Network Promoter Prediction启动子在线软件分析，得出潜在的启动子结构(表2和表3)。采用Promoter SCAN启动子在线分析软件进行分析，将预测值1.0作为判断的cut-off值来预测Gtl2启动子，分析结果显示启动子区在正义链上的预测位置在4741-4991 bp，启动子分值85.79（启动子剪切值=53.000000）。启动子区在反义链上预测位置为4996-4746 bp，启动子分值103.12（启动子剪切值53.000 000），并且检测到如GCF、AP-2、CREB、ATF、T-Ag、CTF等共15种潜在的启动子转录因子结合位点（表4和表5）。使用TFSEARCH在线软件发现在4973-4978 bp和3698-3702 bp处存在TATA框；在4861-4864 bp和4898-4902 bp处发现存CAAT框；3751-3760 bp处发现GC框。CpG Plot在线分析软件预测发现CpG岛存在于3022-3378 bp, 3930-4205 bp, 4583-4842 bp处(表6)，CpG岛的存在会影响牛Gtl2基因启动子的转录。

表2 Promoter2.0在线软件对牛Gtl2基因启动子预测结果 Table 2 Promoter predictions of bovine Gtl2 gene with Promoter2.0

位置

分值

可能性

Position

1200

2700

3800 4600

Score 1.098 0.708 1.041

0.546

Likelihood 可能性较大的预测 临界预测 可能性较大的预测

临界预测

起点 Start 1672 2635 2833 3556 表3 Neural Network Promoter Prediction在线软件对牛Gtl2基因启动子预测结果

Table 3 Promoter predictions of bovine Gtl2 gene with Neural Network Promoter Prediction

终点 End 1722 2685 2883 3606 分值 Score 0.98 0.89 0.92 0.99 启动子序列

Promoter sequences

GAGCATGGTTTTAAATAAGGGAACACATTTACCCACGCCTGGAAGATGGC CCAGATGAGGAAATAGGGGCCCAGAGTGAAAGGCCTGGACAGCAGCCTCC GAGCCTGGAAAAAAAGCAGAGAGGCGGACTCTGCGCCGGGAGGCCCACCT AGCCCGCCTGTAAATGAGCCCCGTGCCCAAGGCTCGGTGTCTCGTTCGAT

转录因子名称

Name

GCF GCF T-Ag JCV_repeated_seque

正/负链 Strand + - + -

位置 Location 4744 4745 4746 4749 4830 4881 4896 4897 4899 4903 4940 4941 4941 4941 4941 4941 4942 4943 4943 4945 4946 4946 4947 4948 4948 4948 4948 4948 4949 4973 4979 长度 Weight 2.361000 2.284000 1.086000 1.091000 1.658000 1.086000 2.717000 1.948000 1.216000 1.448000 8.603000 1.157000 3.442000 8.603000 3.886000 3.721000 1.912000 1.201000 1.564000 1.147000 1.138000 1.201000 2.549000 3.721000 1.591000 4.589000 8.603000 3.331000 10.324000 2.618000 1.108000

AP-2 - T-Ag + junB-US2 + NFI + UCE.2 CTF beta-pol_CS ATF

- - + +

CREB + CREB + CREB + ATF E4F1 ATF/CREB ATF/CREB E4F1 ATF ATF

+ + + - - - -

CREB +

CREB -

CREB -

CREB - CREB - CREB - beta-pol_CS

-

TFIID + AP-2 +

转录因子名称名称

Name

T-Ag JCV_repeated_sequePuF AP-2 beta-pol_CS CREB CREB CREB ATF ATF CREB E4F1 ATF/CREB CREB ATF/CREB E4F1 CREB ATF CREB CREB CREB

正/反义链 Strand - - - + - - - - - - - - - + + + + + + + +

位置 Locati4996 4986 4986 4979 4949 4948 4948 4948 4948 4948 4947 4946 4946 4944 4943 4943 4942 4941 4941 4941 4941

长度 Weight 1.086001.427001.082001.091008.603003.886008.603003.442001.157003.721001.912001.201001.564001.147001.138001.201002.549003.721003.331008.603004.58900

表6牛Gtl2基因5′-侧翼区的CpG岛的碱基长度及所在位置

Table 6 Size of CpG isalnd and its location in bovine Gtl2 5′-flanking region

CpG岛 CpG island

1

2

3

长度(bp) Length(bp) 357

276 260

起止 Location 3022-3378 3930-4205 4583-4842

3 结论与讨论

利用生物信息学软件对目标基因进行核酸和蛋白序列分析，可为基因的功能研究提供许多线索。在本项研究中首先获得牛Gtl2基因cDNA序列全长，并发现牛Gtl2基因存在可变剪切。据研究报道，Gtl2基因在人、鼠、绵羊和猪中也有多种可变剪切体，而且这些可变剪切体在各个组织的表达也不同[13,15,16]，但是这些可变剪切体的具体生物学功能目前还不清楚。此外，利用生物信息学方法将克隆得到的牛Gtl2 cDNA全长进行序列分析发现，该基因含有很多ORFs，但没有发现与Kozak相匹配的翻译起始序列，说明牛Gtl2基因可能是一个非编码

[13]

的RNA基因，这和Schuster-Gossler等人的研究结果一致。序列比对发现牛Gtl2基因和人、鼠、绵羊有较高的同源性，表明Gtl2基因在各物种之间比较保守，也提示Gtl2基因在各物种中可能有相似的生物学功能。

基因启动子特异的DNA序列与特定的转录因子的相互作用，决定下游基因表达的时间、空间和数量等特性，也是基因表达调控的重要组成部分。本研究通过对牛Gtl2基因5′侧翼序列分析，得到了潜在的启动子区，而且预测的5′侧翼序列含有TATA框，CAAT框和GC框。

[17]

利用在线软件预测牛Gtl2基因启动子区包含多种转录因子结合位点，这些转录因子结合位点对基因转录调控起着关键的作用。如CREB作为一种重要的核转录因子, 括调节基因的转录、生理节奏、细胞的发育与生存、成瘾性和抑郁以及学习记忆等。胞外信号通路通过影响CREB

[18]

的磷酸化来激活有关的靶基因转录。AP-2因子哺乳动物基因转录化的必需因子，能通过与其他蛋白的相互作用调控其下游基因的转录活性[19]，与哺乳动物的发育、细胞生长、分化、凋亡和肿瘤发生有密切联系。ATF是一种参与许多腺病毒E1A和cAMP诱导的启动子转录调节的细胞转录因子[20]。GCF则是与GC盒结合的一种负调控蛋白[21]。此外，牛Gtl2基因5′侧翼序列中含有三个CpG岛，CpG岛的甲基化能够直接抑制基因转录，通过抑制特定的转录

[22]

因子结合，间接地抑制染色质活性。

本试验首次得到了牛Gtl2基因cDNA全序列，并对第一个外显子上游5000bp的5′侧翼序列进行了启动子和转录因子结合位点的预测，为进一步详细研究牛Gtl2的核心启动子，调控区中的各种顺式作用元件和与之发生相互作用的反式作用因子以及阐明牛Gtl2基因的表达调控机制奠定了基础。但预测的这些转录因子结合位点及其作用机制还需进一步试验加以验证，对其是否影响牛Gtl2基因的调控及如何影响调控，仍需更深入的研究。

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牛Gtl2基因cDNA序列分析及启动子预测

苏红，侯晓慧，李世杰

（河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071001）

摘要： 本研究利用RT-PCR和RACE方法克隆得到了牛Gtl2基因cDNA全序列。生物信息学分析表明：该序列有8个外显子，含有一个最长645 bp的开放读码框，但没有发现与Kozak规则相匹配的翻译起始序列。Gtl2基因在物种间具有保守性，尤其是第1个外显子表现出了较强的保守性。基因进化树分析表明，牛Gtl2基因与绵羊Gtl2基因的亲缘关系最近。使用启动子预测在线软件对牛Gtl2基因第一个外显子上游5000 bp的5′侧翼序列分析，得出了潜在的启动子区域，这些区域含有TATA，CAAT框和GC框，并存在一些转录因子结合位点，而且在5′侧翼区域发现有3个CpG岛。转录因子结合位点和CpG岛可能与牛Gtl2基因的转录及其表达调控有关。以上研究结果将为进一步分析该基因的生物学功能以及揭示其分子调控机制奠定了基础。 关键词： 牛Gtl2基因；生物信息学分析；启动子；转录因子结合位点 中国图书分类号： Q38，Q341 文献标识码： A

Sequencing analysis of bovine Gtl2 cDNA and promoter

prediction

SU Hong，HOU Xiao-hui，LI Shi-jie*

(College of Life Science，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China)

Abstract: In our study, we obtained the full length cDNA of bovine Gtl2 gene using the method of RT-PCR and RACE. The bioinformatic analysis revealed that 8 exons existed in the Gtl2 gene and the longest opening reading frame(ORF)of this gene is 645 bp. However, none of the ATGs is consistent with Kozak consensus sequence. Gtl2 gene is conserved among species, especially for exon 1. Phylogenetic tree analysis showed that the bovine Gtl2 gene shares the high identity to the sheep homology. Then we predicted the potential promoter with TATA-box, CAAT-box and GC box in 5′-Flanking sequence. The 5'-flanking region contained many potential transcriptional factor binding sites and three CpG islands which might have an important effect on transcription activation and expression regulation. These results are essential to analyze the biological function and the molecular regulation mechanism of bovine Gtl2 gene.

Key Words: bovine Gtl2 gene; bioinformatic analysis; promoter; transcription factor binding site

基因组印记（genomic imprinting）是指来自双亲的等位基因依赖亲本特异性而导致单等位基因表达的一种非孟德尔遗传现象[1]，具有这种现象的基因称为印记基因（imprinted gene）。父系等位基因不表达而母系等位基因表达的基因称为父源印记基因；如果只表达父收稿日期：

基金项目：国家自然科学基金(30972098)。

作者简介：苏红(1987-)，女，河北邢台人，在读硕士，研究方向：基因工程。E-mail:[email protected]。 通讯作者：李世杰(1971-)，女，河北承德人，博士，教授，硕士生导师，主要从事动物转基因克隆技术，动物分子遗传和基因工程药物等方面的研究。E-mail: [email protected]。

系等位基因，母系等位基因不表达的基因则称为母源印记基因。目前，在人和鼠中已经被鉴定的印记基因有100多个，此外，在牛、羊和猪等家畜中也相继发现了印记基因。哺乳动物印记基因大多数成簇存在，包含一个起顺式调控作用的DNA序列，称为印记控制中

[6]

心(imprintingcontrolregion，ICR) 或差异甲基化区域DMR（Differential methylated region）。大多数印记基因在调控胚胎发育和出生后的生长中起重要作用。

DLK1-DIO3印记区域在人和鼠中研究的比较多，定位于小鼠12号染色体、人14号染色体及绵羊的18号染色体上[4,7,8]，并且Dlk1-Dio3印记区域在这3种哺乳动物中高度保守。该印记域内的印记基因参与胚胎和胎盘的生长发育调控。研究表明鼠12号染色体末端父源基因双表达会导致胚胎/新生死亡以及生长过速，若12号染色体末端母源基因双表达会导致胚胎致死以及生长受阻。人14号染色体长臂上印迹基因的双表达所表现出的症状与鼠12号染色体末端印迹基因的双表达所表现出的症状相似

[9,10]

[2]

[3-5]

。

[11]

[12]

Gtl2 (gene trap locus2) 基因是位于DLK1-DIO3印记区域内一个母源表达的印记基因，其作用是作为一种RNA降解分子调控目的mRNA的转录。1996年，Schuster等人在基因捕获研究中得了Gtl2插入突变的转基因小鼠，并证实Gtl2为母源表达的非编码RNA[13]，并调控胚胎早期生长发育速度。2000年，Schmidt等人发现Gtl2与父源表达基因DLK1相互印记[7]。随后，Meg3，小鼠Gtl2的同源异型基因被定位于人14号染色体末端，且被证实为母系表达的印记非编码RNA。研究发现Meg3在人的很多组织中都表达，尤其是在脑组织中表达量高[14]。

目前，人、小鼠、羊和猪中的Gtl2基因cDNA序列已经被成功克隆，但牛Gtl2基因全序列的克隆还未见报道。为此，本研究采用RT-PCR与RACE方法克隆了牛Gtl2基因的cDNA全序列，运用生物信息学方法分析该基因的结构，并对Gtl2基因5'侧翼序列进行了启动子预测，以期为进一步揭示该基因的生物学功能以及研究其分子遗传机制奠定基础。

[8]

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物及样品采集 实验动物为当地屠宰场中待宰的成年正常荷斯坦奶牛，屠宰后，采集其肺脏组织样本，装入事先准备好的采样袋，立即投入液氮中，-70℃冰箱保存备用。 1.1.2 主要试剂 TRIzol试剂盒购自Invitrogen公司、反转录试剂盒及pMD18-T 载体购自

TM

TaKaRa公司、SMARTRACE试剂盒购自Clontech公司、UNIQ-10胶回收试剂盒购自上海Sangon公司。

1.2 牛Gtl2基因cDNA全序列的克隆

1.2.1 总RNA提取和cDNA的合成 利用TRIzol试剂盒提取牛肺脏组织总RNA，用无RNA酶的DNase-I去除可能的DNA污染，-70℃保存待用。利用反转录试剂盒进行cDNA的合成。 1.2.2 RT-PCR 以反转录生成的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，根据GenBank上公布的羊、人和鼠Gtl2基因保守序列，利用Oligo6. 0软件设计一对引物R1，L1（表1），进行PCR扩增获得目的片段。PCR反应程序为：94℃ 5 min, 以下运行35个循环：94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s，后续72℃延伸10 min。PCR产物回收后纯化、克隆至pMD18-T载体，进行测序。

TM

1.2.3 3′RACE和5′RACE RACE扩增按照SMARTRACE cDNA Amplification Kit说明操作。根据上述试验所获得的Gtl2部分序列分别设计3′RACE特异性引物3′GSP1、3′GSP2 和5′RACE 特异性引物5′GSP1、5′GSP2。3′RACE PCR扩增采用巢式PCR，以UPM和3′GSP1作为引物进行第一轮PCR，将第一轮PCR产物稀释5倍用引物NUP与3′GSP2进行第二轮PCR。反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 2 min，2个循环；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 2 min，2个循环；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，5个循环；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，25个循环；72℃ 7 min。5′RACE与3′RACE反应条件相同。RACE使用的引物序列见表1。PCR产物回收后纯化、克隆至pMD18-T载体，进行测序。

引物 Primer R1 L1 3′ GSP1 3′ GSP2 5′ GSP1 5′ GSP2

引物序列 (5' to 3') Primer sequence CACGCGAGAACCTCCCTA TCGGACCAACACTCACAACA GTGTTGAAACCAGTGCCCTAGTG GCACTGGCTAACCTCGGACTTTCG AAGGTGAGGAAGGAAGACAGCGA GGGGTGGACTGAGAAAGACTGAC

1.3 牛Gtl2基因全长的获得及其序列分析

根据已获得保守区片断的序列及3′RACE和5′RACE所得序列，进行序列拼接得到全长cDNA。应用NCBI程序、DNAMAN软件、UCSC(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start)和CpG Plot预测软件 (www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot/)等对序列进行分析。 1.4 牛Gtl2基因启动子预测

将得到的牛Gtl2基因cDNA序列应用NCBI/Blast程序进行序列比对，得到其在牛基因组上的位置，确定第一个外显子在DNA上的定位，找出第一个外显子5′端上游5000 bp序列, 该序列包含着潜在的启动子序列。应用启动子在线分析软件对其进行启动子预测。启动子在线分析软件：

Promoter2.0：www.cbs.dtu.dk/services/promoter；

Neural Network Promoter Prediction：www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html； Promoter SCAN：http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/proscan； TFSEARCH：http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html。

2 结果与分析

2.1 牛Gtl2基因cDNA序列的克隆

利用所设计的一对引物R1和L1，扩增出一条653 bp的目的片段（图1）。根据已获得牛Gtl2部分序列设计RACE特异性引物，获得了长度为508 bp和533 bp的5′RACE产物（图2A）和1359 bp，1053 bp，786 bp，541 bp的3′RACE产物（图2B）。结果表明牛Gtl2基因存在可变剪切，所得的七个牛Gtl2 cDNA序列已提交至NCBI，登录号为HQ325845-HQ325851。通过已经获得的保守区序列与3′RACE、5′RACE 序列的拼接得到了基因的全长cDNA序列,全长为1730bp。

M. 100bp plus II DNA Ladder; 1. PCR扩增产物

图1 RT-PCR结果

Fig. 1 Results of RT-PCR amplification

M. 100bp DNA Ladder; A1. 5′RACE扩增产物; B1. 3′RACE扩增产物

图2 5′RACE和3′RACE结果

Fig. 2 Results of 5′RACE and 3′RACE amplif ication

2.2 牛Gtl2基因序列的生物信息学分析

应用NCBI/Blast程序进行序列比对，发现该序列位于牛21号染色体上，核苷酸的位置为nt683180-nt703642。利用UCSC在线软件分析也发现序列位于21号染色体上，且含有8个外显子。应用NCBI中的ORF finder程序进行开放阅读框(ORF)分析，发现该cDNA序列含有一个最长645 bp的ORF（图4），但没有发现与Kozak规则相匹配的翻译起始序列。利用CpG Plot 在线分析软件对牛Gtl2基因序列分析表明，该cDNA序列含有1个长266 bp的CpG岛，位于816 bp-1081 bp处。

图3 牛Gtl2基因开放阅读框的预测

Fig. 3 Putative open reading frames(ORFs) of bovine Gtl2 gene predicated by six frames at

NCBI.ORFs are represented by green boxs.

2.3 牛Gtl2基因序列的同源性比对及cDNA序列的遗传进化树分析

通过DNAMAN软件比对分析表明，牛Gtl2基因核酸序列与人(GenBank Accession no. AY314975)、羊(GenBank Accession no. AY0l7220)、鼠(GenBank Accession no. Y13832)和猪（GenBank Accession no. EF517525）序列分别有58.88%、84.91%、48.34%和67.49%的相似性。根据各个物种的Gtl2核苷酸序列构建了系统进化树（图5），结果表明，所获得的牛Gtl2基因与羊的亲缘关系最近。虽然Gtl2基因在牛、人和鼠三个物种中保守性不高，但Gtl2基因的第一个外显子在牛、人和鼠三个物种中有着很高的保守性（图6）。外显子1在人和牛中相似性为87.36%，鼠和牛的相似性为78.31%，人和鼠的相似性也达到了75%。

图4 几种物种Gtl2基因cDNA序列构建的系统进化树

Fig.4 Cladogram tree of the Gtl2 cDNA sequences of several species.

图5 牛、人和鼠三个物种Gtl2基因第一个外显子序列比对

Fig.5 Alignment of Gtl2 exon1 sequences between Bos,Homo and Mus.

2.4 牛

Gtl2基因启动子预测和转录因子结合位点分析

对牛Gtl2基因第一个外显子上游5000bp的5′侧翼序列进行Promoter2.0和Neural Network Promoter Prediction启动子在线软件分析，得出潜在的启动子结构(表2和表3)。采用Promoter SCAN启动子在线分析软件进行分析，将预测值1.0作为判断的cut-off值来预测Gtl2启动子，分析结果显示启动子区在正义链上的预测位置在4741-4991 bp，启动子分值85.79（启动子剪切值=53.000000）。启动子区在反义链上预测位置为4996-4746 bp，启动子分值103.12（启动子剪切值53.000 000），并且检测到如GCF、AP-2、CREB、ATF、T-Ag、CTF等共15种潜在的启动子转录因子结合位点（表4和表5）。使用TFSEARCH在线软件发现在4973-4978 bp和3698-3702 bp处存在TATA框；在4861-4864 bp和4898-4902 bp处发现存CAAT框；3751-3760 bp处发现GC框。CpG Plot在线分析软件预测发现CpG岛存在于3022-3378 bp, 3930-4205 bp, 4583-4842 bp处(表6)，CpG岛的存在会影响牛Gtl2基因启动子的转录。

表2 Promoter2.0在线软件对牛Gtl2基因启动子预测结果 Table 2 Promoter predictions of bovine Gtl2 gene with Promoter2.0

位置

分值

可能性

Position

1200

2700

3800 4600

Score 1.098 0.708 1.041

0.546

Likelihood 可能性较大的预测 临界预测 可能性较大的预测

临界预测

起点 Start 1672 2635 2833 3556 表3 Neural Network Promoter Prediction在线软件对牛Gtl2基因启动子预测结果

Table 3 Promoter predictions of bovine Gtl2 gene with Neural Network Promoter Prediction

终点 End 1722 2685 2883 3606 分值 Score 0.98 0.89 0.92 0.99 启动子序列

Promoter sequences

GAGCATGGTTTTAAATAAGGGAACACATTTACCCACGCCTGGAAGATGGC CCAGATGAGGAAATAGGGGCCCAGAGTGAAAGGCCTGGACAGCAGCCTCC GAGCCTGGAAAAAAAGCAGAGAGGCGGACTCTGCGCCGGGAGGCCCACCT AGCCCGCCTGTAAATGAGCCCCGTGCCCAAGGCTCGGTGTCTCGTTCGAT

转录因子名称

Name

GCF GCF T-Ag JCV_repeated_seque

正/负链 Strand + - + -

位置 Location 4744 4745 4746 4749 4830 4881 4896 4897 4899 4903 4940 4941 4941 4941 4941 4941 4942 4943 4943 4945 4946 4946 4947 4948 4948 4948 4948 4948 4949 4973 4979 长度 Weight 2.361000 2.284000 1.086000 1.091000 1.658000 1.086000 2.717000 1.948000 1.216000 1.448000 8.603000 1.157000 3.442000 8.603000 3.886000 3.721000 1.912000 1.201000 1.564000 1.147000 1.138000 1.201000 2.549000 3.721000 1.591000 4.589000 8.603000 3.331000 10.324000 2.618000 1.108000

AP-2 - T-Ag + junB-US2 + NFI + UCE.2 CTF beta-pol_CS ATF

- - + +

CREB + CREB + CREB + ATF E4F1 ATF/CREB ATF/CREB E4F1 ATF ATF

+ + + - - - -

CREB +

CREB -

CREB -

CREB - CREB - CREB - beta-pol_CS

-

TFIID + AP-2 +

转录因子名称名称

Name

T-Ag JCV_repeated_sequePuF AP-2 beta-pol_CS CREB CREB CREB ATF ATF CREB E4F1 ATF/CREB CREB ATF/CREB E4F1 CREB ATF CREB CREB CREB

正/反义链 Strand - - - + - - - - - - - - - + + + + + + + +

位置 Locati4996 4986 4986 4979 4949 4948 4948 4948 4948 4948 4947 4946 4946 4944 4943 4943 4942 4941 4941 4941 4941

长度 Weight 1.086001.427001.082001.091008.603003.886008.603003.442001.157003.721001.912001.201001.564001.147001.138001.201002.549003.721003.331008.603004.58900

表6牛Gtl2基因5′-侧翼区的CpG岛的碱基长度及所在位置

Table 6 Size of CpG isalnd and its location in bovine Gtl2 5′-flanking region

CpG岛 CpG island

1

2

3

长度(bp) Length(bp) 357

276 260

起止 Location 3022-3378 3930-4205 4583-4842

3 结论与讨论

利用生物信息学软件对目标基因进行核酸和蛋白序列分析，可为基因的功能研究提供许多线索。在本项研究中首先获得牛Gtl2基因cDNA序列全长，并发现牛Gtl2基因存在可变剪切。据研究报道，Gtl2基因在人、鼠、绵羊和猪中也有多种可变剪切体，而且这些可变剪切体在各个组织的表达也不同[13,15,16]，但是这些可变剪切体的具体生物学功能目前还不清楚。此外，利用生物信息学方法将克隆得到的牛Gtl2 cDNA全长进行序列分析发现，该基因含有很多ORFs，但没有发现与Kozak相匹配的翻译起始序列，说明牛Gtl2基因可能是一个非编码

[13]

的RNA基因，这和Schuster-Gossler等人的研究结果一致。序列比对发现牛Gtl2基因和人、鼠、绵羊有较高的同源性，表明Gtl2基因在各物种之间比较保守，也提示Gtl2基因在各物种中可能有相似的生物学功能。

基因启动子特异的DNA序列与特定的转录因子的相互作用，决定下游基因表达的时间、空间和数量等特性，也是基因表达调控的重要组成部分。本研究通过对牛Gtl2基因5′侧翼序列分析，得到了潜在的启动子区，而且预测的5′侧翼序列含有TATA框，CAAT框和GC框。

[17]

利用在线软件预测牛Gtl2基因启动子区包含多种转录因子结合位点，这些转录因子结合位点对基因转录调控起着关键的作用。如CREB作为一种重要的核转录因子, 括调节基因的转录、生理节奏、细胞的发育与生存、成瘾性和抑郁以及学习记忆等。胞外信号通路通过影响CREB

[18]

的磷酸化来激活有关的靶基因转录。AP-2因子哺乳动物基因转录化的必需因子，能通过与其他蛋白的相互作用调控其下游基因的转录活性[19]，与哺乳动物的发育、细胞生长、分化、凋亡和肿瘤发生有密切联系。ATF是一种参与许多腺病毒E1A和cAMP诱导的启动子转录调节的细胞转录因子[20]。GCF则是与GC盒结合的一种负调控蛋白[21]。此外，牛Gtl2基因5′侧翼序列中含有三个CpG岛，CpG岛的甲基化能够直接抑制基因转录，通过抑制特定的转录

[22]

因子结合，间接地抑制染色质活性。

本试验首次得到了牛Gtl2基因cDNA全序列，并对第一个外显子上游5000bp的5′侧翼序列进行了启动子和转录因子结合位点的预测，为进一步详细研究牛Gtl2的核心启动子，调控区中的各种顺式作用元件和与之发生相互作用的反式作用因子以及阐明牛Gtl2基因的表达调控机制奠定了基础。但预测的这些转录因子结合位点及其作用机制还需进一步试验加以验证，对其是否影响牛Gtl2基因的调控及如何影响调控，仍需更深入的研究。

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